專利名稱：雁陣式定域隨機(jī)突變方法及其在單抗分子進(jìn)化技術(shù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種隨機(jī)突變方法及其在單克隆抗體分子進(jìn) 化技術(shù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(一 )治療性單抗自1986年第一個(gè)治療性單抗藥物誕生以來(lái)，治療性單抗的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)獲得巨大 的成功，這可以從以下幾個(gè)方面的數(shù)據(jù)得到闡明。產(chǎn)品數(shù)量在急劇增加。在美國(guó)，已有近30個(gè)治療性單抗類被批準(zhǔn)上市，已經(jīng)進(jìn)入 臨床研究的，目前進(jìn)入臨床研究的單抗共有123件，其中23件已進(jìn)入III期臨床或新藥申 報(bào)階段；新的進(jìn)入臨床研究的治療性單抗藥物還在快速增加。正在開發(fā)的產(chǎn)品有700多個(gè)， 其中240多個(gè)在不同國(guó)家進(jìn)入臨床。單抗類藥物已經(jīng)占據(jù)正在研發(fā)的基因工程藥物的30% 以上。市場(chǎng)規(guī)模在迅速擴(kuò)大。從市場(chǎng)情況來(lái)看，根據(jù)過(guò)去二十年的情況來(lái)看，治療性單抗藥 物每年的實(shí)際銷售增長(zhǎng)都明顯超出了預(yù)期。據(jù)DataMonitor 2008年的數(shù)據(jù)，早在2003年， 治療性單抗已經(jīng)形成了 72億美元的銷售。2006年的銷售達(dá)到195億美元，2007年為263億 美元，預(yù)計(jì)2008年的銷售規(guī)模將達(dá)到350億美元以上，年增長(zhǎng)率高達(dá)22. 88%。至今已出現(xiàn) 12個(gè)重磅炸彈級(jí)的產(chǎn)品。其中，Enbrel, Humira, Rituxan等6個(gè)產(chǎn)品年銷售超過(guò)了 45億 美元。DataMonitor預(yù)計(jì)，2013年，治療性單抗市場(chǎng)容量超過(guò)500億美元，并會(huì)新出現(xiàn)10到 12個(gè)重磅炸彈級(jí)的單抗藥物，使單抗藥物達(dá)到一個(gè)新的高峰。由此可見，無(wú)論是從產(chǎn)品研發(fā) 趨勢(shì)或是從市場(chǎng)角度，治療性單抗都保持了高強(qiáng)度的超預(yù)期增長(zhǎng)，并且這種趨勢(shì)仍將持續(xù)。 預(yù)計(jì)，2008-2010年上市的產(chǎn)品中還有若干會(huì)有過(guò)5億美元的銷售。臨床指征已全面覆蓋。從臨床指征上看，在早期，治療性單抗主要針對(duì)各種惡性腫 瘤和自身免疫疾病。經(jīng)過(guò)二十幾年的發(fā)展，單抗類藥物的臨床指征已經(jīng)覆蓋了各種惡性腫 瘤、自身免疫、心血管疾病、感染性疾病等各種重要疾病，其療效突出，副作用小的特點(diǎn)使其 占據(jù)了不可取代的地位。特別是在惡性腫瘤和疑難雜癥的治療方面，單抗藥物顯示了前所 未有的光明前景，已經(jīng)開創(chuàng)了基因工程藥物研究的新時(shí)代。特別值得指出的是，近幾年單抗藥物在治療老年性疾病，例如帕金森病和阿茲海 默癥方面也獲得突破性進(jìn)展，引起了業(yè)內(nèi)極大的關(guān)注。至今，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)上市或進(jìn)入臨床的品種多為進(jìn)口(13種)或仿制品(15種)，國(guó) 內(nèi)機(jī)構(gòu)創(chuàng)新的只有7種(上市4種，在臨床3種)，均屬落后的鼠源或嵌合單抗，缺乏競(jìng)爭(zhēng) 力。至今沒(méi)有出現(xiàn)國(guó)內(nèi)原創(chuàng)的重量級(jí)產(chǎn)品(上海技術(shù)預(yù)見報(bào)告-生物技術(shù)研究報(bào)告，2008 年6月)。由于知識(shí)產(chǎn)權(quán)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，仿制已無(wú)出路，開發(fā)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新型單 抗藥物是必然趨勢(shì)(上海預(yù)見報(bào)告)。( 二)、獲得候選單抗的方法當(dāng)前，國(guó)際上主要有4種創(chuàng)新型單抗的研發(fā)平臺(tái)，即①鼠源或以鼠源為基礎(chǔ)的改造(嵌合和人源化)、②以CAT為代表的全人抗體庫(kù)技術(shù)、③人源化小鼠和④單抗分 子進(jìn)化技術(shù)。第①種已經(jīng)落后，第②種成功率太低，第③種過(guò)于復(fù)雜、投入巨大、前期工 作耗時(shí)長(zhǎng)且費(fèi)用高、風(fēng)險(xiǎn)高。第④種是近幾年逐漸成熟的技術(shù)，國(guó)外已有若干成功案例， 如 AME(CDR-grafting，US patent 7175996)、Morphosys (TRIM technology，文獻(xiàn) 23，US Patent 7432364)，Crucell ()等。它以人工突變和噬菌體高通量篩選技術(shù)為核心，使現(xiàn)有 單抗的技術(shù)指標(biāo)得以提高。這種技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成功率高、風(fēng)險(xiǎn)小且成本低，成為今后創(chuàng)新 StMab開發(fā)的核心技術(shù)之一。(三)、單抗庫(kù)、單抗分子進(jìn)化技術(shù)單抗分子人工進(jìn)化技術(shù)主要包括原型單抗分子的獲得、人工突變和以噬菌體為基 礎(chǔ)的高通量篩選。這方面的情況，文獻(xiàn)11 20有詳細(xì)描述。超大規(guī)模全人源單抗庫(kù)單抗庫(kù)技術(shù)是由Huse WD和J McCafferty等人在1990年前后創(chuàng)立的一項(xiàng)具有革 命性意義的技術(shù)。此后，科學(xué)家們利用該技術(shù)進(jìn)行了大量工作，構(gòu)建了多種結(jié)構(gòu)的單抗庫(kù)或 其它文庫(kù)(1 10)。但是由于這種技術(shù)本身的局限性(主要是難以獲得親和力能達(dá)到治療 性單抗要求的候選分子)，在治療性單抗開發(fā)方面至今只有Humira —個(gè)產(chǎn)品獲得成功。為 了解決這些問(wèn)題，科學(xué)家做了各種努力，但至今未見突破性進(jìn)展?？朔@種局限性的途徑之一是構(gòu)建超大規(guī)模單抗庫(kù)(1，2，5，8，10)，以獲得更加豐 富的變異，從而提高獲得高技術(shù)指標(biāo)候選單抗的可能性。但由于構(gòu)建超大規(guī)模單抗庫(kù)實(shí)際 操作上的難度很大，直到目前仍未獲得顯著成效，難以從任何規(guī)模的單抗庫(kù)中直接獲得技 術(shù)指標(biāo)達(dá)到治療性單抗要求的候選分子。分子進(jìn)化技術(shù)為了解決上述問(wèn)題，科學(xué)家在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了分子進(jìn)化技術(shù) (11 16)，在包括治療性單抗開發(fā)方面獲得了很大成功，已有多個(gè)成功案例，如US Patent 6989250，7575747，7560112，541033，7317091，7435799，7175996 所述。值得指出的是，這些 案例是以現(xiàn)有商業(yè)化的治療性單抗作為原型分子的，且其分子進(jìn)化的突變方案采用的是定 點(diǎn)突變(21)、隨機(jī)突變(11 15)、shuffling (16，20)、CDR-grafting (17)等方法，有效突 變效率低、技術(shù)難度高、工作量大，且所獲產(chǎn)物需要交叉許可才能進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)和銷售。高通量篩選技術(shù)一噬菌體展示包括本發(fā)明在內(nèi)的已有單抗人工分子進(jìn)化技術(shù)都采用具海量篩選能力的噬菌體 表面展示技術(shù)，從而方便地從大至10E12群體中淘篩出所需的高親和力克隆。關(guān)于噬菌體 展示的篩選方法，很多文獻(xiàn)(如文獻(xiàn)2，5，8，10)中有詳細(xì)描述。參考文獻(xiàn)1.Barbas CF, Bain JD, Hoekstra DM, et al.et al.1992, Semisynthetic combinatorialantibody libraries :A chemical solution to the diversity problem ； PNAS 89 :4457-4461(1992).2. 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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種雁陣式定域隨機(jī)突變方法及其 在單抗分子進(jìn)化技術(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一種雁陣式定域隨機(jī)突變方法，包括下列步驟1)雁陣式突變引物的設(shè)計(jì)與合成雁陣式隨機(jī)定域突變方案是以圖2所示的雁陣式引物設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)的。該設(shè)計(jì)方案 的要點(diǎn)如下(1)雁陣式引物設(shè)計(jì)將指定發(fā)生隨機(jī)突變區(qū)域及其側(cè)翼序列作為隨機(jī)突變PCR擴(kuò)增的目的序列，并設(shè) 計(jì)該目的序列的中央引物、左側(cè)引物及右側(cè)引物側(cè)翼序列包括5’ -端和3’ -端兩部分，長(zhǎng)度根據(jù)與其他序列拼接的需求，各取不 少于20個(gè)堿基的區(qū)域，一般為20-40個(gè)堿基，較佳的，側(cè)翼序列中應(yīng)包括有限制性酶切位點(diǎn) 以滿足拼接需求。側(cè)翼序列可由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員憑借需求，按常規(guī)確定。中央引物的設(shè)計(jì)以目的序列等分處為中心點(diǎn)，兩側(cè)各取多個(gè)堿基作為中央引物， 中央引物至多包含一個(gè)突變位點(diǎn)。引物中心點(diǎn)左右序列的長(zhǎng)度以保持Tm值在45 58度 為宜，優(yōu)選范圍是48 M度，一般而言，中央引物的長(zhǎng)度約為38 60個(gè)堿基，優(yōu)選范圍是 38 45個(gè)堿基。左側(cè)引物及右側(cè)引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)目的序列中心點(diǎn)以左的重疊延伸PCR引物作為左側(cè)引物，設(shè)計(jì)目的基因中心點(diǎn)以右的重疊延伸PCR引物作為右側(cè)引物，各左側(cè)引物與右 側(cè)引物均至多包含一個(gè)突變位點(diǎn)。各左側(cè)引物與右側(cè)引物的長(zhǎng)度約為20-40個(gè)堿基，且引 物的長(zhǎng)度以保持與相鄰引物的重疊區(qū)域的Tm值在45 58度為宜，優(yōu)選范圍是48 M度。 左側(cè)引物、右側(cè)引物及中央引物共同組成如圖2所示的雁陣式。無(wú)論目的序列的長(zhǎng)短，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員均可采用常規(guī)的引物設(shè)計(jì)軟件如 DNAStar軟件，設(shè)計(jì)出符合上述條件的引物。一般來(lái)說(shuō)，側(cè)翼序列中應(yīng)不包含突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)僅分布于指定發(fā)生隨機(jī)突變 的區(qū)域。上述所有的引物中應(yīng)有多個(gè)引物帶有突變，并且每個(gè)突變引物僅含一個(gè)突變位 點(diǎn)，在不同的突變引物間，突變位點(diǎn)的位置或堿基序列不同。突變位點(diǎn)可以指定。突變引物 在突變位點(diǎn)的突變堿基可為根據(jù)需要設(shè)定，也可以是隨機(jī)突變。(2)引物合成引物合成時(shí)候，中央引物可取正向或反向，左側(cè)引物均取正向，右 側(cè)引物均取反向。上述方法進(jìn)一步圖示說(shuō)明如下假設(shè)下述原型序列有5個(gè)以下劃線表示MO M4五個(gè)需要突變的位點(diǎn)CGACTCAGCTGCGCTGCTAGTGACTGTCTCTTCTCTCACCACTGGATGACTTGGGTCCAGCAGCTGCTG GACCCAGTCAGC(SEQ ID NO 6)按照上述方法，其引物設(shè)計(jì)及其overlapping關(guān)系如圖1所示。在其中央突變點(diǎn) MO兩側(cè)各取20 30個(gè)堿基作為中央引物，其長(zhǎng)度約為40 60個(gè)堿基，優(yōu)選范圍是40 45個(gè)堿基。中央或近中央可設(shè)計(jì)1個(gè)突變。中心點(diǎn)左右序列的長(zhǎng)度以保持Tm值在45 58度為宜，優(yōu)選范圍是48 M度。在其余各突變點(diǎn)兩側(cè)各取10 20個(gè)堿基，引物的長(zhǎng)度 應(yīng)以保持與相鄰引物的overlapping區(qū)域的Tm值在45 58度為宜，優(yōu)選范圍是48 M 度。2)隨機(jī)突變PCR 將上述左側(cè)引物、右側(cè)引物及中央引物混合進(jìn)行overlapping PCR，獲得指定區(qū)域 發(fā)生隨機(jī)突變的擴(kuò)增序列。overlapping PCR 方法為已知技術(shù)，可參考文獻(xiàn)Wu G, JB Wolf，AF Brahim. S.Vadasz, M Gunasinghe, SJ Freeland,2006, Simplified gene synthesis :Aone_step approach to PCR-based gene construction, J. biotech.,124(3) :496_503o所述指定隨機(jī)突變區(qū)域?yàn)槟康幕蛑幸欢芜B續(xù)的正鏈DNA序列，優(yōu)選含有6-40個(gè) 堿基。較佳的，有21-40個(gè)堿基。指定隨機(jī)突變區(qū)域可以根據(jù)操作者的需要確定，如抗體基 因的⑶R區(qū)、酶分子或蛋白分子的domain等。所述引物中的一個(gè)突變位點(diǎn)為指定隨機(jī)突變序列中一個(gè)擬突變密碼子對(duì)應(yīng)的三 聯(lián)堿基，突變位點(diǎn)上的三聯(lián)堿基可以是與原型不同的任意堿基組合，從而導(dǎo)致該突變位點(diǎn) 所編碼的氨基酸的隨機(jī)突變。參與隨機(jī)突變PCR的引物均至多包含一個(gè)突變位點(diǎn)。而不同的引物間，突變位點(diǎn) 的位置或堿基序列不同。由于每個(gè)突變引物均只含有一個(gè)隨機(jī)突變位點(diǎn)，這使得同時(shí)含有多種突變引物的 PCR反應(yīng)體系能夠容易進(jìn)行擴(kuò)增，相比含有多個(gè)不定數(shù)隨機(jī)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增的成功率獲得了大大的提升。此外，盡管本發(fā)明的每個(gè)突變引物只含有一個(gè)隨機(jī)突變位點(diǎn)， 由于PCR反應(yīng)體系中含有多種單點(diǎn)隨機(jī)突變引物，因此在最后的擴(kuò)增產(chǎn)物在指定隨機(jī)突變 區(qū)域內(nèi)不僅有單點(diǎn)隨機(jī)突變，也可以發(fā)生多點(diǎn)隨機(jī)突變。優(yōu)選的，引物間，所述Tm值至多相差2度。此設(shè)計(jì)可保證所有引物在同一 PCR條 件下進(jìn)行。本發(fā)明第二方面提供了上述雁陣式定域隨機(jī)突變方法在單克隆抗體分子進(jìn)化技 術(shù)中的應(yīng)用。通過(guò)將雁陣式定域隨機(jī)突變方法與KA掃描及噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn) 單克隆抗體分子的進(jìn)化。本發(fā)明第三方面，提供了一種單克隆抗體分子進(jìn)化方法，包括下列步驟1)KA 掃描(key amino acid screening，關(guān)鍵氨基酸掃描)a.以待進(jìn)化單克隆抗體對(duì)應(yīng)的特異性抗原為親和對(duì)象，從抗體庫(kù)中篩選出多個(gè)能 產(chǎn)生與該抗原特異性結(jié)合的抗體克隆。較佳的，篩選出的克隆數(shù)量至少為96個(gè)。所述抗體庫(kù)選自全人源抗體庫(kù)、特異性人源化、鼠源、兔源、駱駝源、全人工合成等 來(lái)源的Fab或scFv抗體庫(kù)中之任一或?yàn)槎叩暮喜?。所述全人源抗體庫(kù)優(yōu)選全人源超大 規(guī)?？贵w庫(kù)。所述待進(jìn)化單克隆抗體可以是各種來(lái)源的單克隆抗體，如已知的單克隆抗體、從 抗體庫(kù)中淘選出的單抗、各種哺乳動(dòng)物雜交瘤獲得的抗體、從哺乳動(dòng)物脾臟或外周血的免 疫細(xì)胞獲得的抗體、或者已經(jīng)進(jìn)化的抗體等。較佳的，待進(jìn)化單克隆單抗為以目標(biāo)抗體對(duì) 應(yīng)的抗原為親和對(duì)象，從單克隆抗體庫(kù)中篩選出的與該抗原親和力最高的單抗。b.從步驟a獲得的克隆中，選出親和力最高、次高和較高的克隆各5-10個(gè)，進(jìn)行抗 體DNA測(cè)序。親和力最高的克隆是指該克隆產(chǎn)生的抗體與待進(jìn)化抗體對(duì)應(yīng)的抗原的親和力 (以后簡(jiǎn)稱親和力)在經(jīng)步驟a獲得的克隆中排位最前。如5個(gè)親和力最高的克隆即為親 和力排位為1-5位的克隆，10個(gè)親和力最高的克隆即為親和力排位為1-10位的克隆。親和力次高的克隆是指與所選親和力最高的克隆中親和力相對(duì)最低的克隆相 比，在相同條件下與特異性抗原ELISA反應(yīng)后的光密度讀數(shù)低至少0. 7單位，且在滿足上述 條件的克隆中排位最前。親和力較高的克隆是指與所選親和力次高的克隆中親和力相對(duì)最低的克隆相 比，在相同條件下與特異性抗原ELISA反應(yīng)后的光密度讀數(shù)低至少0. 7單位，且在滿足上述 條件的克隆中排位最前。c.根據(jù)步驟b測(cè)序結(jié)果，分析這些克隆中同一指定隨機(jī)突變區(qū)域(任一⑶R區(qū)) 中的氨基酸分布情況，選擇出該區(qū)域的不可變位點(diǎn)，及可變位點(diǎn)，可變位點(diǎn)又區(qū)分為突變無(wú) 效位點(diǎn)，及與親和力有關(guān)的可變位點(diǎn)即KA位點(diǎn)。不可變位點(diǎn)在步驟b篩選出的所有克隆或絕大多數(shù)克隆(> 80% )或親和力最 高的克隆中氨基酸相同的位點(diǎn)視為不可變位點(diǎn)。突變無(wú)效位點(diǎn)與親和力無(wú)關(guān)的可變位點(diǎn)。突變無(wú)效位點(diǎn)的主要特征是，在步驟 b獲得的親和力最高的克隆中，氨基酸的變化均無(wú)規(guī)律。例如，既包括非極性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)，也包含極性氨基酸(如色氨 酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸)，既有酸性氨基酸(如 天冬氨酸、谷氨酸)，也有堿性氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、芳香族氨基酸(如色氨 酸、酪氨酸、苯丙氨酸)、亞氨基酸(脯氨酸)、含硫氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸)。與親和力有關(guān)的可變位點(diǎn)指定隨機(jī)突變區(qū)域在排除了不可變位點(diǎn)和突變無(wú)效位 點(diǎn)后剩下的位點(diǎn)。2)雁陣式定域隨機(jī)突變采用前述雁陣式定域隨機(jī)突變方法獲得KA位點(diǎn)或可變位點(diǎn)發(fā)生隨機(jī)突變的目的 序列擴(kuò)增產(chǎn)物。雁陣式定域隨機(jī)突變時(shí)，突變位點(diǎn)即為步驟1)中所述KA位點(diǎn)或可變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的 三聯(lián)堿基，所述指定發(fā)生隨機(jī)突變區(qū)域?yàn)槿我?CDR區(qū)。3)將步驟2獲得的KA位點(diǎn)或可變位點(diǎn)發(fā)生隨機(jī)突變的目的序列擴(kuò)增產(chǎn)物與該抗 體其余部分的序列拼接成完整的Fab重鏈或輕鏈的DNA分子后，插入到噬菌體載體中，并轉(zhuǎn) 化入宿主細(xì)胞建成突變庫(kù)；4)以待進(jìn)化單抗對(duì)應(yīng)的抗原為親和對(duì)象，從突變庫(kù)中篩選出多個(gè)能產(chǎn)生與該抗原 特異性結(jié)合的抗體的克隆，并選擇出親和力相比待進(jìn)化單抗獲得提高的克隆。較佳的，在步驟3前重復(fù)步驟1和2，獲得不同⑶R區(qū)發(fā)生隨機(jī)突變的擴(kuò)增產(chǎn)物。 通過(guò)同樣的操作，可以分別獲得重鏈和輕鏈各自三個(gè)CDR區(qū)的突變PCR產(chǎn)物，再通過(guò)三個(gè)突 變PCR產(chǎn)物的overlapping PCR即可獲得在⑶R區(qū)帶有目的突變的Fab結(jié)構(gòu)，并克隆到噬 菌體載體中。載體可為pC0Mb3M。同樣較佳的，在步驟4)后，以步驟4)選擇出的親和力最高的克隆分泌的單抗為原 型，重復(fù)步驟1)-4)進(jìn)一步進(jìn)化單克隆抗體。上述單克隆抗體分子進(jìn)化方法我們又稱其為PAE(Programmed Artificial Evolution,即程序化人工進(jìn)化技術(shù))技術(shù)，該技術(shù)是核心技術(shù)人員在多年技術(shù)積累的基礎(chǔ) 上，以噬菌體展示技術(shù)為基礎(chǔ)建立的人工改造單抗分子，從而使其能滿足治療用單抗要求 的核心技術(shù)。PAE技術(shù)優(yōu)勢(shì)(1)速度快。2-3個(gè)月即可獲得性能明顯提高的人工進(jìn)化產(chǎn)物。(2)成功率高。從理論上講，任何單抗都可以用這種方法改造，而且多數(shù)情況下可 以獲得比較理解的結(jié)果，其親和力、中和能力或其他生物學(xué)特性有明顯改善。因此，利用這 種方法進(jìn)行治療性單抗藥物的開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大大降低。C3)應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明所述技術(shù)在單抗，特別是治療性單抗研究上有多方面地應(yīng) 用。對(duì)(1)現(xiàn)有治療性單抗或者( 在研發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的帶有某些特定缺陷而不能作為治 療性單抗進(jìn)一步開發(fā)的候選單抗進(jìn)行改造，以達(dá)到如下目的一提高親和力國(guó)外一些公司和我們的研發(fā)工作已經(jīng)證明，利用分子進(jìn)化技術(shù)可 以快速提高單抗的親和力。作為治療性單抗，其親和力有較高的要求，目前業(yè)內(nèi)公認(rèn)的指標(biāo) 是InM以下，但目前多數(shù)治療性單抗的親和力均達(dá)到0. InM或更高。在研究開發(fā)過(guò)程中，許 多單抗因?yàn)橛H和力不夠而不能夠作為治療性藥物進(jìn)行開發(fā)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，人工進(jìn)化可 以使單抗的親和力提高1至3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，利用人工進(jìn)化進(jìn)一步改善治療性單抗的親和力是一條行之有效的快速方法。例如，我們通過(guò)人工進(jìn)化，獲得了比原型單抗親和力高近 300倍的抗人TNFa單抗?！岣忒熜в捎谟H和力的提高以及其他方面生物學(xué)特性的改變，其療效可以得 到明顯的提高。在同樣劑量下，可以獲得更好的療效，或者達(dá)到同樣的療效可以使用更低的 劑量。我們?cè)谘芯恐性?jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)人工進(jìn)化的抗人RANKL單抗親和力比國(guó)外同類產(chǎn)品提高 了 38. 6倍，只需要其1/4的劑量即可獲得同樣的療效。我們的另一案例中，人工進(jìn)化產(chǎn)物 對(duì)靶蛋白的親和力未見明顯提高，但其中和能力卻提高很多，其療效也明顯提高。-降低副作用由于親和力、特異性等方面的提高以及其他方面生物學(xué)特性的改 變，其副作用可以得到明顯的降低。其原因可能有⑴由于劑量的降低⑵減少了交叉反 應(yīng)。-改變單抗的特性單抗分子的某些特性改變后，更容易進(jìn)行相關(guān)研究(例如，臨 床前研究中與小動(dòng)物的兼容性)或能更好地滿足其他方面的需求。--快速人源化利用單抗庫(kù)技術(shù)可以對(duì)鼠源或其他來(lái)源的單抗進(jìn)行人源化，使外 源遺傳物質(zhì)減少到最低，從而大大降低免疫原性。到目前為止，借助人工進(jìn)化技術(shù)是單抗人 源化最可靠、最快速的方法。本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體分子進(jìn)化方法詳述如下單克隆抗體分子進(jìn)化的原型單抗分子來(lái)源于全人源超大規(guī)模抗體庫(kù)HuLib。該抗 體庫(kù)采用來(lái)自22個(gè)省區(qū)或直轄市、包括16個(gè)民族的約3000位健康青年人的血樣，歷經(jīng)3 年研制的具有充分復(fù)雜性和變異性的全人源超大規(guī)?？贵w庫(kù)，其有效容量高達(dá)10E11，理論 上可以從中篩選出任何抗原的單抗。詳細(xì)構(gòu)建過(guò)程參照文獻(xiàn)1 10的方法進(jìn)行。此前已 經(jīng)發(fā)表的人源抗體庫(kù)均為來(lái)自1至少數(shù)幾個(gè)個(gè)體的樣本建立的，其變異的豐富程度不足以 滿足篩選高指標(biāo)候選單抗的要求。這是目前唯一來(lái)自如此大樣本的非突變超大規(guī)模全人源 抗體庫(kù)。該抗體庫(kù)是本發(fā)明所述分子進(jìn)化原型單抗的來(lái)源。理論上，從上述抗體庫(kù)中可以篩選出任何抗原的單抗。至今已經(jīng)從中獲得了抗人 G-CSF單抗28株、抗人IL-Il單抗21株、抗人TNFa單抗6株、抗人RANKL單抗17株等。這 些單抗的親和力分布在I0E-6 10E-8M。根據(jù)已有的結(jié)果，從這個(gè)抗體庫(kù)中可以獲得所有 抗原的單抗。如同其它直接來(lái)自抗體庫(kù)的單抗一樣，來(lái)自上述抗體庫(kù)的單抗，其親和力也通常 在10E-6 10E-8M，篩選出達(dá)到10E-9M或更高親和力的候選單抗有相當(dāng)難度。為此，需要 結(jié)合本發(fā)明所述的PAE技術(shù)對(duì)從該庫(kù)中篩選出的單抗進(jìn)行進(jìn)一步改造，使其能夠達(dá)到治療 性單抗的要求。技術(shù)要點(diǎn)PAE技術(shù)的要點(diǎn)主要有三個(gè)方面。第一、高效的突變?cè)O(shè)計(jì)。突變引物的設(shè)計(jì)是能 否獲得適當(dāng)突變的關(guān)鍵。其要點(diǎn)主要有(1)根據(jù)項(xiàng)目目的選擇適當(dāng)?shù)耐蛔凕c(diǎn)，采用本發(fā)明 所述的KA掃描法；(2)根據(jù)選定的突變點(diǎn)及交接序列確定引物序列。特別是第(1)項(xiàng)內(nèi)容 十分重要，不妥的設(shè)計(jì)會(huì)導(dǎo)致無(wú)法獲得理想的突變。本發(fā)明主要是在突變點(diǎn)的選擇和突變 方案設(shè)計(jì)方面進(jìn)行了改進(jìn)。第二、大容量噬菌體展示庫(kù)的建立。人工進(jìn)化需要建立具有海 量突變體的噬菌體庫(kù)，它由三個(gè)步驟構(gòu)成，即PCR和高效連接和轉(zhuǎn)化。這三個(gè)步驟中涉及的 PCR、DNA連接和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化雖都是成熟技術(shù)，但是由于超大庫(kù)容的特殊需要，這三個(gè)步驟并不是輕而易舉的。特別值得提出的是，由于引物中還有大量突變，其PCR常常遇到很大的 困難。本發(fā)明的GCR法在很大程度上解決了這一問(wèn)題。第三、高效的噬菌體淘篩方案。噬 菌體展示技術(shù)雖已很成熟，但是如何從海量(10E10 10EU)的突變體中篩選出符合要求 的克隆并不是一件十分輕松的事，使用哪種載體、采用哪種具體的篩選方案不但會(huì)影響試 驗(yàn)進(jìn)程，而且會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。文獻(xiàn)2，5，8，10提供了詳細(xì)的淘篩方案。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的工作，我們建立的PAE技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，在上述三個(gè)方面均已建立 程序化的實(shí)驗(yàn)操作體系，能夠保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行。突變方案人工進(jìn)行基因突變的方法有很多種。就DNA分子水平上的突變方法而言，使用 比較廣泛的成熟技術(shù)有定點(diǎn)突變(21)、隨機(jī)突變(11 15)、domain shuffling (16，20)、 CDR-grafting(17)等方法。在單抗分子進(jìn)化技術(shù)中要求既能獲得盡量豐富的有效變異，又 能避免對(duì)超大庫(kù)容的需求。變異豐度不足難以獲得理想的突變體，變異豐度過(guò)大則對(duì)庫(kù)容 要求大幅度提高，會(huì)極大地增加建庫(kù)和淘篩的難度。因此，如何在獲得足夠有效變異的前提 下盡量降低對(duì)庫(kù)容的要求，是一個(gè)值得探索的問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種能大幅度降低庫(kù)容要求并提高有效突變的方法。其根本點(diǎn) 在于，(1)從前述全人抗體庫(kù)HuLib中篩選高質(zhì)量的候選單抗原型分子，其親和力應(yīng)達(dá)到 10E-8mol/l或更高，從而大大降低后續(xù)改進(jìn)的壓力。( 降低無(wú)效突變。根據(jù)關(guān)于單抗分 子結(jié)構(gòu)的已有資料，特別是同一抗原表位已有單抗的分子結(jié)構(gòu)信息，確定原型中可能有效 的突變位點(diǎn)，剔除明顯無(wú)效的突變位點(diǎn)，使庫(kù)容需求大幅度降低。無(wú)效突變點(diǎn)的確認(rèn)可以通 過(guò)下述的KA掃描方法完成。( 采用下述的雁陣式突變方案，提高突變效率和PCR的可操 作性，降低對(duì)建庫(kù)庫(kù)容的要求，使實(shí)際操作更容易進(jìn)行。KA掃描方法從上述抗體庫(kù)中可以篩選出大量特異性的克隆，從中選出親和力最高、次高和較 高的克隆各5個(gè)，進(jìn)行DNA測(cè)序。三類克隆在親和力方面應(yīng)相差一個(gè)數(shù)量級(jí)(在ELISA檢 測(cè)中光密度讀數(shù)相差約0. 7單位)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，可以分析三個(gè)CDR區(qū)氨基酸的分布情 況。那些在所有克隆或絕大多數(shù)克隆(> 80%)，尤其是高親和力克隆中氨基酸相同的位 點(diǎn)視為不可變位點(diǎn)，其余的視為可變位點(diǎn)。再根據(jù)氨基酸分布情況，從可變位點(diǎn)中進(jìn)一步甄 別出與親和力無(wú)關(guān)的可變位點(diǎn)(突變無(wú)效)，即可確定與親和力有關(guān)的可變位點(diǎn)，即KA位 點(diǎn)。突變無(wú)效位點(diǎn)的主要特征是，在親和力最高的克隆中氨基酸的分布無(wú)規(guī)律。KA位點(diǎn)是在排除了不可變位點(diǎn)和突變無(wú)效位點(diǎn)后剩下的部分，氨基酸數(shù)量已大幅 度減少。在此基礎(chǔ)上按照下述的定域隨機(jī)突變方案進(jìn)行突變，可以大大降低對(duì)突變?nèi)后w大 小的要求，使得建庫(kù)和篩選操作很容易進(jìn)行。根據(jù)15個(gè)克隆的氨基酸分布難以區(qū)分三類氨基酸時(shí)，可適當(dāng)增加克隆數(shù)量。雁陣式定域隨機(jī)突變PAE技術(shù)采用了雁陣式定域隨機(jī)(Goose Array CDR_in random,GCR)突變方案，與 其他突變方案相比有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)①可同時(shí)進(jìn)行多點(diǎn)突變，容易創(chuàng)造豐富的變異；②一組引 物間的隨機(jī)組合可產(chǎn)生多突變點(diǎn)的隨機(jī)組合，突變效率比定點(diǎn)突變高至少3個(gè)數(shù)量級(jí)；③ 突變區(qū)域是確定的(即定域)，但區(qū)域內(nèi)具體位點(diǎn)的突變是隨機(jī)的，它結(jié)合了定點(diǎn)突變和隨 機(jī)突變的雙重優(yōu)勢(shì)。(4)常規(guī)的隨機(jī)突變方案中每條引物都有很多突變點(diǎn)，往往PCR很難進(jìn)行，所得產(chǎn)物往往嚴(yán)重偏離隨機(jī)排列。本方案中每條引物僅包含一個(gè)突變點(diǎn)，可避免這種情 況。圖2是雁陣式隨機(jī)突變方案示意圖。這種突變?cè)O(shè)計(jì)有以下特點(diǎn)(1)可以在一個(gè)指 定區(qū)域內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多點(diǎn)隨機(jī)突變或多點(diǎn)定點(diǎn)突變。該方法每條引物上只有一個(gè)突變點(diǎn)，但 不同引物上對(duì)應(yīng)于原型系列的突變點(diǎn)位置不同。(2)避免了一般多點(diǎn)突變方法中復(fù)雜PCR 難度大的問(wèn)題，一般情況下一次PCR即可獲得良好的PCR產(chǎn)物。( 有效突變效率比通常的 隨機(jī)突變或多點(diǎn)定點(diǎn)突變要高2個(gè)數(shù)量級(jí)。G)PCR產(chǎn)物多是雜合的，其純合過(guò)程將在轉(zhuǎn)化 后細(xì)菌的繁殖過(guò)程中完成。因此，對(duì)轉(zhuǎn)化效率的要求相對(duì)較低。在同樣轉(zhuǎn)化效率情況下，獲 得的有效庫(kù)容比常規(guī)方法高1倍，這在后續(xù)的建庫(kù)過(guò)程中有重要意義。


圖1 一個(gè)典型序列的引物設(shè)計(jì)；圖2 雁陣式PCR引物設(shè)計(jì)示意圖*代表突變點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)中以N表示，可以是四種堿基的任意一種?？梢愿鶕?jù)試驗(yàn) 設(shè)計(jì)要求確定四種堿基在該點(diǎn)的比例，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變?nèi)后w在該點(diǎn)突變的控制。圖3:pC0Mb3M質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。該載體是以pC0Mb3H為基礎(chǔ)改建的，其兩 個(gè)多克隆位點(diǎn)與原始載體不同，其余部分未作修改。該載體的輕鏈測(cè)序引物為 gcgattgcagtggcactggc (SEQ IDNO :14)，重鏈測(cè)序弓丨物為 cctacggcagccgctggattg (SEQ ID NO 15)。圖4.抗人TNFa抗體7B4、2H7、4D3、6F5、3C9、3H6等6個(gè)Fab克隆親和力試驗(yàn)結(jié)果圖5.以光密度反映的原型分子2G8、最好親和力克隆9H6以及另外三個(gè)隨機(jī)挑選 的克隆的親和力數(shù)據(jù)。從這些數(shù)據(jù)中可以看出，分子進(jìn)化完成后的分子群體中親和力分布 很寬，且有一些分子的親和力明顯高于原型。圖6 抗人RANKL抗體對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。圖中數(shù)據(jù)為TRAP染色細(xì)胞的計(jì)數(shù) 結(jié)果?？v坐標(biāo)為形成的破骨細(xì)胞數(shù)；橫坐標(biāo)為抗體濃度，范圍如正文所述。圖7 抗人⑶20單抗ELISA實(shí)驗(yàn)的光密度。進(jìn)化后的3D7具有明顯高于原型6B2 和陽(yáng)性對(duì)照Rituxan的親和力。圖8 抗人⑶20單抗內(nèi)殺傷試驗(yàn)圖9抗人VEGF抗體親和力測(cè)定結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。以下列舉了四個(gè)候選治療性單抗的研制。并以抗人TNFa單抗的研制為例說(shuō)明本 發(fā)明的操作程序，并說(shuō)明四個(gè)治療性單抗的生物活性鑒定情況。實(shí)施例1全人源超大規(guī)?？贵w庫(kù)構(gòu)建全人源超大規(guī)?？贵w庫(kù)的構(gòu)建參考文獻(xiàn)1 10的方法進(jìn)行。具體操作如下1.采集血樣和cDNA合成收集3000人的外周血各lml，混合，用淋巴細(xì)胞分離液(醫(yī)科院天津血研所生產(chǎn))分離單個(gè)核細(xì)胞。用GIBCO公司的試劑盒，從分離的人外周血淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞的總 mRNA。用GIBCO公司的mRNA純化試劑盒純化，以上述獲得的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出cDNA 第一鏈。以上步驟按照廠家提供的說(shuō)明書進(jìn)行。2. PCR 擴(kuò)增1.引物設(shè)計(jì)為了構(gòu)建全人源Fab抗體庫(kù)，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，盡可能使PCR引物對(duì)人群具有廣泛 的通用性。我們參照國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的多種人單抗基因家族序列中Fv區(qū)兩端較保守的區(qū)段 序列，設(shè)計(jì)了人單抗VH基因(hVH)、VL基因(hVL)、5'端(back)、3'端(forward)弓丨物。 為了進(jìn)一步加強(qiáng)引物對(duì)人單抗V區(qū)基因擴(kuò)增的通用性，在各引物序列中引入了多處簡(jiǎn)并位 點(diǎn)(多義位點(diǎn))。根據(jù)所用載體pC0Mb3M(加入了以下內(nèi)容涉及到的限制酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增 Kappa和lambda鏈的引物和重鏈gamma鏈Fd區(qū)域的引物設(shè)計(jì)為表1所示。引物序列包含 有用于克隆的限制性位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件為=IOOul體系，正反向引物各IuM, 30個(gè)循環(huán)(預(yù)變性2分鐘，94C1 分鐘，50C2分鐘，72C3分鐘，后延伸1分鐘)。PCR產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠上120V電泳約 20分鐘，割膠并進(jìn)行膠純化。然后，用AscI和NheI或SfiI和NotI酶切處理后先(輕鏈) 后(重鏈)連接到載體pC0Mb3M，然后轉(zhuǎn)化E. coli TGl。表1.擴(kuò)增全人源Fab片段的引物(參考文獻(xiàn)10)。引物方向?yàn)?’_3’，其中M = A or C, Y = C or T, W = A or T, R = A or G, H = A, C, or T, S = 5 C or G, K = T or G.
權(quán)利要求
1.一種雁陣式定域隨機(jī)突變方法，包括下列步驟1)引物的設(shè)計(jì)與合成(1)雁陣式引物設(shè)計(jì)將指定發(fā)生隨機(jī)突變區(qū)域及其側(cè)翼序列作為隨機(jī)突變PCR擴(kuò)增的目的序列，并設(shè)計(jì)該 目的序列的中央引物、左側(cè)引物及右側(cè)引物中央引物的設(shè)計(jì)以目的序列等分處為中心點(diǎn)，兩側(cè)各取多個(gè)堿基作為中央引物，中央 引物至多包含一個(gè)突變位點(diǎn)；左側(cè)引物及右側(cè)引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)目的序列中心點(diǎn)以左的重疊延伸PCR引物作為左側(cè) 引物，設(shè)計(jì)目的基因中心點(diǎn)以右的重疊延伸PCR引物作為右側(cè)引物，各左側(cè)引物與右側(cè)引 物均至多包含一個(gè)突變位點(diǎn)；(2)引物合成中央引物取正向或反向，左側(cè)引物均取正向，右側(cè)引物均取反向；2)隨機(jī)突變PCR將步驟1)合成的左側(cè)引物、右側(cè)引物及中央引物混合進(jìn)行overlapping PCR，獲得指 定區(qū)域發(fā)生隨機(jī)突變的擴(kuò)增序列。
2.如權(quán)利要求1所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法，其特征在于左側(cè)引物、右側(cè)引物及中 央引物共同組成雁陣式。
3.如權(quán)利要求2所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法，其特征在于所述中央引物中心點(diǎn)左 右序列的長(zhǎng)度以Tm值為45-58°C設(shè)計(jì)；所述左側(cè)引物與右側(cè)引物中相鄰引物的重疊區(qū)域的 長(zhǎng)度以Tm值為45-58度設(shè)計(jì)。
4.如權(quán)利要求3所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法，其特征在于參加同一隨機(jī)突變PCR 反應(yīng)的引物間，Tm值至多相差2°C。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法，其特征在于步驟 1)設(shè)計(jì)并合成的引物中，含有多個(gè)突變引物，每條突變引物僅含一個(gè)突變位點(diǎn)，不同的突變 弓I物間突變位點(diǎn)的位置或堿基序列不同。
6.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法用于進(jìn)化單克隆抗體 分子。
7.一種單克隆抗體分子進(jìn)化方法，包括下列步驟1)KA掃描a.以待進(jìn)化單克隆抗體對(duì)應(yīng)的特異性抗原為親和對(duì)象，從抗體庫(kù)中篩選出多個(gè)能產(chǎn)生 與該抗原特異性結(jié)合的抗體克?。籦.從步驟a獲得的克隆中，選出親和力最高、次高和較高的克隆各5-10個(gè)，進(jìn)行抗體 DNA測(cè)序；c.根據(jù)步驟b測(cè)序結(jié)果，分析這些克隆中同一指定隨機(jī)突變區(qū)域中的氨基酸分布情 況，選擇出該區(qū)域的不可變位點(diǎn)，及可變位點(diǎn)，可變位點(diǎn)又區(qū)分為突變無(wú)效位點(diǎn)，及與親和 力有關(guān)的可變位點(diǎn)即KA位點(diǎn)；2)雁陣式定域隨機(jī)突變采用權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述雁陣式定域隨機(jī)突變方法獲得KA位點(diǎn)或可變位 點(diǎn)發(fā)生隨機(jī)突變的目的序列擴(kuò)增產(chǎn)物，雁陣式定域隨機(jī)突變時(shí)，突變位點(diǎn)即為步驟1)中所述KA位點(diǎn)或可變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的三聯(lián)堿基，所述指定發(fā)生隨機(jī)突變區(qū)域?yàn)榇M(jìn)化單克隆抗體的任一 CDR區(qū)；3)將步驟幻獲得的KA位點(diǎn)或可變位點(diǎn)發(fā)生隨機(jī)突變的目的序列擴(kuò)增產(chǎn)物拼接成完 整的Fab重鏈或輕鏈的DNA分子后，插入到噬菌體載體中，并轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞建成突變抗體 庫(kù)；4)以待進(jìn)化單抗對(duì)應(yīng)的抗原為親和對(duì)象，從突變庫(kù)中篩選出多個(gè)能產(chǎn)生與該抗原特異 性結(jié)合的抗體的克隆，并選擇出親和力相比待進(jìn)化單抗獲得提高的克隆。
8.如權(quán)利要求7所述單克隆抗體分子進(jìn)化方法，其特征在于，所述步驟1)的a中，篩選 出的克隆數(shù)量至少為96個(gè)。
9.如權(quán)利要求7所述單克隆抗體分子進(jìn)化方法，其特征在于，所述步驟1)的b中，所述 親和力最高的克隆是指該克隆產(chǎn)生的抗體與待進(jìn)化抗體對(duì)應(yīng)的抗原的親和力在經(jīng)步驟a 獲得的克隆中排位最前；親和力次高的克隆是指與所選親和力最高的克隆中親和力相對(duì) 最低的克隆相比，在相同條件下與特異性抗原ELISA反應(yīng)后的光密度讀數(shù)低至少0. 7單位， 且在滿足上述條件的克隆中排位最前；親和力較高的克隆是指與所選親和力次高的克隆 中親和力相對(duì)最低的克隆相比，在相同條件下與特異性抗原ELISA反應(yīng)后的光密度讀數(shù)低 至少0. 7單位，且在滿足上述條件的克隆中排位最前。
10.如權(quán)利要求7所述單克隆抗體分子進(jìn)化方法，其特征在于，所述步驟1)的c中，所 述不可變位點(diǎn)為在步驟b篩選出的所有克隆或絕大多數(shù)克隆或親和力最高的克隆中氨基 酸相同的位點(diǎn)視為不可變位點(diǎn)；所述突變無(wú)效位點(diǎn)為與親和力無(wú)關(guān)的可變位點(diǎn)。
11.如權(quán)利要求7-10中任一權(quán)利要求所述單克隆抗體分子進(jìn)化方法，其特征在于，在 步驟幻前重復(fù)步驟1)和幻，獲得不同CDR區(qū)發(fā)生隨機(jī)突變的擴(kuò)增產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求7-10中任一權(quán)利要求所述單克隆抗體分子進(jìn)化方法，其特征在于，在 步驟4)后，以步驟4)選擇出的親和力最高的克隆分泌的單抗為原型，重復(fù)步驟1)-4)進(jìn)一 步進(jìn)化單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雁陣式定域隨機(jī)突變方法及其在單抗分子進(jìn)化技術(shù)中的應(yīng)用，本發(fā)明的雁陣式定域隨機(jī)突變方法，包括下列步驟設(shè)計(jì)隨機(jī)突變PCR擴(kuò)增的目的序列的雁陣式引物，合成引物并將引物混合后進(jìn)行overlapping PCR，獲得指定區(qū)域發(fā)生隨機(jī)突變的擴(kuò)增序列。本發(fā)明的雁陣式定域隨機(jī)突變方法可用于單克隆抗體分子進(jìn)化，本發(fā)明還進(jìn)一步結(jié)合KA掃描、雁陣式定域隨機(jī)突變方法及噬菌體展示技術(shù)，提供了一種單克隆抗體分子進(jìn)化的方法。本發(fā)明的突變方法用于分子進(jìn)化，速度快、成功率高、應(yīng)用范圍廣。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102051396SQ20091019828
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者劉慶法, 吳希美 申請(qǐng)人:無(wú)錫天演生物技術(shù)有限公司