專利名稱：一種克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種克隆水稻基因的方法，具體地說，涉及一種克隆水稻復雜性狀相 關聯(lián)基因的方法。
背景技術：
隨著越來越多的植物基因組測序的完成，從大量的基因組數(shù)據(jù)中克隆和挖掘相關 功能基因成為了人們當前的重要工作。農(nóng)作物農(nóng)藝性狀大部分為復雜性狀，如產(chǎn)量、稻米品 質、千粒重、花期、穗長、株高和抗旱性等，都由多個基因共同作用來控制，且每一個基因的 貢獻都比較小。針對這部分性狀的研究，目前多半采用全基因組數(shù)量性狀位點作圖方法來 尋找基因組中對該性狀有貢獻的位點，但要進一步走到克隆相關基因，卻還要面臨難以逾 越的障礙，包括精細定位、數(shù)量性狀的鑒定和單個基因無法表現(xiàn)等。在自然界長期進化中，每一種植物都擁有豐富的生態(tài)表現(xiàn)型，從這些生態(tài)型中挖 掘有利基因成為當前分子生物學的重要內容。目前人們已經(jīng)開發(fā)了許多分子生物技術手 段，利用它們產(chǎn)生的標記來表現(xiàn)物種的多態(tài)性。例如簡單重復序列(SSR)、擴增片段長度多 態(tài)性(AFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)、插入缺失標記QnDel)和單核苷酸多態(tài)性 (SNP)等，但這些技術手段仍難以具體到控制植物發(fā)育的基因上。基因組測序技術的發(fā)展促使多個植物的基因組測序工作的完成，針對基因組序列 已經(jīng)知曉的情況下，人們開發(fā)了一些加快基因組功能研究的新技術。定向誘導基因組局部 突變(TILLING)方法可以直接用來發(fā)現(xiàn)化學誘導突變造成的基因變異(HenikoffS，Till BJ, Comai L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiology. 2004，135(2) :630-636.)，也被用來了解自然群體中個體的多態(tài)性，被稱為 EC0-TILLING。但從當前的研究報告來看，其多態(tài)性僅僅是用來進一步測序驗證的基礎，然后利 用序列分析該位點的多態(tài)性，是單核苷酸多態(tài)性技術的一種延伸。到目前為止，唯一利用該 技術在葫蘆植物中尋找到一個簡單遺傳的抗病基因(Nieto C，Piron F, Dalmais M，Marco CF, Moriones E, Gome ζ -Gu ill amon ML, Truniger V, Gomez P, Garcia—Mas J, Aranda MA, Bendahmane A.EcoTILLING for the identification of allelic variants ofmelon eIF4E, a factor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biology. 2007. 7 34.)，而利用EC0-TILLING技術克隆復雜性狀相關的功能基因是目前需要克服的關鍵技術 難題。另外，人們也發(fā)展了一些分析方法試圖解釋復雜性狀，從而將生物學標記與形態(tài) 性狀聯(lián)系起來。盡管這些技術手段能夠從一些方面反映這些標記在自然狀態(tài)中與某些形態(tài) 性狀相關聯(lián)，但這些標記目前多是基因組中隨機存在的標記，到定位到具體的相關基因還 有相當長的距離。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、低成本、快速克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的 方法。本發(fā)明人針對已經(jīng)完成測序的基因組植物，利用EC0-TILLING分析方法，直接將 CEL I酶酶切后的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，其產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉化為遺傳學標記， 并對自然群體的復雜性狀進行連鎖不平衡分析，來尋找并克隆與復雜性狀相關的基因。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述克隆水稻復雜性狀相關基因的方法，其采用以 基因組序列已公開的水稻自然群體為基礎，采集水稻品種間復雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的 DNA為模板在瓊脂糖電泳上進行EC0-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉化為遺傳學 標記，然后利用關聯(lián)分析軟件進行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關聯(lián)的基因并克隆基因。本發(fā)明選擇已經(jīng)完成了基因組測序并已公開的水稻自然群體，能夠方便地提取基 因組序列。所述復雜性數(shù)據(jù)是該植物在自然栽培條件下或人工模擬自然條件下所采集得到 的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)，如產(chǎn)量、品質、千粒重、花期、株高、穗長和抗旱性等，這些數(shù)據(jù)在個體間呈 連續(xù)分布。所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群體中個體基因組DNA，根據(jù)基因組注釋數(shù) 據(jù)下載各基因家族序列，將研究的目標基因家族設計引物進行PCR，然后以一個常規(guī)品種材 料為對照品種進行PCR產(chǎn)物兩兩混合，經(jīng)過變性復性使雙鏈雜交，最后使用芹菜汁中抽提 純化后的CELI酶對錯配產(chǎn)生的拱環(huán)進行酶切，產(chǎn)生不同大小的片段。所述的遺傳學標記是經(jīng)過CEL I酶酶切后產(chǎn)生的多態(tài)性條帶。CEL I酶酶切后的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，其產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉化為遺傳 學標記。由于自然群體中個體之間基因組序列有差異，EC0-TILLING方法就可以將這種差 異在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)出數(shù)量不同或大小不同的DNA條帶。以對照材料為帶型0，將產(chǎn)生的 不同類型的條帶依次進行編號，作為后面分析用的標記，具體見圖1。所述的關聯(lián)分析軟件是指按照連鎖不平衡分析原理設計的軟件，用來檢測不同位 點等位基因間非隨機連鎖程度。水稻栽培品種主要有秈稻和粳稻兩種亞型，其群體結構q 值為2，可以直接使用免費開放使用的軟件有TASSEL軟件(Http//www. maizeRenetics. net)禾口 EINGENSTART 軟件(http //genepath. med. harvard, edu/ reich/Software. htm) 來分析與性狀相關聯(lián)的基因。本發(fā)明克隆基因采用本領域熟知的方法進行，例如Sambrook等編著的《分子克 隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。先抽提所采集性狀材料的RNA，然后利用反轉錄試劑盒轉換 成第一鏈cDNA，根據(jù)該基因的基因組注釋數(shù)據(jù)設計引物，采用保真度高的DNA聚合酶以第 一鏈cDNA為模板將基因的全長擴增出來，從而得到該基因。實驗證明，本發(fā)明的克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的方法，能夠高效、低成本、快 速地發(fā)現(xiàn)與復雜性狀關聯(lián)的基因。傳統(tǒng)使用的數(shù)量性狀位點(QTL)作圖方法克隆相關基 因，雖能夠找到相關染色體區(qū)段，但仍需構建更大的遺傳群體進行精細定位，并對相關單株 進行性狀鑒定，精細定位后，還需對QTL區(qū)間候選基因逐個進行功能鑒定，工作量大，成本
4高，周期長。由于復雜性狀由多個基因共同控制，每一個基因的效應較低，精細定位準確鑒 定單株十分困難。例如水稻的抗旱性鑒定，單個基因的替換常使水稻的抗旱性喪失。而利 用本發(fā)明的方法，只需要將自然群體中所收集的各種生態(tài)型的品種進行相關的形態(tài)性狀的 調查，然后對不同基因家族進行EC0-TILLING分析，利用TASSEL和EINGENSTART軟件分析 相關基因，并從相應的生態(tài)型品種中進行克隆。這樣免去構建需要龐大工作量的遺傳群體 和精細定位，也不用考慮遺傳群體中單個個體的性狀丟失，明顯縮短基因克隆時間，降低成 本。本發(fā)明方法對加快植物復雜性狀相關基因的克隆具有重要意義。本發(fā)明還可以對microRNA—類基因進行相關分析，發(fā)現(xiàn)該方法也完全適用于以 基因組序列為基礎的非蛋白質編碼基因的克隆和功能發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的方法也同樣適用于其他農(nóng)作物或植物的 復雜性狀相關聯(lián)基因的克隆。


圖1為從芹菜汁中提取的CEL I酶在SDS-PAGE上電泳圖。1，D2000標記；2_8，粗 提的CEL I酶稀釋5倍后分別上樣4-10 μ 1。圖2為所收集的水稻抗旱品種的EC0-TILLING瓊脂糖凝膠電泳結果。圖2Α為CEL I酶切前PCR電泳結果，圖2Β為CEL I酶切后電泳結果。圖2Β下方的數(shù)字代表該帶型所轉 化的標記號。圖3-1、3-2、3-3、3_4為所鑒定的4個與抗旱相關的基因在5個不同品種在干旱脅 迫處理后相對表達量結果?！扒啊北硎疚催M行處理直接取樣，“中”表示20% PEG 6000處理 3小時取樣，“后”表示脅迫后復水8小時后取樣抽提RNA，然后分別對這4個基因進行實時 熒光定量PCR。其中，242代表超級旱稻2-9，195代表SALAK，220代表頂30358，冊3代表滬 旱3號，Sl代表深水稻1。
具體實施例方式下面實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。下列實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下面實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1用本發(fā)明的方法克隆與水稻抗旱性相關聯(lián)的基因水稻的抗旱性是典型的復雜性狀，有多個基因控制并與環(huán)境協(xié)作，通過QTL定位 作圖方法發(fā)現(xiàn)了 200多個位點控制水稻抗旱性。收集了國內外150份各種抗旱品種，在人 工抗旱鑒定設施上對這些品種進行抗旱性狀的鑒定并克隆相關基因。1.水稻品種田間試驗及性狀調查表型試驗在田間梯度水分鑒定島上進行。所有供試品種種子(150種品種)浸種催 芽至露白后播種育秧，并按正常田間管理方式插秧，單行種植。采用隨機區(qū)組設計，3重復， 種植2行，每行18株，按行株距20cmX 20cm種植。試驗于5月沈日播種，6月23日移栽， 7月31號開始干旱脅迫，8月31號恢復灌水?？疾旎巨r(nóng)藝性狀、抗旱指數(shù)和抗旱級別。
抗旱指數(shù)=(待測品種干旱脅迫處理產(chǎn)量/待測品種未干旱脅迫處理處 理)X (對照品種未干旱脅迫處理產(chǎn)量/對照品種脅迫處理產(chǎn)量)。其抗旱級別分為1-9 級，1級表示抗旱指數(shù)> 1. 30，3級為1. 00-1. 29，5級為0. 90-0. 99，7級為0. 70-0. 89，9級 為抗旱指數(shù)< 0. 69。2.水稻DNA抽提按照CTAB 法(Cetyl trie thy lammonium bromide)提取水稻葉片總 DNA。DNA 沉 淀物用lmol/L NaCl溶解，并用RNase A過夜處理；用95%乙醇、76%乙醇、95%乙醇依次 處理，純化DNA ；TE溶解DNA，-20°C保存。對所選材料進行DNA濃度測定，并根據(jù)PCR反應 體系，統(tǒng)一稀釋到約20ng/ul。3. CEL I酶的粗提試驗用芹菜由超市購得。取芹菜鮮嫩莖，去根莖，洗凈，擦干。榨汁機榨取芹菜汁 液并去除殘渣，加入BufferA，2600g離心20min，棄沉淀。取上清緩慢加入固體(NH4) 2S04粉 末至濃度為25%，并輕輕攪拌30min，13000-16200g離心45min，棄沉淀。取上清緩慢加入 固體(NH4) 2S04粉末至濃度為80%，并輕輕攪拌30min，13000-16200g離心1. 5h，棄上清。加 入BufTerB并懸浮沉淀。BufferB透析過夜，前三次每隔Ih換一次透析液，最后一次透析過 夜。最后將提取物分裝儲存于_80°C備用。BufferA IOOmmo 1/L Tris-HCl, pH 7. 7，100 μ mol/L PMSF (苯甲基磺酰氟)。BufferB IOOmmol/L Tris-HCl, pH 7. 7,0. 5mol/L KC1，100 μ mol/LPMSF。4. EC0-TILLING技術的PCR反應體系及后期處理從水稻基因組數(shù)據(jù)庫中下載轉錄因子AP2/EREBP、heat shocktranscription factor (HSF)、GROWTH-RE⑶LATING FACTOR(GRF)、Alfin-like、CCAAT-HAP3 和 ZIM 家族 220 個基因啟動子序列，設計并合成引物。其20yL PCR反應體系2yL 10X反應緩沖液，IyL 2匪ol/μ LdNTP混和液， 1 μ L 10ymol/y L F 弓丨物，1 μ LlO μ mol/μ L R 弓丨物，IU ExTaq(購自 Takara 公司)DNA 聚 合酶，4 μ L 20ng/ul DNA 模板，11 μ LddH2O。PCR 擴增程序-MV 4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C IOmin ； 10°C保存。擴增時根據(jù)不同引物的Tm值調節(jié)退火溫度，擴增反應在Hykiid MBS 0. 2S PCR 儀上進行。對照品種為日本晴，與其它品種兩兩混合。雜交程序95°C IOmin ；95°C降至 850C (-20C /s) ；85°C 降至 25°C (_0. 1°C /s) ；10°C保存。雜交反應在 Hykiid MBS 0. 2S PCR 儀上進行。CEL I酶切體系及反應條件10 μ L雜交PCR產(chǎn)物，3 μ L 10Χ反應緩沖液 (IOOmmol/L Tris-HCl,pH 7. 7,0. 5mol/L KCl)，1 μ L CEL 1,16μ L ddH20?；靹蚝笾糜赑CR 儀中45°C反應30min。擴增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠分離。5. EC0-TASSEL分析與抗旱相關聯(lián)基因將電泳分離開的電泳條帶按照各種帶型進行統(tǒng)計，帶型統(tǒng)計方法按照圖2所 示，對每一個品種進行標記，然后將這些數(shù)據(jù)和抗旱級別數(shù)據(jù)按照TASSEL(Http://WWW. maizegenetics. net)軟件要求輸入，分別對轉錄因子 AP2/EREBP、HSF、GRF、Alfin-like, CCAAT-HAP3和ZIM家族220個基因啟動子多態(tài)性進行關聯(lián)分析，以P < 0. 001為顯著相關，具體結果見表1。表1干旱處理下轉錄因子啟動子與抗旱性狀的關聯(lián)分析結果
權利要求
1.一種克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的方法，其特征在于，其采用以基因組序列已公 開的水稻自然群體為基礎，采集水稻品種間復雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的DNA為模板在瓊 脂糖電泳上進行EC0-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉化為遺傳學標記，然后利 用關聯(lián)分析軟件進行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關聯(lián)的基因并克隆基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群體 中個體基因組DNA，根據(jù)基因組注釋數(shù)據(jù)下載各基因家族序列，將研究的目標基因家族設計 引物進行PCR，然后以一個常規(guī)品種材料為對照品種，進行PCR產(chǎn)物兩兩混合，經(jīng)過變性復 性使雙鏈雜交，最后使用芹菜汁中抽提純化后的CEL I酶對錯配產(chǎn)生的拱環(huán)進行酶切，產(chǎn)生 不同大小的片段。
3.根據(jù)權利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的遺傳學標記是經(jīng)過CELI酶酶切 后產(chǎn)生的多態(tài)性條帶。
4.根據(jù)權利要求3所述方法，其特征在于，CELI酶酶切后在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳。
5.根據(jù)權利要求1-4任意一項所述方法，其特征在于，所述復雜性數(shù)據(jù)是在自然栽培 條件下或人工模擬自然條件下所采集得到的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)產(chǎn)量、品質、千粒重、花期、株 高、穗長和抗旱性，這些數(shù)據(jù)在個體間呈連續(xù)分布。
6.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述方法，其特征在于，所述的關聯(lián)分析軟件為TASSEL 軟件和EINGENSTART軟件。
7.根據(jù)權利要求2所述方法，其特征在于，所述對照品種采用水稻日本晴。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種克隆水稻復雜性狀相關聯(lián)基因的方法。其采用以基因組序列已公開的水稻自然群體為基礎，采集水稻品種間復雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的DNA為模板在瓊脂糖電泳上進行ECO-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉化為遺傳學標記，然后利用關聯(lián)分析軟件進行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關聯(lián)的基因并克隆基因。本發(fā)明的克隆水稻復雜性狀相關基因的方法，能夠高效、低成本、快速地發(fā)現(xiàn)與復雜性狀關聯(lián)的基因。本發(fā)明的方法對加快植物復雜性狀相關基因的克隆具有重要意義。
文檔編號C12N15/10GK102094001SQ200910200208
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權日2009年12月10日
發(fā)明者余舜武, 吳金紅, 廖鳳賢, 羅利軍, 黎佳佳 申請人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心