專利名稱：一種天藍淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種天藍淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變菌及 其制備方法。
背景技術(shù)：
柔紅霉素(Daunorubicin，DNR)及以其為原料合成的阿霉素(Do xorubicin)、 表阿霉素(Epirubidn)是臨床上重要的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，作為一線的抗腫瘤藥物， 主要用于多種實體瘤和急性白血病的治療。工業(yè)上多采用微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)柔紅 霉素。目前柔紅霉素的生物合成途徑已研究的較為清楚，并據(jù)此得出柔紅霉素生物合成 基因簇的結(jié)構(gòu)和功能分布圖。人們已經(jīng)廣泛的對這些基因的結(jié)構(gòu)和功能進行分析和改 造，以期進一步提高柔紅霉素的產(chǎn)生菌的產(chǎn)量。胡鶴、尚珂、胡又佳等(天藍淡紅鏈霉 菌SIPI-1482的dauW基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].中國生物工程雜志，2007， 27(12) 26-30.)從國內(nèi)柔紅霉素生產(chǎn)菌天藍淡紅鏈霉菌基因組中克隆得到了 drrB與 dnrX之間的一段序列，將該新基因命名為dauW并提交GenBank(登錄號EF523565)，通 過序列分析及比對，并嘗試其在大腸桿菌中的表達，初步考察了 dauW基因與柔紅霉素抗 性之間的關(guān)系。但是如何利用dauW基因提高柔紅霉素產(chǎn)量尚未可知。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的天藍淡紅鏈霉菌柔紅霉素產(chǎn)量 低的不足，提供一種天藍淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法，該天藍淡紅鏈霉 菌的基因阻斷突變菌的柔紅霉素產(chǎn)量得到較大提高。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種天藍淡紅鏈霉菌 (Streptomycescoeruleorabidus)的基因阻斷突變菌，被阻斷的基因是dauW基因。本發(fā)明中，所述的天藍淡紅鏈霉菌(Streptomycescoeraleorabidus)較佳的是天藍 淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorabidus) SIPI-1482。所述的dauW基因較佳的被外源基
因插入而阻斷。所述的外源基因較佳的是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，更佳的是大腸桿 菌_鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKCl 139。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種制備如上所述的任一 天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeraleorubidus)的基因阻斷突變菌的方法，包括以下步 驟1)將dauW基因克隆入載體，獲得含有dauW基因的重組表達載體；2)將含有dauW基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化子；3)將天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeraleorubidus)作為受體，與步驟2)所述 的轉(zhuǎn)化子進行接合轉(zhuǎn)移，獲得接合子，即天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因阻斷突變菌。本發(fā)明中，步驟1)所述的載體較佳的是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒PKC1139。 步驟2)所述的宿主細胞較佳的是大腸桿菌，更佳的是大腸桿菌ET12567。步驟3)所述的受體較佳 的是天藍淡紅鏈霉菌孢子，孢子預萌發(fā)后作為受體，孢子預萌發(fā)一般可用25 65時間為5 20分鐘，更佳的為50°C熱激10分鐘。所述的天藍淡紅鏈霉菌較佳的 是天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是一種制備柔紅霉素的方 法，包括培養(yǎng)產(chǎn)柔紅霉素的天藍淡紅鏈霉菌的基因工程菌，從培養(yǎng)物中分離柔紅霉素， 其中，所述的產(chǎn)柔紅霉素的天藍淡紅鏈霉菌的基因工程菌是如上所述的任一天藍淡紅鏈 霉菌的基因阻斷突變菌。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明通過同源重組交換來阻斷天 藍淡紅鏈霉菌中的dauW基因，考察其功能并研究其對柔紅霉素產(chǎn)量的影響。通過基因工 程手段提高天藍淡紅鏈霉菌的柔紅霉素產(chǎn)量的方案已經(jīng)出現(xiàn)很多，本發(fā)明首次將天藍淡 紅鏈霉菌中的dauW基因阻斷，發(fā)現(xiàn)dauW基因被阻斷后，天藍淡紅鏈霉菌的柔紅霉素的 產(chǎn)量獲得了極大的提高，達到5倍之多，比針對其他一些基因的阻斷效果要好得多。比 如針對dnrX，dnrH等均只能提高3倍。可見，對dauW的阻斷，大幅度提高了柔紅霉 素的發(fā)酵單位。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是PCR擴增dauW部分基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。M DL2000 ； 1 H2O為 模板；2 SIPI-1482基因組為模板。圖2是質(zhì)粒pYG770的及酶切驗證和PCR驗證。A.酶切驗證。M λ DNA/ HindIII+DL2000 ； 1: pYG766/EcoRI ； 2 pYG766/BamHI+HindIII。B.PCR驗證。M: DL2000 ； 1 H2O為模板；2 SIPI-1482基因組為模板；3 pYG770為模板。圖3是質(zhì)粒pYG770的構(gòu)建過程示意圖。圖4是同源重組示意圖。圖5是突變株的PCR驗證。M: DL2000 ； 1: H2O為模板；2: SIPI-1482基因 組DNA為模板；3 pYG770質(zhì)粒為模板；4 770-1基因組DNA為模板；5 770-2基 因組DNA為模板。圖6是出發(fā)菌和突變株W2發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖。A SIPI-1482 ； B 突變株
W2 ； C 柔紅霉素標準品。圖7是重組子不同子代間產(chǎn)柔紅霉素能力的比較。圖8是突變株的PCR驗證。M DL2000 ； 1 H2O為模板；3 pYG770質(zhì)粒 為模板；4 W2-F5基因組DNA為模板；5 W2-F10基因組DNA為模板。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未 注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例 中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。實施例1 dauW部分基因片段擴增
菌種柔紅霉素產(chǎn)生菌天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorabidus) SIPI-1482,可從上海醫(yī)藥工業(yè)研究院取得。培養(yǎng)基YMB液體培養(yǎng)基，YEME液體培養(yǎng)基(霍普伍德鏈霉菌遺傳操作實驗 手冊[M]，第一版，長沙湖南科學技術(shù)出版社，1988)。主要溶液及緩沖液TSE，TEL(霍普伍德鏈霉菌遺傳操作實驗手冊[M]，第一 版，長沙湖南科學技術(shù)出版社，1988)，飽和酚/氯仿。方法提取天藍淡紅鏈霉菌基因組DNA將新鮮的斜面孢子接種于裝有20ml YMB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在 30°C、230r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)約48h。以10% (ν/ν)接種量將上述液體種子接入裝有 20ml YEME液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在30°C、220r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)約48h。將 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，離心收集菌絲體(Hitachi CR21G，轉(zhuǎn)子R20A2，10,OOOr/ min, IOmin),經(jīng)過適當體積的無菌水洗滌后離心棄去上清。在離心管中加入5ml含 5mg/ml溶菌酶的TSE溶液，旋渦振蕩分散菌體后置于37°C水浴保溫至溶液變粘稠。加入 50 μ 120mg/ml 的蛋白酶 K 和 250 μ 1 10% (w/v) SDS 到終濃度分別為 200 μ g/ml 和 0.5% (w/v),在55°C水浴中保溫30min，其間每隔IOmin混合一次。在室溫下冷卻后加入等 體積飽和酚/氯仿(TNE)抽提二次，使得兩相界面之間基本無雜質(zhì)，然后再用氯仿抽提 一次。加入等體積的異丙醇，用封嘴的無菌滴管在界面處緩慢攪動，將DNA纏繞在滴 管上，并用70% (ν/ν)冰冷乙醇溶液洗滌，在室溫下干燥。用500 μ 1的TEL溶液溶解 DNA。DNA樣品分裝在Eppendorf管中后在_20°C保存。 根據(jù)dauW序列(Genbank登錄號EF523565)，以其中部分片段設計一對分 別添加了 Hindlll、BamHI酶切位點的引物，引物序列和性質(zhì)如表1。理論上將擴增出 1022bp的片段。表1.擴增dauW部分基因的引物序列及性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種天藍淡紅鏈霉菌Streptomyces coeruleorubidus的基因阻斷突變菌，其特征在 于，被阻斷的基因是dauW基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的天藍淡紅鏈霉菌 Streptomyces coeruleorubidus 是天藍淡紅鏈霉菌 Streptomycescoeruleorubidus SIPI-1482。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的dauW基因被外源基 因插入而阻斷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的外源基因是大腸桿 菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的大腸桿菌-鏈霉菌穿 梭質(zhì)粒是PKC1139。
6.一種制備如權(quán)利要求1 5任一項所述的天藍淡紅鏈霉菌 Streptomycescoeruleorubidus的基因阻斷突變菌的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將dauW基因克隆入載體，獲得含有dauW基因的重組表達載體；2)將含有dauW基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化子；3)將天藍淡紅鏈霉菌Streptomycescoeruleorubidus作為受體，與步驟2)所述的轉(zhuǎn)化 子進行接合轉(zhuǎn)移，獲得接合子，即天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因阻斷突變菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的載體是大腸桿菌_鏈霉 菌穿梭質(zhì)粒pKC 1139。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的宿主細胞是大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的受體是天藍淡紅鏈霉菌 孢子，孢子預萌發(fā)后作為受體，預萌發(fā)條件為50°C熱激10分鐘。
10.一種制備柔紅霉素的方法，包括培養(yǎng)產(chǎn)柔紅霉素的天藍淡紅鏈霉菌的基因工程 菌，從培養(yǎng)物中分離柔紅霉素，其特征在于，所述的產(chǎn)柔紅霉素的天藍淡紅鏈霉菌的基 因工程菌是權(quán)利要求1 5任一項所述的天藍淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的基因阻斷突變菌及其制備方法。該天藍淡紅鏈霉菌的基因阻斷突變菌，被阻斷的基因是dauW基因。本發(fā)明通過同源重組交換來阻斷天藍淡紅鏈霉菌中的dauW基因，發(fā)現(xiàn)dauW基因被阻斷后，天藍淡紅鏈霉菌的柔紅霉素的產(chǎn)量獲得了極大的提高，達到5倍之多，比針對其他一些基因的阻斷效果要好得多。比如針對dnrX，dnrH等均只能提高3倍?？梢姡瑢auW的阻斷，大幅度提高了柔紅霉素的發(fā)酵單位。
文檔編號C12R1/465GK102010846SQ20091019511
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者朱寶泉, 朱春寶, 殷承慧, 胡又佳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院