專利名稱：擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記Scpa01的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具體涉及海洋經(jīng)濟蟹 類擬穴青蟹(Scylla paramamosain)微衛(wèi)星分子標(biāo)記kpaOl的檢測方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)幾乎存在于所有真核生物基因組中，由1-6個 核苷酸組成的簡單序列重復(fù)(Simple kquenceR印eats，SSR)，是近十幾年發(fā)展起來的一種 新型分子標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星具有數(shù)量多、隨機分布、多態(tài)性高、重復(fù)性強、呈共顯性遺傳及操 作簡單等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護與管理、遺傳連鎖圖譜 構(gòu)建及QTL定位等領(lǐng)域中。國內(nèi)外學(xué)者已在大多數(shù)的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中開發(fā)了微衛(wèi)星標(biāo)記。如⑶O等開 發(fā)了大黃魚的6個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；李紹戊等開發(fā)了團頭魴的19個微衛(wèi)星標(biāo)記；馬洪雨等 報道了圓斑星鰈的40個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記和條斑星鰈的31個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；Wang等開發(fā) 了太平洋牡蠣的17個EST來源的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；ELFSTR0M等開發(fā)了扇貝的16個微衛(wèi)星 標(biāo)記；Yap等篩選到梭子蟹的8個多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；An等篩選了中華絨螯蟹的9個微衛(wèi)星標(biāo) 記。這些多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖 圖譜構(gòu)建等研究中。擬穴青蟹Gcylla paramamosain)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱 (Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬Gcyl la)，主要分布于 太平洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶沿岸，在我國主要分布于東南沿海各省，以福建、廣東 和海南最多，是我國重要的養(yǎng)殖蟹類之一。為了鑒定和保護在我國廣泛分布的青蟹資源，馬 凌波等對我國東南沿海的青蟹的線粒體進行了研究，結(jié)果證實在我國廣泛分布的青蟹為擬 穴青蟹，而不是先前認(rèn)為的鋸緣青蟹。目前，可利用的擬穴青蟹微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量非常少，嚴(yán) 重限制了相關(guān)遺傳學(xué)研究的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，以彌 補已有技術(shù)的不足。主要利用擬穴青蟹RAPD擴增產(chǎn)物進行測序，對含有微衛(wèi)星重復(fù)的序 列，在其側(cè)翼區(qū)設(shè)計特異性引物并進行PCR擴增，從而快速檢測擬穴青蟹不同地理群體或 群體內(nèi)不同個體在該基因座位的遺傳變異，獲得擬穴青蟹的多態(tài)性圖譜，通過圖譜直觀、準(zhǔn) 確地檢測出每個個體的基因型。本發(fā)明是通過以下步驟實現(xiàn)的首先提取擬穴青蟹的基因組DNA并稀釋保存?zhèn)?用；再對擬穴青蟹的RAPD擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，在含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列的側(cè)翼 區(qū)設(shè)計特異性引物；使用該引物對擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)不同個體的基因組DNA 進行PCR擴增，利用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷 移距離，確定其基因型，從而快速、準(zhǔn)確地獲得擬穴青蟹的遺傳多態(tài)性圖譜。
本發(fā)明的核心是微衛(wèi)星核苷酸序列和引物序列，該微衛(wèi)星位點ScpaOl在擬穴青 蟹群體中呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。擬穴青蟹微衛(wèi)星位點ScpaOl的核苷酸序列為1 aaccatgcct taaaataaaa gtagtagtag tagtagtagt agtagtagta51 atagtagtag tagtaatagt agaagtagca gtagcagtag cagtagtagt101 tcccgcgtgc atttaattgc tgcacactaa attctttctg tgtccctttg151 tgttctcagt cacgttgcca atcagttttg ccctgagctg attttttttt201 tggaaaatataaaaacaata cgtaataata tcagagtat擬穴青蟹微衛(wèi)星位點ScpaOl的引物序列為正向引物5，-CGATTAACCATGCCTTAAAATAA-3，反向引物5，-ATCAGCTCAGGGCAAAACTGA-3，該引物的退火為54°C。本發(fā)明的特點是可快速獲得擬穴青蟹在ScpaOl基因位點遺傳變異的多態(tài)性圖 譜，該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出擬穴青蟹不同個體的基因型。本 發(fā)明主要應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng) 域。
具體實施例方式下面通過“擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記ScpaOl檢測方法的建立”的實施例，對 本發(fā)明進行詳細說明1、擬穴青蟹基因組DNA的提取剪取擬穴青蟹少量肌肉組織(約100-150mg)，置于500 μ 1組織提取液(lOmmol/ L Tris-CI, pH 8. O ；IOOmmol/L EDTA, pH8. O ；IOOmmo 1/L NaCl ；0. 5% SDS)的中剪碎，加入 蛋白酶K (終濃度為20mg/ml)和RNase A (終濃度為100 μ g/ml)，充分混勻，55°C消化2-3 個小時至澄清；用酚氯仿異戊醇混合液(體積比為25 24 1)抽提兩次；然后用 2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50μ L TE(10mmol/ L Tris-HCl，pH 8.0 ； 10mmol/LEDTA,pH8. 0)中；最后將 DNA 濃度稀釋為 IOOng/μ 1，并保存 在-20°C備用。2、擬穴青蟹RAPD擴增產(chǎn)物與T載體的連接連接體系為10 μ 1，包括 solution I 5. 0 μ 1、pMD19_T 載體(TaKaRa) 1. 0 μ 1 及 RAPD擴增產(chǎn)物4.0 μ 1，4°C連接過夜。3、克隆、測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO中，使用載體通用引物(M13-47 5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；M13-48 :5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，)和微衛(wèi)星 核心重復(fù)寡核苷酸引物(5’-AGTAGTAGTAGTAGTAGTAGT-3’)對克隆進行PCR鑒定。PCR反應(yīng) 體系為25 μ 1，包括菌液1 μ 1、3條引物終濃度均為0. 4 μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、 dNTP終濃度為0. 2mmol/L、Tag DNA聚合酶0. 75U、1XPCR buffer，最后補充滅菌雙蒸水至 總體積為25 μ 1 ；PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、55°C退火50秒、72°C 延伸50秒，25個循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。最后，挑選插入片斷長度在250-700bp之間的陽性克隆，用ABI3730測序儀進行測序。4、微衛(wèi)星引物設(shè)計首先使用軟件SSRHUNTER 1. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列，然后利用生物學(xué) 軟件Premier 5. 0對含有完整側(cè)翼序列的微衛(wèi)星序列進行引物設(shè)計。本發(fā)明基 因位點kpaOl的核心重復(fù)序列為(AGT)ltlAA(TAG)4Nltl(AGTAGC)3(AGT)3 ；正向引物序列為 5，-CGATTAACCATGCCTTAAAATAA-3，，反向引物序列為5，-ATCAGCTCAGGGCAAAACTGA-3，，退火 溫度為^°C。5、PCR 擴增利用上述微衛(wèi)星引物對擬穴青蟹群體進行PCR擴增，其反應(yīng)體系為25μ 1，包括基 因組DNA模板1 μ 1、上下游引物終濃度均為0. 4 μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、dNTP終 濃度為0. 2mmol/L、TagDNA聚合酶0. 75U、1XPCR buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為 25 μ 1。PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、54°C退火50秒、72°C延伸50 秒，30個循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?、PCR產(chǎn)物的電泳檢測向PCR產(chǎn)物中加入約1/2體積的變性劑(98. 0%甲酰胺，1 Ommol/LEDTA，0. 25%溴 酚藍，0. 25%二甲苯氰)，于95°C變性5分鐘，快速冷卻；然后上樣約3 μ 1于6%的變性聚 丙烯酰胺凝膠中進行電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322/MspI，電泳液為1 X TBE，恒壓35-40V/cm， 電泳約11-1. 5小時。電泳完成后進行染色和顯色，其操作過程為首先用70%乙醇固定10分鐘，之后 用蒸餾水洗5分鐘；然后用1. 5%。硝酸銀染色10分鐘，之后再用蒸餾水洗8秒鐘；最后用顯 色液的NaOH+4%。的甲醛)顯色至帶型清晰，再用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，便獲得了擬 穴青蟹在基因位點kpaOl遺傳變異的多態(tài)性圖譜。如

圖1所示，等位基因大小在192-2i;3bp 之間，總共檢測到6個等位基因和9種不同的基因型。
權(quán)利要求
1.擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，其特征在于操作技術(shù)通過以下 步驟實現(xiàn)(1)擬穴青蟹基因組DNA的提取并稀釋備用；(2)擬穴青蟹RAPD擴增產(chǎn)物克隆、 測序；C3)微衛(wèi)星序列特異性引物的設(shè)計；(4)使用該引物對擬穴青蟹不同地理群體或群體 內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增；(5)使用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴 增產(chǎn)物；(6)根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，從而獲得擬穴青蟹在 ScpaOl基因座位的多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記kpaOl的檢測方法，其特征 在于步驟(1)擬穴青蟹基因組DNA的提取是剪取擬穴青蟹少量肌肉組織(約100-150mg)， 置于500 μ 1組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/ml蛋白酶K和終濃度為IOOyg/ mlRNase A，55°C消化2_3個小時；用酚氯仿異戊醇混合液，酚、氯仿、異戊醇混合液體 積比為25 24 1抽提兩次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自 然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為lOOng/μ 1，并保存在_20°C備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，其特征在 于步驟O)RAPD擴增產(chǎn)物克隆、測序是第一步是RAPD擴增產(chǎn)物的克隆；第二步是產(chǎn)物的 測序所述的RAPD擴增產(chǎn)物的克隆，其方法是首先將RAPD擴增產(chǎn)物連接到pMD19_T載體 TaKaRa 中，反應(yīng)體系為 10 μ 1，包括 solution 15. 0 μ l、pMD19_T 載體 1. 0 μ 1 及 RAPD 擴增產(chǎn) 物4.0μ 1，4°C連接過夜將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO中，使用載體通用引 物禮3-47 :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；M13_48 :5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3， 和微衛(wèi)星核心重復(fù)寡核苷酸引物5’ -AGTAGTAGTAGTAGTAGTAGT-3’對克隆進行PCR鑒定， 其反應(yīng)體系為25 μ 1，包括菌液1、3條引物終濃度均為0. 4ymol/L、Mg2+終濃度為 1. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 0. 2mmol/L、Tag DNA 聚合酶 0. 75U、1XPCR buffer，最后補充滅 菌雙蒸水至總體積為25 μ 1 ；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、55°C退火50 秒、72 °C延伸50秒，25個循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘；所述的產(chǎn)物測序，是挑選插入片斷長度在250-700bp之間的陽性克隆，用ABI3730測序 儀測序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，其特征在 于步驟⑶微衛(wèi)星序列特異性引物的設(shè)計是首先利用軟件SSRHUNTER 1. 3查找含有微衛(wèi)星 核心重復(fù)的序列，然后利用生物學(xué)軟件I^rimer Premier 5. 0對含有完整側(cè)翼區(qū)的微衛(wèi)星序 列進行引物設(shè)計基因位點^paOl的正向引物序列為5’ -CGATTAACCATGCCTTAAAATAA-3’， 反向引物序列為5，-ATCAGCTCAGGGCAAAACTGA-3’，退火溫度為M°C該微衛(wèi)星位點的核心 重復(fù)序列為(AGT) 10AA (TAG) 4N10 (AGTAGC) 3 (AGT) 3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)Ekpa01的檢測方法，其特 征在于步驟(4)使用kpaOl位點引物對擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)個體的基因組 DNA進行PCR擴增的反應(yīng)體系為25μ 1，包括基因組DNA模板1μ 1、上下游引物終濃度均為 0. 4 μ mol/L、Mg2+ 終濃度為 1. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 0. 2mmol/L、TagDNA 聚合酶 0. 75U、 IXPCR buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ 1 ；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5分鐘， 94°C變性30秒、54°C退火50秒、72 °C延伸50秒，30個循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，其特征在于步驟( 使用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物向PCR產(chǎn)物中加入1/2 體積的變性劑，于95°C變性5分鐘，快速冷卻；然后上樣約3μ 1于6%的聚丙烯酰胺凝膠中 進行電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322/MspI，電泳液為1XTBE，恒壓35_40V/cm，電泳約1-1. 5小 時；染色、顯色過程為70%乙醇固定10分鐘，蒸餾水洗5分鐘，1. 5%。硝酸銀染色10分鐘， 蒸餾水洗8秒鐘，顯色液為2%的NaOH+4%。的甲醛，顯色至帶型清晰。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)Ekpa01的檢測方法，其特征 在于步驟(6)kpa01基因座位的基因型是根據(jù)條帶的不同遷移距離來判別的；等位基因大 小在192-213bp之間，總共獲得6個等位基因和9種不同的基因型，從而獲得擬穴青蟹在 ScpaOl基因座位的多態(tài)性圖譜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)EkpaOl的檢測方法，其特征在 于應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。
全文摘要
擬穴青蟹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記Scpa01的檢測方法，其特點是首先提取擬穴青蟹基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?；再利用擬穴青蟹RAPD擴增產(chǎn)物中含有微衛(wèi)星重復(fù)的序列，在其核心重復(fù)序列的兩側(cè)設(shè)計特異性引物；并使用該引物對擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)不同個體的基因組DNA進行PCR擴增，再用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物；根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，從而獲得擬穴青蟹在Scpa01基因座位的多態(tài)性圖譜。本方法用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。
文檔編號C12Q1/68GK102086470SQ200910199859
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者馬凌波, 馬春艷, 馬洪雨 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所