專利名稱：人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人B淋巴細(xì)胞刺激因子和增殖誘導(dǎo)配體阻 斷劑BCMA-Fc及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis, RA)和干燥綜合征(Sjogren syndrome, SS)是嚴(yán)重的自身免疫性 疾病，嚴(yán)重危害人類健康和生命。至今，這類疾病尚無特效治療藥物；臨床治療中，一般采用 糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑對癥治療，但，治療實(shí)踐表明療效差，副作用大。研究表明，該類疾病的發(fā)病機(jī)理主要是由于B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)與增殖誘 導(dǎo)配體過度表達(dá)(增殖誘導(dǎo)配體)，通過與其受體結(jié)合，使自反應(yīng)性B細(xì)胞發(fā)生凋亡逃避，自 反應(yīng)性B細(xì)胞增殖，產(chǎn)生大量的自身抗體，發(fā)生組織損害，抗原抗體復(fù)合物的積聚會導(dǎo)致狼 瘡性腎炎并發(fā)癥。此外B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)與增殖誘導(dǎo)配體過度表達(dá)，刺激B淋巴 細(xì)胞過度增殖、分化，參與免疫應(yīng)答。因此，有關(guān)研究人員推測，阻斷BLys與其受體結(jié)合可 能形成治療SLE、RA和SS的特效創(chuàng)新性藥物。隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展，近年來計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)成為研究與開發(fā)新藥的 嶄新技術(shù)，它大大加快了新藥設(shè)計(jì)的速度和效率。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不斷解析，PDB數(shù)據(jù)不斷增 長，為計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)藥物成為可能?；诘鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)藥物研究倍受重視。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，具備真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，蛋白質(zhì)可以正確 折疊，AOX強(qiáng)效啟動子，外源基因基因產(chǎn)物表達(dá)量高。酵母培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化，高密度發(fā)酵等操作簡 單。另外，畢赤酵母可以分泌性表達(dá)，便于產(chǎn)物純化。甲醇作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本低，適于工 業(yè)化生產(chǎn)。目前畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑，尤其涉及人B淋巴細(xì)胞刺激因 子和增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑BCMA-Fc設(shè)計(jì)及其制備方法。本發(fā)明基于蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象，根據(jù)BCMA和增殖誘導(dǎo)配體的作用結(jié)構(gòu)域，通過 計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)分子模擬技術(shù)，以增殖誘導(dǎo)配體為靶蛋白，以BCMA為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過優(yōu)化得 到與增殖誘導(dǎo)配體具有高親和力的BCMA-Fc融合蛋白；畢赤酵母表達(dá)上述融合蛋白，所得 融合蛋白具有增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合能力，并能有效抑制增殖誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的RajiB淋巴細(xì)胞 瘤增殖。本發(fā)明的人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑同時具備免疫原性低，制備過程簡便、安全，產(chǎn)品 得率、純度、活性高等特性。具體而言，本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)模擬構(gòu)建BCMA-FC蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，通過分子 對接預(yù)測BCMA-Fc具備增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合能力。構(gòu)建PPIC9K酵母表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化畢赤酵 母后，通過營養(yǎng)缺陷和G418抗性兩步篩選，獲得高表達(dá)轉(zhuǎn)化子，使用畢赤酵母表達(dá)BCMA-Fc融合蛋白，經(jīng)過超濾濃縮，分子篩和rProteinA親和層析，得到BCMA-Fc融合蛋白，具有序列 1的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率為10mg/L，經(jīng)活性檢測證實(shí)BCMA-Fc具備配體增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合能力，同分 子對接的結(jié)果一致。本發(fā)明所述的BCMA-Fc在體內(nèi)作為欺騙受體可以抑制增殖誘導(dǎo)配體的 生物活性，有望成為治療自身免疫性疾病的特效藥物。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，其包括如下方法和步驟1)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑BCMA-Fc蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB數(shù)據(jù)庫下載ID :1XU2和ID :2DTQ，得到BCMA，增殖誘導(dǎo)配體 和IgGlFc結(jié)構(gòu)。使用Biopolymer構(gòu)建BCMA-Fc融合蛋白，BCMA胞外段與IgGlFc段之間 使用Gla-Ser連接，通過能量優(yōu)化，得到能量最小化的BCMA-Fc結(jié)構(gòu)，使用superimpose與 BCMA胞外段進(jìn)行比對。IgGlFc段的融合不干擾BCMA與配體增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合。2)BCMA胞外段基因與IgGlFc段基因融合3) BCMA-Fc的畢赤酵母表達(dá)本發(fā)明所述的BCMA-Fc不限于特定的表達(dá)系統(tǒng)，包括真核表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系 統(tǒng)。4) BCMA-Fc 的純化畢赤酵母上清，通過S^hacyl S-100凝膠過濾，收集洗脫峰。凝膠過濾洗脫峰上 樣于rProteinA-S印harose FF (經(jīng)0. 02M PB (pH 7. 0)緩沖液平衡)，離子交換柱用0. 02M PB (pH 8. 0)洗脫雜蛋白，然后用0. IM Glycine-HCl (pH3. 0)緩沖液洗脫，收集洗脫峰。冷凍 干燥rProteinA親和層析洗脫峰收集液，凍干粉于低溫保存待用。5) BCMA-Fc 活性測定。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述阻斷劑在治療自身免疫性疾病治療應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)活性檢測證實(shí)，所述的BCMA-Fc具備配體增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合能力，同分 子對接的結(jié)果一致。本發(fā)明所述的BCMA-Fc在體內(nèi)作為欺騙受體可以抑制增殖誘導(dǎo)配體的 生物活性，可進(jìn)一步制備治療自身免疫性疾病的特效藥物。


圖1，是BCMA-Fc蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖2，是BCMA-Fc表達(dá)純化圖。圖3，是BCMA-Fc活性測定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1BCMA-Fc蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB數(shù)據(jù)庫下載ID :1XU2和ID :2DTQ，得到BCMA，增殖誘導(dǎo)配體 和IgGlFc結(jié)構(gòu)。使用InsightII軟件Biopolymer模塊構(gòu)建BCMA-Fc融合蛋白，BCMA胞外 段與IgGlFc段之間使用Gla-Ser連接，通過能量優(yōu)化，得到能量最小化的BCMA-Fc結(jié)構(gòu)，使 用superimpose與BCMA胞外段進(jìn)行比對。BCMA胞外段基因與IgGlFc段基因融合使用Overlap PCR進(jìn)行BCMA胞外段與IgGlFc段融合。
BCMA-F 5' -ATAGAATTCTCAACCCGGAGACAGG EcoR IBCMA-R 5' -CGGTGGGCATGTGGATCCTTAATTCGTTCCTTTCACIgGlFc-F :5，-GAAAGGAACGAATTAAGGATCCACATGCCCACCGTGIgGlFc-R :5，-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACCCGGAGACAG Not I1)使用BCMA-F和BCMA-R擴(kuò)增BCMA胞外段后膠回收。2)使用 IgGlFc-F 和 IgGlFc-R 擴(kuò)增 IgGlFc 后膠回收。3)使用BCMA-F和IgGlFc-R引物以1，2擴(kuò)增的BCMA和IgGlFc為模板擴(kuò)增得到 BCMA-FcBCMA-Fc 的表達(dá)將畢赤酵母(購買自美國Invitregin公司)誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-BCMA_Fc轉(zhuǎn)化 GS115菌株(GS115菌株，pPIC9K質(zhì)粒購買自美國Invitregin公司)，采用電穿孔法轉(zhuǎn)化， 0. 2cm規(guī)格的電轉(zhuǎn)化杯，電壓1500V，場強(qiáng)7500V/cm，脈沖時間10ms，篩選His+轉(zhuǎn)化子。用 G418篩選在GS115的AOXl基因位點(diǎn)發(fā)生多拷貝交換重組的轉(zhuǎn)化克隆。劃YPD平板備用并 制備甘油菌保存。從上述YPD平板上挑取表達(dá)菌株接種于BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)約24小時后，測 OD600 = 0. 2-0. 6，離心，收集菌體，換BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用甲醇作為碳源誘導(dǎo)表達(dá)72_96h。 離心后收集上清。BCMA-Fc 的純化凝膠過濾層析Sephacryl S-100 層析柱(IOXlOOcm)用 0. 02M pH 7. 4PB 緩沖液平衡。畢赤酵母 表達(dá)上清上樣于凝膠層析柱，0. 02M pH7. 4PB緩沖液洗脫，流速5ml/min。分部收集洗脫峰， 15 % SDS-PAGE鑒定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。rProteinA 親禾口層析rProteinA-Sepharose FF 層析柱(IX 5cm)先后用 10 倍柱床體積 0. 02M pH 7. OPB緩沖液平衡。樣品lml/min上樣后0.02M pH 7. OPB緩沖液平衡洗至基線，0. IM Glycine-HCl (pH3. 0)緩沖液洗脫，收集洗脫峰。SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并以 Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白濃度。純化后的目的蛋白分裝，冷凍抽干。BCMA-Fc生物活性的測定分別以GST pulldown、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)測定。GSTpu11down1)100 μ IGSHBeads (載有GST-增殖誘導(dǎo)配體融合蛋白，同前制備)重懸。2)加入 100 μ 150ng/y IBCMA-Fc 約 5μ g，4°C混勻過夜。50 μ 1 空 GSHBeads，50 μ IGSHBeads (載有 GST)，分別加入 50 μ IBCMA-Fc 作為對照。3)用100倍體積預(yù)冷PBS洗凈上述Beads。4)各取 10 μ 1 上述 Beads,電泳，BCMA 抗體 Western Blot 檢測。CCK-8細(xì)胞增殖測定1)制備細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)。懸浮細(xì)胞密度為10000/ml。2)加入96孔板，每孔內(nèi)加入增殖誘導(dǎo)配體終濃度為200ng/ml，同時加入BCMA-Fc 濃度為 200ng/ml，400ng/ml，600ng/ml，800ng/ml，1000ng/ml，等體積培養(yǎng)基作為對照，每一濃度做三個復(fù)孔，加入藥物后37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3)培養(yǎng)24小時后加入10 μ 1CCK-8。4)培養(yǎng)5小時。5)測定450nm吸光度?；钚詸z測的結(jié)果表明，使用畢赤酵母表達(dá)的BCMA-Fc具有增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合活性，并可以抑制增殖誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的RajiB淋巴瘤細(xì)胞增殖，可進(jìn)一步制備治療自身免疫 性疾病的藥物。SEQUENCE LISTING
<110>復(fù)旦大學(xué)
<120>人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑BCMA-Fc設(shè)計(jì)及其制備方法和應(yīng)用
<130>11
<160>5
<170>PatentIn version3.
<210>1
<211>277
<212>PRT
<213>人類
<400>1
Met Leu GlnMetAlaGlyGlnCysSerGlnAsnGluTyrPheAspSer
151015
Leu Leu HisAlaCyslieProCysGlnLeuArgCysSerSerAsnThr
202530
Pro Pro LeuThrCysGlnArgTyrCysAsnAlaSerValThrAsnSer
354045
Val Lys GlyThrAsnGlySerThrCysProProCysProAlaProGlu
505560
Leu Leu GlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp
65707580
Thr Leu MetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp
859095
Val Ser HisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly
100105110
Val Glu ValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn
115120125
Ser Thr TyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp
130135140
Leu Asn GlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuPro
1451501551600089]Ala Pro IleGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu0090]1651701750091]Pro Gln ValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsn0092]1801851900093]Gln Val SerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplie0094]1952002050095]Ala Val GluTrpGluSerAsnGlnGlnProGluAsnAsnTyrLysThr0096]2102152200097]Thr Pro ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys0098]2252302352400099]Leu Thr ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys0100]2452502550101]Ser Val MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu0102]2602652700103]Ser Leu SerProGly0104]2750105]<210>20106]<211>250107]<212>PRT0108]<213>人類0109]<400>20110]Ala Thr AlaGlyAlaAlaThrThrCysThrCysAlaAlaCysCysCys0111]1510150112]Gly Gly AlaGlyAlaCysAlaGlyGly0113]20250114]<210>30115]<211>360116]<212>PRT0117]<213>人類0118]<400>30119]Cys Gly GlyThrGlyGlyGlyCysAlaThrGlyThrGlyGlyAlaThr0120]1510150121]Cys Cys ThrThrAlaAlaThrThrCysGlyThrThrCysCysThrThr0122]2025300123]Thr Cys AlaCys0124]350125]<210>40126]<211>360127]<212>PRT
<213>人類
<400>4
Gly Ala AlaAlaGlyGly Ala AlaCys GlyAlaAla ThrThrAla
151015
Gly Gly AlaThrCysCys Ala CysAla ThrGlyCys CysCysAla
202530
Cys Gly ThrGly
35
<210>5
<211>31
<212>PRT
<213>人類
<400>5
Ala Thr AlaGlyThrThr Thr AlaGly CysGlyGly CysCysGly
151015
Thr Cys AlaAlaCysCys Cys GlyGly AlaGlyAla CysAlaGly
202530
權(quán)利要求
1.一種人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑，其特征在于，其包括BCMA-Fc融合蛋白。
2.按權(quán)利要求1所述的人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑，其特征在于，所述的BCMA-Fc融合蛋白 具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
3.—種表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，其包括真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。
4.按權(quán)利要求3所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述的表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母。
5.權(quán)利要求1所述的人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑的制備方法，其特征在于，通過計(jì)算機(jī)蛋 白質(zhì)分子模擬技術(shù)，以增殖誘導(dǎo)配體為靶蛋白，以BCMA為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，經(jīng)優(yōu)化得到與增殖誘 導(dǎo)配體具有高親和力的BCMA-Fc融合蛋白，包括如下方法和步驟1)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑BCMA-Fc；2)BCMA胞外段基因與IgGlFc段基因融合；3)BCMA-Fc 表達(dá)；4)BCMA-Fc 純化；5)BCMA-Fc活性測定。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟1)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)增殖誘導(dǎo) 配體阻斷劑BCMA-Fc是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB數(shù)據(jù)庫下載ID :1XU2和ID :2DTQ，得到 BCMA，增殖誘導(dǎo)配體和IgGlFc結(jié)構(gòu)；使用Biopolymer構(gòu)建BCMA-Fc融合蛋白，BCMA胞外段 與IgGlFc段之間用Gla-Ser連接，通過能量優(yōu)化，得到能量最小化的BCMA-Fc結(jié)構(gòu)；使用 superimpose與BCMA胞外段進(jìn)行比對。
7.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的BCMA-Fc表達(dá)系畢赤酵母表達(dá)。
8.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟4)的BCMA-Fc純化通過下述步驟 畢赤酵母上清，通過S^hacyl S-100凝膠過濾，收集洗脫峰，上樣rProteinA-Sepharose FF，離子交換柱用0. 02M PB pH 8. O洗脫雜蛋白，然后用0. IM Glycine-HCl pH3. O緩沖液洗脫，收集洗脫峰；冷凍干燥rProteinA親和層析洗脫峰收集 液，凍干粉于低溫保存待用。
9.一種治療自身免疫性疾病的藥物，其特征在于含有有效劑量的權(quán)利要求2所述的融 合蛋白，以及可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人增殖誘導(dǎo)配體阻斷劑BCMA-Fc設(shè)計(jì)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明基于蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象，根據(jù)BCMA和增殖誘導(dǎo)配體的作用結(jié)構(gòu)域，通過計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)分子模擬技術(shù)，以增殖誘導(dǎo)配體為靶蛋白，以BCMA為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過優(yōu)化得到與增殖誘導(dǎo)配體具有高親和力的BCMA-Fc融合蛋白；畢赤酵母表達(dá)上述融合蛋白，所得融合蛋白具有增殖誘導(dǎo)配體結(jié)合能力，并能有效抑制增殖誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的Raj iB淋巴細(xì)胞瘤增殖。同時具備免疫原性低，制備過程簡便、安全，產(chǎn)品得率、純度、活性高等特性。可進(jìn)一步制備治療自身免疫性疾病的新藥。
文檔編號C12N15/81GK101993497SQ20091019442
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者于敏, 喻三見, 宋后燕, 莫煒 申請人:復(fù)旦大學(xué)