專利名稱：絮凝酵母絮凝基因、其表達(dá)產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自絮凝酵母的絮凝基因FLOsc、其產(chǎn)物、及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自絮凝酵母是大連理工大學(xué)白鳳武教授實(shí)驗(yàn)室自行選育的具有良好絮凝性狀而 且發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株Mccharomyces cerevisiae f Io (馴化選育的自絮凝酵母變異 株及應(yīng)用，中國發(fā)明專利200610025259. 7)。利用自絮凝酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵，可提高發(fā)酵罐 中細(xì)胞密度，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高生產(chǎn)強(qiáng)度，同時(shí)降低乙醇分離過程的能源動(dòng)力消耗，降低 乙醇生產(chǎn)成本，而該菌株為原生質(zhì)體融合菌株，獲得其絮凝基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，進(jìn) 一步構(gòu)建新的具有自絮凝特征的生產(chǎn)菌株具有重要的意義?，F(xiàn)有的獲得自絮凝酵母的方法包括自然分離、原生質(zhì)體融合，以及利用導(dǎo)入絮凝 基因的遺傳工程方法等。其中自然分離方法帶有一定隨機(jī)性，而且分離得到的酵母存在遺 傳背景不清楚，發(fā)酵性狀難以預(yù)知等缺點(diǎn)，原生質(zhì)體融合手段需要篩選大量的融合子，而且 在親本酵母不存在選擇標(biāo)記的情況下難以進(jìn)行。而利用絮凝基因進(jìn)行絮凝酵母的轉(zhuǎn)基因育 種則可選擇發(fā)酵性能優(yōu)良的親本酵母，實(shí)現(xiàn)定向選育優(yōu)良絮凝酵母?，F(xiàn)有獲得絮凝基因的方法是通過PCR獲得(Agric. Biol. Chem. 1991，55 1547-1552)，或者將絮凝酵母基因組酶切后連接4-61Λ左右片段通過功能驗(yàn)證方法獲得 (微生物學(xué)報(bào)，2002,42:110-113)。傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增存在保真性問題，而且擴(kuò)增31Λ以上的片 段時(shí)就難以實(shí)現(xiàn)，即使可以獲得，得到的基因也可能存在點(diǎn)突變，不能保證代表原始菌株的 序列，而且山于絮凝基因存在非常長(zhǎng)的重復(fù)序列，在PCR過程中很難擴(kuò)增。此外，由于該基 因較大，F(xiàn)LOl的啟動(dòng)子區(qū)存在大約51Λ的多種抑制蛋白的結(jié)合區(qū)(EMBO J. 2001,20(18) 5219-31)，因此構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行功能互補(bǔ)的時(shí)候難以包裝完整的片段，從而影響功能鑒 定。而且功能篩選需要進(jìn)行大量重組子的培養(yǎng)和性狀觀察，工作量很大，因此也難以通過功 能互補(bǔ)獲得。因此，本領(lǐng)域仍需要一種獲得絮凝酵母絮凝基因的方法，該方法具有保真性好、篩 選快速的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人首次采用建立R)smid基因組文庫的方法，利用絮凝基因的保守探針進(jìn) 行文庫的PCR篩選，獲得了新的絮凝基因。與傳統(tǒng)的SuperCos載體相比，F(xiàn)osmid文庫構(gòu)建 時(shí)不采用限制性酶切，避免了酶切位點(diǎn)的偏好性，而且其拷貝數(shù)低，更具有穩(wěn)定性。利用PCR 快速篩選，成功獲得了絮凝基因的全長(zhǎng)，該基因長(zhǎng)達(dá)81Λ，如此長(zhǎng)的基因很難通過傳統(tǒng)PCR 手段獲得，也難以通過連接4-61Λ片段進(jìn)行功能互補(bǔ)獲得。由此完成本發(fā)明。本申請(qǐng)一個(gè)目的是提供一種分離的核酸，選自(a)含有SEQ ID N0:1或3所示核 苷酸序列的核酸；和(b)與(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同時(shí)保留了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的絮凝功能的核酸。所述核酸可選自SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :3。
本申請(qǐng)的另一目的是提供一種蛋白質(zhì)，選自(i)含有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(ii)在(i)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或 添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有絮凝功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可以選自SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示的蛋白質(zhì)。本申請(qǐng)也包括編碼本申請(qǐng)所述的蛋白質(zhì)的核酸。本申請(qǐng)?jiān)僖荒康氖翘峁┮环N表達(dá)載體，其含有本申請(qǐng)所述的核酸序列，例如，含有 前述(a)或(b)項(xiàng)的核酸序列，或者含有編碼前述(i)項(xiàng)或(ii)項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的核酸序 列。本申請(qǐng)的表達(dá)載體可含有TPSl啟動(dòng)子或者含有PGKl啟動(dòng)子。當(dāng)含有TPSl啟動(dòng) 子時(shí)，轉(zhuǎn)化了此表達(dá)載體的絮凝酵母誘導(dǎo)型表達(dá)絮凝基因；當(dāng)含有PGKl啟動(dòng)子時(shí)，轉(zhuǎn)化了 此表達(dá)載體的絮凝酵母組成型表達(dá)絮凝基因。誘導(dǎo)型表達(dá)絮凝基因意指在一定的誘導(dǎo)條件 下(例如存在一定的乙醇)表達(dá)絮凝基因；而組成型表達(dá)絮凝基因則意指不需要任何誘導(dǎo) 條件，細(xì)胞從開始生長(zhǎng)即表達(dá)絮凝基因。本申請(qǐng)?jiān)僖荒康氖翘峁┮环N絮凝酵母，其含有本申請(qǐng)所述的表達(dá)載體。本申請(qǐng)的絮凝酵母包括保藏號(hào)為CGMCC 3408或CGMCC 3409的釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)，兩種釀酒酵母已于2009年11月5日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編 100101)。本申請(qǐng)?jiān)僖荒康氖翘峁┮环N獲得絮凝酵母全長(zhǎng)絮凝基因的方法，該方法包括以下 步驟(1)用i^osmid載體構(gòu)建插入片段約為35-401Λ的絮凝酵母基因組文庫；(2)將所獲得 的文庫轉(zhuǎn)染細(xì)菌，平板涂布，經(jīng)鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3) 提取培養(yǎng)的單克隆的DNA，PGR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得含有絮凝基因的陽性 克?。缓?4)對(duì)該陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得該絮凝酵母的絮凝基因。所用細(xì)菌可以是大腸桿 菌等。本申請(qǐng)又一目的是提供一種生產(chǎn)絮凝蛋白的方法，該方法包括構(gòu)建本申請(qǐng)的表 達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化絮凝酵母，和在使轉(zhuǎn)化的絮凝酵母表達(dá)絮凝蛋白的條件下培育 該絮凝酵母，從而生產(chǎn)絮凝蛋白。


圖1顯示絮凝蛋白C-端與模式菌株蛋白的比較。圖2顯示絮凝酵母(左)和破壞子(右)的絮凝性狀。圖3顯示S288C的PGKl啟動(dòng)子電泳圖。圖4顯示S288C的TPSl啟動(dòng)子電泳圖。圖5顯示絮凝基因表達(dá)載體的構(gòu)建。圖6顯示轉(zhuǎn)基因絮凝酵母的絮凝形態(tài)。a，組成型絮凝酵母BHLOl ；b，誘導(dǎo)型絮凝 酵母ZLHOl ；c，含有空載體的游離宿主酵母；d，野生型絮凝酵母S.cerevisiae flo。圖7顯示誘導(dǎo)型絮凝酵母ZLHOl在不同乙醇添加濃度下的絮凝性狀比較。圖下標(biāo) 注的濃度為乙醇濃度(0-8% )，上部為整體培養(yǎng)物圖像，下部為試管底圖像，顯示沉降的細(xì) 胞。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N獲得絮凝酵母的絮凝基因的方法，該方法包括以下步驟(1)用 R)smid載體構(gòu)建插入片段約為35-401Λ的絮凝酵母基因組文庫；( 將所獲得的文庫轉(zhuǎn)染 細(xì)菌，例如大腸桿菌，平板涂布，經(jīng)鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (3)提取培養(yǎng)的單克隆的DNA，PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得含有絮凝基因的 陽性克?。缓廷葘?duì)該陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得該絮凝酵母的絮凝基因。絮凝酵母基因組文庫的構(gòu)建可包括提取絮凝酵母基因組DNA、制備所述長(zhǎng)約 35-40kb的插入片段，以及將該插入片段與R)Smid載體連接等步驟。R)smid載體可從各種 市售途徑獲得，例如，可使用 Copycontrol Fosmid Library Production Kit (Epicentre, USA)提供的R)smid載體?；蚪MDNA的提取以及插入片段的制備可采用常規(guī)的方法實(shí)施。 在將插入片段與i^osmid載體連接前，可先將該插入片段用Klenow片段進(jìn)行末端補(bǔ)平。進(jìn) 一步地，還可通過酚氯仿抽提乙醇沉淀精制該補(bǔ)平的DNA片斷。精制后的DNA片段可經(jīng)過 脈沖場(chǎng)電泳確認(rèn)。可將所獲得的文庫包裝、轉(zhuǎn)染和平板涂布，并鑒定該文庫是否合格。包裝可使用市 售獲得的唾菌體包裝蛋白，如 Copycontrol Fosmid Library Production Kit, Epicentre 體外包裝。然后可轉(zhuǎn)染大腸桿菌，涂布于含有氯霉素的LB平板中。隨機(jī)挑取單克隆接種， 過夜培養(yǎng)，用堿裂解法提取DNA，再用NotI作酶切鑒定，脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)插入片斷的長(zhǎng)度。 根據(jù)涂平板的結(jié)果和插入片斷的長(zhǎng)度，判斷文庫是否合格。PCR擴(kuò)增優(yōu)選使用如SEQ ID NOS :5_8所示的引物。擴(kuò)增所得產(chǎn)物可采用轉(zhuǎn)座子 Tn5隨機(jī)插入目的載體的基因操作方法，利用轉(zhuǎn)座子兩端的引物位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。值得提出的 是，由于絮凝基因內(nèi)部存在很長(zhǎng)的重復(fù)區(qū)，因此常規(guī)測(cè)序技術(shù)很難測(cè)序，通過轉(zhuǎn)座方法可以 克服這一難點(diǎn)，獲得精確的含有較長(zhǎng)重復(fù)區(qū)的基因序列?？刹捎靡韵路椒▽?duì)所獲得的絮凝基因進(jìn)行功能分析通過PCR技術(shù)獲得一段帶有 篩選標(biāo)記和酵母同源區(qū)域的目的基因，通過電轉(zhuǎn)化法，將目的基因?qū)胱孕跄湍福购Y選 標(biāo)記與酵母FLOsc基因發(fā)生同源重組，破壞該基因的功能，得到一株非絮凝的菌株；由于 FLOsc基因破壞后絮凝功能喪失，可以說明該基因負(fù)責(zé)細(xì)胞的絮凝性狀。本申請(qǐng)也涉及絮凝基因的外源組成型表達(dá)，即利用3-磷酸甘油酸激酶(PGKl)的 啟動(dòng)子啟動(dòng)絮凝基因的表達(dá)，構(gòu)建整合表達(dá)載體整合入無絮凝性狀的酵母的HO位點(diǎn)，獲得 發(fā)酵性能提高的新一代絮凝酵母，從而實(shí)現(xiàn)絮凝基因的外源組成型表達(dá)。由于使用整合載 體，該重組酵母培養(yǎng)時(shí)不需要抗生素選擇，而且克服了復(fù)制型載體容易丟失的缺點(diǎn)，遺傳穩(wěn) 定，傳代十次以上均能穩(wěn)定絮凝。本申請(qǐng)也涉及絮凝基因的外源條件性表達(dá)，即利用海藻糖合成酶(TPSl)的啟動(dòng) 子啟動(dòng)絮凝基因的表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體整合入無絮凝性狀的酵母的HO位點(diǎn)，所獲得的酵母 轉(zhuǎn)化子在乙醇生成達(dá)到3%左右開始絮凝，避免了過早過強(qiáng)絮凝導(dǎo)致的對(duì)生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵 的抑制。本申請(qǐng)得到了自絮凝酵母Mccharomyces cerevisiae變種的絮凝基因，并構(gòu)建了 組成型絮凝和誘導(dǎo)型絮凝的新一代絮凝酵母，提高了菌株的耐溫性和發(fā)酵效率。本申請(qǐng)的絮凝基因可用于構(gòu)建應(yīng)用于其它領(lǐng)域的酵母菌株，如重金屬離子吸附，醫(yī)藥蛋白表達(dá)，單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)等。本申請(qǐng)的絮凝基因如SEQ ID NO :1和3所示。本申請(qǐng)包括含有SEQ ID N0:1或 SEQ IDNO :3所示DNA序列的分離的核酸。術(shù)語“分離的”指其所修飾的物質(zhì)至少缺乏某些 其它成分的制品，這些成分也可存在于這些物質(zhì)或類似物質(zhì)天然狀況或最初從其制備時(shí)。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物，并不限于產(chǎn)物的最小長(zhǎng)度。因 此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在該定義中。全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其片段包括在該定義 中。該術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，為了本發(fā)明的 目的，“多肽”指包括天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常性質(zhì)保守)，只要蛋白質(zhì) 維持所需活性。這些修飾可以通過定點(diǎn)誘變?cè)O(shè)計(jì)，或可以是偶然的，例如通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的 宿主突變，或由于PCR擴(kuò)增引起的錯(cuò)誤。術(shù)語“類似物”指具有天然多肽序列和結(jié)構(gòu)，以及相對(duì)于天然分子的一個(gè)或多個(gè)氨 基酸添加、取代(通常性質(zhì)保守)和/或缺失的化合物，只要修飾不破壞衍生該類似物的原 始多肽的活性。制備多肽類似物和突變蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，如下進(jìn)一步所述。特別優(yōu)選的類似物包括性質(zhì)上保守的取代，即這些取代發(fā)生在與它們的側(cè)鏈有 關(guān)的一類氨基酸中。具體而言，氨基酸一般被分成四類(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸； (2)堿性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；C3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例 如，有理由預(yù)測(cè)單獨(dú)用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸 取代蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸取代類似的保守的氨基酸，這樣的取代將不會(huì)對(duì) 生物活性有重要影響。例如，感興趣的多肽可包括多達(dá)約2-6個(gè)保守的或不保守的氨基酸 取代，甚至多達(dá)約5-10個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，或2-10之間任何整數(shù)，只要該分 子的所需功能仍維持完整。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可結(jié)合本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測(cè)定感興趣的分子中可耐受改變的區(qū)域?？捎谩跋嗤浴被颉巴葱浴眮硐薅ū景l(fā)明的多肽或核苷酸序列?！跋嗤浴被颉巴?性”指兩條多核苷酸或多肽序列上準(zhǔn)確的核苷酸對(duì)核苷酸或者氨基酸對(duì)氨基酸對(duì)應(yīng)。通過 排列兩個(gè)分子的序列直接比較它們的序列信息，計(jì)算兩條排列的序列間匹配的準(zhǔn)確數(shù)量， 將其除以最短序列的長(zhǎng)度，然后乘以100，從而可得到相同性百分?jǐn)?shù)。在同源性和相同性分析中可輔助使用易于獲得的計(jì)算機(jī)程序，如ALIGH、Dayhoff、 Μ. 0. (Atlas of Protein Sequence and Structure^ M. 0. Dayhoff 編 輯，5 Suppl. , 3 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC),它適用于 Smith 和 Waterman 分析肽用的局部同源性算法(Advances in App 1. Math.，2 =482-489,1981)。 可從 WisconsinSequence Analysis Package (第 8 版，從 Genetics Computer Group, Madison, WI獲得)獲得測(cè)定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程 序，這些程序也依賴于Smith和Waterman算法。使用制造者建議的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默認(rèn)參數(shù)可容易地使用這些程序。例如，可使用Smith 和Warerman的同源性算法的默認(rèn)計(jì)分表和6個(gè)核苷酸位置的間隔罰分(gap penalty)測(cè) 定的核苷酸序列與參比序列的同源性百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明建立同源性百分?jǐn)?shù)的另一方法是使用版權(quán)屬于愛丁堡大學(xué)、由JohnF. Collins 禾口 Shane S. Sturrok 開發(fā)、由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)發(fā)行 的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在這套程序包中使用，其中，在計(jì)分表中使用默 認(rèn)參數(shù)(例如，間隔開放罰分=12，間隔延伸罰分=1，間隔=6)。從這批數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“匹 配”值反映出“序列同源性”。計(jì)算序列間的相同性百分?jǐn)?shù)或相似性百分?jǐn)?shù)的其它合適的 程序在本領(lǐng)域中一般都是已知的，例如，另一種排列程序是BLAST，使用默認(rèn)參數(shù)。例如，可 使用下述默認(rèn)參數(shù)的BLASTN和BLASTP 基因編碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾=無；鏈=兩；截留=60 ； 期望值=10 ；矩陣=BL0SUM62 ；描述=50個(gè)序列；排序=HIGH SCORE ；數(shù)據(jù)庫=無冗余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS 翻譯 +Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。在 http://www. ncbi. nim. gov/cgi-bin/BLAST網(wǎng)址上可查到這些程序的詳細(xì)描述?；蛘撸谕磪^(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙鏈的條件下進(jìn)行多核苷酸雜交，接著用單鏈 特異性核酸酶消化，然后測(cè)定消化的片段的大小，從而測(cè)出同源性。在如(對(duì)具體的體系所 定義的)嚴(yán)格條件下進(jìn)行的Southern雜交試驗(yàn)中，可鑒別基本同源的DNA序列。確定適當(dāng) 的雜交條件在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所掌握的知識(shí)之內(nèi)。例如，參見Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acid Hybridization,同上。因此，本申請(qǐng)包括與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3具有至少70%、至少75%、至 少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %的序列相同性的核酸。本申 請(qǐng)也包括包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3具有至少70%、至少75%、至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %的序列相同性的核酸的核酸。本申請(qǐng)包括SEQ ID NO 2和4所示的氨基酸序列，以及包含所示氨基酸序列的蛋 白質(zhì)。本申請(qǐng)也包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少70%、至少75%、至少80%、 至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %的序列相同性的氨基酸序列。另一方面，本申請(qǐng)包括編碼在SEQ ID NO :2或4限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺 失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸其具有絮凝蛋白活性的由SEQ ID NO :2或4衍生的蛋白質(zhì)的核 酸。在本申請(qǐng)的蛋白質(zhì)中，也包括在SEQ I D NO :2或4限定的氨基酸序列中經(jīng)過取 代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸其具有絮凝蛋白活性的由SEQ ID NO :2或4衍生的蛋白 質(zhì)。本申請(qǐng)也包括本申請(qǐng)蛋白質(zhì)的編碼序列。本申請(qǐng)包括含有本申請(qǐng)核苷酸序列的表達(dá)載體。本申請(qǐng)的表達(dá)載體可含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列。在本申請(qǐng)的表達(dá)載體中可包含TPSl啟動(dòng)子或PGKl 啟動(dòng)子。本申請(qǐng)也包括含有本申請(qǐng)表達(dá)載體的細(xì)胞或真菌。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述真菌是 酵母，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酵母是釀酒酵母。本申請(qǐng)包括一種生產(chǎn)絮凝蛋白的方法，該方法包括構(gòu)建本申請(qǐng)的表達(dá)載體，用該 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化絮凝酵母，和在使轉(zhuǎn)化的絮凝酵母表達(dá)絮凝蛋白的條件下培育該絮凝酵母， 從而生產(chǎn)絮凝蛋白。在一個(gè)具體身上發(fā)生中，本申請(qǐng)包括利用TPSl啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)絮凝蛋白的方法， 該方法包括構(gòu)建含有TPSl啟動(dòng)子的絮凝基因表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染絮凝酵母，和在 使該啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)絮凝蛋白的條件下培育該絮凝酵母，誘導(dǎo)絮凝蛋白的表達(dá)。下文將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)作出進(jìn)一步的描述。應(yīng)理解，所述實(shí)施例僅僅是闡述性的，而非限制性的。實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑，除非另有說明，都是可從市場(chǎng)上購得常規(guī) 的試劑。實(shí)施例實(shí)施例1 自絮凝酵母基因組中的絮凝基因的獲得1.提取自絮凝酵母基因組DNA用YPD培養(yǎng)基(以g/L計(jì)，葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20)在30°C，150rpm過夜培 養(yǎng)自絮凝酵母S. cerevisiae f Io (中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)CGMCC0587)， 取菌體適量，用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋，然后用細(xì)胞裂解液(1M山梨醇，0. IM乙二胺四乙酸鈉 鹽緩沖液PH7. 5，蝸牛酶5. 5mg/ml)過夜處理，得到自絮凝酵母的全基因組DNA。2.制備基因組文庫插入片段取適量自絮凝酵母的基因組DNA，用DNA破碎儀(Hydro-Siear 0703，美國 GeneMachine)將基因組DNA打斷，然后將片斷化的基因組DNA通過脈沖場(chǎng)電泳分離，在避免 紫外照射的條件下切膠回收35 401Λ的片斷。3.0嫩片斷末端補(bǔ)平與^)81^(1載體連接將回收后的DNA片斷用Klenow片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，并通過酚氯仿抽提乙醇沉淀精 制DNA片斷，精制后的DNA片段經(jīng)過脈沖場(chǎng)電泳確認(rèn)，連入Copycontrol Fosmid Library ProductionKit (Epicentre, USA) 白勺 Fosmid i^#。4.文庫的包裝、轉(zhuǎn)染、平板涂布、鑒定111 ^^ Q (Copycontrol Fosmid Library Production Kit,Epicentre) 體外包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI300，然后涂布于含有氯霉素的LB平板中。隨機(jī)挑取M個(gè)單克 隆接種，過夜培養(yǎng)，用堿裂解法提取DNA，再用NotI作酶切鑒定，脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)插入片斷 的長(zhǎng)度。根據(jù)涂平板的結(jié)果和插入片斷的長(zhǎng)度，判斷文庫是否合格。5.自絮凝酵母基因組文庫的篩選用無菌牙簽挑取單克隆，加入1. 5mL含有氯霉素12. 5 μ g/mL的LB培養(yǎng)基37°C振 蕩過夜培養(yǎng)。每個(gè)樣品取適量，加入終濃度為20%的甘油，在-70°C保存。然后每個(gè)樣品再 取150 μ L，30個(gè)一組混合，99°C煮沸IOmin破菌，取適量做模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。由于絮凝酵母的絮凝基因序列未知，所以嘗試根據(jù)模式菌株的FLOl序列分別設(shè) 計(jì)兩對(duì)PCR篩選引物(CF/CR和NF/NR，其中F代表正向引物，R代表反向引物)，用于在基 因組文庫中篩選自絮凝酵母的絮凝基因，其中CF/CR擴(kuò)增的是絮凝基因C端約11Λ的序列， NF/NR擴(kuò)增的是絮凝基因N端約500bp的序列。CF :5，-GCGGAATTCCCTCTGGTTCTTCTGAGAGC-3，(SEQ ID NO 5)CR :5，-GCGAAGCTTGTAAGCTGTTGGCACTGC-3，(SEQ ID NO 6)NF :5，-GGCGAATTCCTTGAAATTAGCTCGGT -3，(SEQ ID NO 7)NR :5，-GCGAAGCTTGCATATCCATAAGCCAT-3，(SEQ ID NO 8)PCR擴(kuò)增體系模板2 μ L正向引物(CF或 NF) (10pmol/yL)IyL反向引物(CR或 NR) (lOpmol/μ L)IyLIOx 緩沖液2. 5 μ L
dNTP (dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 2. 5mM) Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa) (5U/ μ L) 蒸餾水PCR反應(yīng)條件




權(quán)利要求
1.一種分離的核酸，選自(a)含有SEQID NO :1或SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的核酸；和(b)與(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同時(shí)保留了SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的絮凝功能的核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸為SEQID NO :1或SEQID NO :3。
3.一種蛋白質(zhì)，選自(a)含有SEQID NO :2或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(b)在(a)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 絮凝功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
4.編碼權(quán)利要求3所述的氨基酸序列的核酸。
5.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1、2或4所述的核酸。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有TPSl啟動(dòng)子或者含 有PGKl啟動(dòng)子。
7.一種絮凝酵母，其含有權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體。
8.一種獲得絮凝酵母全長(zhǎng)絮凝基因的方法，該方法包括以下步驟(1)用R)smid載體構(gòu)建插入片段約為35-401Λ的絮凝酵母基因組文庫；(2)將所獲得的文庫轉(zhuǎn)染細(xì)菌，平板涂布，經(jīng)鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于培 養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)提取培養(yǎng)的單克隆的DNA，PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得含有絮凝基 因的陽性克?。缓?4)對(duì)該陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得該絮凝酵母的絮凝基因。
9.一種生產(chǎn)絮凝蛋白的方法，該方法包括構(gòu)建權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化絮凝酵母，和在使轉(zhuǎn)化的絮凝酵母表達(dá)絮凝蛋白的條件下培育該絮凝酵母，從而生產(chǎn)絮凝蛋白。
10.選自保藏號(hào)為CGMCC3408或CGMCC 3409的釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種獲得絮凝酵母的絮凝基因的方法，由此獲得的絮凝基因、其編碼蛋白，含有該絮凝基因的表達(dá)載體、含有該表達(dá)載體的菌株，以及用不同啟動(dòng)子利用此絮凝基因構(gòu)建的新生產(chǎn)菌株。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102086455SQ20091020009
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者李倩, 李凡, 白鳳武, 賀雷雨, 趙心清 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)