專利名稱：：蟲草素提取物和在制備降血糖藥物或保健食品中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物制藥
技術領域：
，具體涉及具有藥用價值的真菌提取物，尤其涉及一種蟲草素提取物和在制備降血糖藥物或保健食品中的應用。
背景技術：
：蟲草素(3'-脫氧腺苷)是從蛹蟲草中提純出的一種晶體，是一種新型的核苷類抗菌素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，已引起全球科技發(fā)達國家的高度重視。它對枯草桿菌和念珠菌菌株均有抑制作用；對HIV-I得逆轉錄酶也有抑制作用；尤其對多種惡性腫瘤有很強的抑制作用。因此，將蟲草素作為一種用途廣泛的新藥來開發(fā)是必然的趨勢。蟲草素主要有化學合成制得和蛹蟲草中提取純化兩種來源，常見的是從蛹蟲草固體培養(yǎng)子座或蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲體和培養(yǎng)液中提取純化而得。常見的蟲草素提取純化方法有離子樹脂吸附法、活性炭吸附法和超臨界萃取技術，然而這些方法的提取純化效果并不太理想，如離子樹脂吸附法分離純化的蟲草素較少，提取率較低，活性炭吸附法吸附選擇性差，得率低，超臨界萃取提取方法所需設備復雜，需要的成本也比較高。目前雖然有研究表明蛹蟲草具有降血糖降血脂的作用，但該作用并不是蟲草素賦予的，目前尚未見有蟲草素具有降血糖作用的相關報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種提取方法簡單、成本低、提取純化效果好，且具有降血糖作用的蟲草素提取物。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述蟲草素提取物在制備降血糖藥物或保健食品中的應用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現的—種蟲草素提取物，該提取物是采用大孔樹脂D-101從蛹蟲草液體培養(yǎng)液中提取純化而得，該提取物經檢測，其中主要包含蟲草素、蛋白質和糖，且蟲草素的含量能夠達到提取物總質量的60%以上。上述蟲草素提取物，是先將蛹蟲草液體培養(yǎng)液進行預處理后獲得的上柱液上樣大孔樹脂D-101，調節(jié)上柱液的pH為9.0，以40mL/h的流速進樣，當進樣量達到568mL時，樹脂達到完全飽和。此時，飽和動態(tài)吸附量為O.183mg/g，然后采用體積百分比濃度為55X的乙醇作為洗脫劑，進行洗脫，收集洗脫液，濃縮冷凍干燥后得到所需蟲草素提取物，該蟲草素提取物經高效液相色譜法測定含蟲草素61.55%，經考馬斯亮蘭法測定含蛋白質11.15%，經苯酚硫酸法測定含總糖8.51%。上述蛹蟲草液體培養(yǎng)液進行預處理，其操作是先將蛹蟲草液體培養(yǎng)液進行適量的濃縮，得到濃縮液，然后用無水乙醇沉淀濃縮液中的多糖與蛋白，最后離心去除雜質，收集上清液即可作為上樣樣品。3上述蛹蟲草液體培養(yǎng)液進行預處理操作中，濃縮是將蛹蟲草液體培養(yǎng)液濃縮至原體積的1/5，濃縮溫度為60°C。上述蛹蟲草液體培養(yǎng)液進行預處理操作中，采用占濃縮液4倍體積的無水乙醇沉淀多糖與蛋白24小時；上述大孔樹脂D-101在使用前，先進行預處理將樹脂用蒸餾水充分淋洗，除去破碎和粒度極小的樹脂；用80%的乙醇溶液浸泡過夜，去掉殘留在樹脂中的溶劑，并活化樹脂；再分別用4%氫氧化鈉溶液和4%鹽酸溶液順序浸泡35h，以除去樹脂中的雜質，最后用蒸餾水反復沖洗至中性。本發(fā)明對上述制備所得蟲草素提取物進行降血糖功效測試，首先對四氧嘧啶實驗性糖尿病小鼠進行腹腔注射蟲草素，然后觀察小鼠空腹血糖值、口服葡萄糖耐量(0GTT)、臟器指數、體重、攝食量和飲水量等指標的變化，結果表明，劑量為72mg/kgd蟲草素提取物能使高血糖模型小鼠的空腹血糖值下降46.67%(P<0.01)，口服葡萄糖耐量試驗中的血糖AUC下降25.12%(P<0.01)，腎指數增加23.75%(P<0.05)，脾指數增加26.65%(P<0.05)，體重增加9.14%(P<0.05)，日攝食量減少25.05%(P<0.01)，日飲水量減少21.49%(P<0.01)，由此說明，蟲草素具有良好的降血糖作用，改善糖尿病的多飲多食癥狀，而且對腎臟與脾具有保護作用，從而克客服了現有降血糖藥物對腎臟脾臟傷害較大的問題，可作為生產蟲草素單體、降血糖藥物與降血糖保健食品開發(fā)的原料。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的蟲草素提取物，其制備方法選擇大孔樹脂D-lOl的吸附處理，并對吸附處理過程中的參數進行優(yōu)化選擇，與現有方法相比，不但操作簡單，工藝條件易控制，而且蟲草素提取純度高；2.本發(fā)明的蟲草素提取物來源于蛹蟲草液體培養(yǎng)液，具有對人體無毒害的優(yōu)點，而且純化過程中沒有加入任何有害成分，對人體無毒害；3.本發(fā)明的蟲草素提取物溶解性好，具有良好的降血糖作用。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1蟲草素提取物的制備及參數優(yōu)化本實施例的蟲草素提取物，其制備方法包括如下步驟首先選擇常規(guī)方法培養(yǎng)所得蛹蟲草液體培養(yǎng)液作為原料，將蛹蟲草液體培養(yǎng)液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮成原體積1/5，濃縮溫度為6(TC;用4倍體積無水乙醇沉淀多糖24小時；低速大容量離心機分離沉淀，收集上清液作為上柱樣品，其中蟲草素的濃度為16.09iig/mL。分別選擇不同的大孔吸附樹脂S-8、NKA-9，D-101和AB-8進行吸附與解吸。結果發(fā)現D-lOl大孔樹脂的靜態(tài)吸附量最高，為O.117mg/g，其次是AB-8，為0.108mg/g，極性的NKA-9吸附效果最差，為0.080mg/g，非極性的D-101對蟲草素的吸附能力最強。30%的乙醇溶液對大孔樹脂D-101的解吸效果最好，為60.20%，其次是AB-8，為57.07%，NKA-9最差，為46.93%。鑒于D-101對蟲草素的吸附與解吸效果較好，因此，采用D-101大孔樹脂進行蟲草素的純化。大孔樹脂D-101預處理將樹脂用蒸餾水充分淋洗，除去破碎和粒度極小的樹脂；用80%的乙醇溶液浸泡過夜，去掉殘留在樹脂中的溶劑，并活化樹脂；再分別用4%氫氧化鈉溶液和4%鹽酸溶液順序浸泡35h，以除去樹脂中的雜質，最后用蒸餾水反復沖洗至中性。大孔樹脂D-101吸附處理蟲草素(1)進樣速度對大孔樹脂D-101吸附處理蟲草素的影響比較當流出液體積達到345mL時，進樣速度分別為20、40、60和80mL/h的未吸附率分別為17.64%、22.24%、33.15%和40.82%，其中，進樣速度為20mL/h的吸附率是最高的，但是考慮到流速過小，實驗時間延長，生產效率低。所以，本實施例選擇使用40mL/h為最佳流速；(2)上柱樣品pH對大孔樹脂D-101吸附處理蟲草素的影響比較當流出液體積達到388mL時，上柱樣品的pH分別為5.0、7.0、9.0和11.0時的未吸附率分別為53.91%、48.38%、44.26%和40.86%，從數據可以看出，上柱樣品的pH越高越有利于蟲草素的吸附，考慮到pH值過高會影響大孔樹脂的壽命，所以，本實施例選用上柱樣品的pH為9.0。根據上面的參數優(yōu)化結果，本實施例的大孔樹脂D-101吸附處理蟲草素前，先調節(jié)上柱樣品的pH為9.0，并以40mL/h的流速進樣，認為達到吸附飽和，結果表明，當進樣量達到568mL時，樹脂達到完全飽和，此時，飽和動態(tài)吸附量為0.183mg/g。上樣后，先采用150mlpH9.0的超純水過柱去除雜質后，再依次用體積百分比濃度為15%、35%、55%、75%和95%的乙醇各60mL作為洗脫劑進行梯度洗脫；通過對洗脫液中的含量測定，發(fā)現洗脫下來的蟲草素81.47%集中在55%乙醇洗脫液中，17.15%集中在35%乙醇洗脫液中，把各組分濃縮，冷凍干燥，測得35%、55%、75%和95%的乙醇洗脫液純度分別為5.38%、37.78%、1.05%和1.20%，因此本實施例選擇55%乙醇溶液作為優(yōu)選的洗脫劑，收集55%乙醇洗脫液，反復分離純化后得到蟲草素提取物，該蟲草素精品經高效液相色譜法測定含蟲草素61.55%，經考馬斯亮蘭法測定含蛋白質11.15%，經苯酚硫酸法測定含多糖8.51%。實施例2(1)昆明種SPF小鼠20士2g，適應性喂養(yǎng)三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取靜脈血測血糖，取血前禁食8h。選取血糖濃度大于11.lmmo1/1的作為高血糖模型動物。(2)取高血糖模型小鼠分為高血糖模型對照組，陽性藥物對照組和蟲草素提取物高劑量治療組，每組12只。取12只正常小鼠作為空白對照組。蟲草素提取物高劑量治療組腹腔注射實施例1制備的蟲草素提取物72mg/kgd，陽性藥物對照組腹腔注射鹽酸苯乙雙胍70g/kgd，高血糖模型對照組和空白對照組每天腹腔注射相應體積的生理鹽水。(3)實驗周期為21天，實驗期間各組小鼠自由飲食，隔周測定空腹血糖含量，實驗結束時進行口服葡萄糖耐量測試，測定肝糖原含量、臟器指數。實施例3(1)昆明種SPF小鼠20士2g，適應性喂養(yǎng)三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取靜脈血測血糖，取血前禁食8h。選取血糖濃度大于11.lmmo1/1的作為高血糖模型動物。(2)取高血糖模型小鼠分為高血糖模型對照組，陽性藥物對照組和蟲草素提取物5中劑量治療組，每組12只。取12只正常小鼠作為空白對照組。蟲草素提取物中劑量治療組腹腔注射實施例1制備的蟲草素提取物24mg/kgd，陽性藥物對照組腹腔注射鹽酸苯乙雙胍70g/kgd，高血糖模型對照組和空白對照組每天腹腔注射相應體積的生理鹽水。(3)實驗周期為21天，實驗期間各組小鼠自由飲食，隔周測定空腹血糖含量，實驗結束時進行口服葡萄糖耐量測試，測定肝糖原含量、臟器指數。實施例4(1)昆明種SPF小鼠20±2g，適應性喂養(yǎng)三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取靜脈血測血糖，取血前禁食8h。選取血糖濃度大于11.lmmol/L的作為高血糖模型動物。(2)取高血糖模型小鼠分為高血糖模型對照組，陽性藥物對照組和蟲草素提取物低劑量治療組，每組12只。取12只正常小鼠作為空白對照組。蟲草素提取物低劑量治療組腹腔注射實施例1制備的蟲草素提取物8mg/kg*d，陽性藥物對照組腹腔注射鹽酸苯乙雙胍70g/kgd，高血糖模型對照組和空白對照組每天腹腔注射相應體積的生理鹽水。(3)實驗周期為21天，實驗期間各組小鼠自由飲食，隔周測定空腹血糖含量，實驗結束時進行口服葡萄糖耐量測試，測定肝糖原含量、臟器指數。實施例24的實驗數據如表1和表2所示。表1蟲草素對糖尿病小鼠空腹血糖的影響G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1中，與模型組相比，*:P<0.05，**:P<0.01.從表1可見，本發(fā)明得到的蟲草素提取物對小鼠具有良好的降血糖作用。蟲草素提取物72mg/kgd、24mg/kgd、8mg/kgd治療組小鼠的空腹血糖21天后，分別下降了46.67%(P<0.01)、32.84%(P<0.05)和18.36%。三個蟲草素提取物治療組小鼠的血糖與陽性對照組小鼠的血糖比較，差異不顯著，這說明蟲草素提取物降血糖作用良好，一定劑量的蟲草素降糖效果與陽性對照{鹽酸苯乙雙胍(降糖靈M的效果相當，蟲草素高劑量組的降糖效果甚至優(yōu)于鹽酸苯乙雙胍。表2蟲草素提取物對小鼠口服葡萄糖耐量的影響G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2中，與模型組相比，*:P<0.05，**:P<0.01.從表2可見，本發(fā)明得到的蟲草素提取物能推遲小鼠口服葡萄糖后血糖升高時間及改善糖耐量能力，口服葡萄糖后，蟲草素提取物高劑量組與陽性對照組小鼠的血糖值在lh時才升至最高水平，其他各組小鼠的血糖值均在O.5h時就升到最高水平。與模型對照組相比，蟲草素提取物高、中、低劑量組的血糖AUC分別下降了25.12%(P<0.01)、20.64%(P<0.05)、10.47%。蟲草素提取物高劑量組與陽性對照組的血糖AUC之間的無顯著性差異，這表示高劑量蟲草素提取物的效果與鹽酸苯乙雙胍接近。本發(fā)明得到的蟲草素提取物還能提高小鼠腎指數和脾指數。與高血糖模型對照組相比，高、中、低劑量蟲草素提取物能使小鼠的腎指數分別增加23.75%(P<0.05)、23.07%(P<0.05)和13.15%，脾指數分別增加26.65%(P<0.05)、17.18%和5.28%。蟲草素對小鼠的腎臟與脾具有保護作用。本發(fā)明得到的蟲草素提取物高、中、低劑量組小鼠的體重與高血糖模型組比較，分別增加了9.14%(P<0.05)、11.24%(P<0.05)和4.6%。蟲草素能顯著改善糖尿病小鼠的多飲多食癥狀，蟲草素提取物高、中、低劑量組小鼠的日攝食量分別減少了25.05%(P<0.01)、15.57%(P<0.01)和14.18%(P<0.01)，日飲水量分別減少21.49%(P<0.01)、12.84%(P<0.01)和8.32%(P<0.01)。權利要求一種蟲草素提取物，其特征在于該蟲草素提取物是將蛹蟲草液體培養(yǎng)液上樣大孔樹脂D-101，洗脫劑采用體積百分比為55％的乙醇，從而制備得到蟲草素提取物。2.根據權利要求1所述蟲草素提取物，其特征在于所述蛹蟲草液體培養(yǎng)液上樣大孔樹脂D-101時，上樣液的pH為9.0，以40mL/h的流速進樣。3.根據權利要求1所述蟲草素提取物，其特征在于所述蛹蟲草液體培養(yǎng)液上樣前先進行預處理，其步驟為先將蛹蟲草液體培養(yǎng)液濃縮成原體積的1/5，得到濃縮液，濃縮溫度為60°C，然后用4倍體積無水乙醇沉淀濃縮液中的多糖24小時，最后離心處理，收集上清液作為上樣液。4.權利要求1所述蟲草素提取物在制備降血糖藥物或保健食品中的應用。5.根據權利要求4所述應用，其特征在于所述蟲草素提取物在制備降血糖藥物或保健食品時，其使用劑量為72mg/kgd。全文摘要本發(fā)明公開一種蟲草素提取物和在制備降血糖藥物或保健食品中的應用，該蟲草素提取物是將蛹蟲草液體培養(yǎng)液上樣大孔樹脂D-101，洗脫劑采用體積百分比為55％的乙醇，從而制備得到。本發(fā)明的蟲草素提取物，其制備方法選擇大孔樹脂D-101吸附處理，并對吸附處理過程中的參數進行優(yōu)化選擇，與現有方法相比，不但操作簡單，工藝條件易控制，而且蟲草素提取純度高。本發(fā)明的蟲草素提取物來源于蛹蟲草液體培養(yǎng)液，具有對人體無毒害的優(yōu)點，而且純化過程中沒有加入任何有害成分，對人體無毒害。本發(fā)明的蟲草素提取物溶解性好，具有良好的降血糖作用。文檔編號A23L1/29GK101716196SQ20091019439公開日2010年6月2日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權日2009年12月4日發(fā)明者張松,杜梅申請人:華南師范大學