專利名稱：一種乳源性抗氧化活性肽及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乳源性抗氧化活性肽及其組合物。
背景技術(shù)：
牛乳是一種成分復(fù)雜的生物流體，其中蛋白質(zhì)含量為30_35g/L，主要由酪蛋白和 乳清蛋白組成，其中酪蛋白約占80%，乳清蛋白約占20%。牛乳蛋白質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)上是優(yōu)質(zhì)的 全價(jià)蛋白質(zhì)，蘊(yùn)藏著多種生物活性肽片段。機(jī)體攝入的蛋白質(zhì)并非全部在腸道內(nèi)被徹底降 解成游離氨基酸才能為人體吸收利用，蛋白質(zhì)在消化過(guò)程中釋放出的大量肽類物質(zhì)，也有 可能被機(jī)體直接吸收并對(duì)人體的生理機(jī)能具有特殊的調(diào)節(jié)作用。某些生物活性肽進(jìn)入體內(nèi) 后，還可產(chǎn)生類似激素類活性物質(zhì)的作用。研究人員已從牛乳蛋白的酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具 有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗血栓、礦物質(zhì)結(jié)合、抗氧化、抗菌和抗病毒等作用的活性肽類物質(zhì)并 鑒定了其結(jié)構(gòu)。自由基是人體生命活動(dòng)過(guò)程中生物化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物。正常情況下，機(jī)體內(nèi)自 由基的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害。但當(dāng)自由基和活性氧基 團(tuán)(ROS)的產(chǎn)生過(guò)量時(shí)，或者隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體正常的氧化還原平衡被破壞；脂類，蛋 白質(zhì)和DNA就會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞并引起機(jī)體的損傷衰老， 這也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病發(fā)生的重要因素。通常把具有抑制生物大分子過(guò)氧化或清除體內(nèi)自由基功能的生物活性肽稱為抗 氧化肽。隨著人們對(duì)食品安全和合成抗氧化劑安全問(wèn)題的日益關(guān)注，天然抗氧化肽因?yàn)榫?有較強(qiáng)的抗氧化性和高安全性，近年來(lái)已成為各國(guó)科研人員研究的熱點(diǎn)。然而到目前為止， 研究人員能夠了解結(jié)構(gòu)并進(jìn)行相關(guān)機(jī)理研究的天然抗氧化肽僅僅限于肌肽、谷胱甘肽等少 數(shù)抗氧化肽，而研究更多的是各種天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化性的低分子混和肽。 同時(shí)由于自由基生命科學(xué)的發(fā)展，具有抗氧化作用的功能性食品和藥物也引起了眾多研究 人員的關(guān)注，肌肽、谷胱甘肽以及大豆肽的抗氧化作用也逐漸顯示出它們?cè)卺t(yī)藥、食品、飼 料等領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。Sati^-Gracia等Q000)發(fā)現(xiàn)乳清蛋白中的乳鐵傳遞蛋白對(duì)鐵具有親合力，特別 是在富含鐵的嬰兒食品中能夠抑制由鐵催化的氧化作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白的 抗氧化活性可能是由于其提供了氫原子還原自由基以及來(lái)源于半胱氨酸的游離的巰基基 團(tuán)抑制了脂類的自動(dòng)氧化。Rival等O001)研究發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及 胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的酪蛋白酶解物對(duì)亞油酸具有抑制活性。其中β-酪蛋白的 f (33-48) ^Pf (169-176)片段對(duì)亞油酸具有較高的抑制活性，而β _酪蛋白的f (177-183) 片段則對(duì)酶誘導(dǎo)的亞油酸氧化卻幾乎沒(méi)有作用。Rival等O001)采用3種不同的方法研 究了合成肽的氨基酸序列和抗氧化活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明與其結(jié)構(gòu)相似的化合物，如 肌肽(β-Ala-His)既有自由基清除活性又有抑制脂氧合酶的能力。Suetsuna，Ukeda和 Ochi (2000)從酪蛋白酶解物中分離得到Tyr-Phe-Tyr-Pr0-Glu-Leu，深入研究發(fā)現(xiàn)其C端 的二肽Glu-Leu序列對(duì)羥基自由基和DPPH自由基清除具有重要影響。Hermindez-Ledesma等Q005)研究了由corolase PP水解β _乳球蛋白獲得的肽，其中一個(gè)序列為Trp-Tyr-S er-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile的肽，具有比BHA更高的抗氧化活性。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的抗氧化肽數(shù)量少，抗氧化活性低， 抗氧化途徑不清的缺陷，提供一種新的抗氧化活性肽。本發(fā)明人通過(guò)木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白，酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)分離純化等處理步驟獲得 一種肽，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化功能，并分析了其氨基酸序列，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種乳源性抗氧化活性肽，其氨 基酸序列是組氨酸-異亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。本發(fā)明所述的乳源性抗氧化活性肽的制備方法，可以是常規(guī)的人工合成方法，即 通過(guò)全氨基酸序列合成而得。也可以采用基因工程技術(shù)，即利用重組的生物工程菌生產(chǎn)而 得。或者由乳清蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶水解，從酶解產(chǎn)物中分離而得。本發(fā)明還提供含有所述的乳源性抗氧化活性肽的組合物，至少包括一種活性 成分為所述的乳源性抗氧化活性肽和一種載體，所述的載體可以是藥用載體、食用載體 和/或者化妝品用載體。所述的乳源性抗氧化活性肽在組合物中的含量可以是0.1 99. 9 (wt) %。 本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供了乳源性的抗氧化活性肽， 經(jīng)體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示具有良好的抗氧化活性，水溶性好，安全性高可以應(yīng)用于食品、 化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。本發(fā)明方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)乳清蛋白的綜合利用和提高其附加值具有重要 的意義。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是乳清蛋白酶解反應(yīng)物的凝膠層析譜圖。其中，1 5表示第1至第5個(gè)洗脫 峰。圖2是乳抗氧化肽的半制備型RP-HPLC圖譜。其中，1 6表示第1至第6個(gè)洗脫 峰。圖3是乳抗氧化肽的分析型RP-HPLC圖譜。圖4是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS —級(jí)圖譜。圖5是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS 二級(jí)圖譜。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述 的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例1酶解乳清蛋白1、采用酶反應(yīng)器進(jìn)行酶解反應(yīng)
(1)乳清蛋白溶解將IOOOmL蒸餾水加入酶解反應(yīng)器中，升溫至最佳溫度45°C，稱取40g乳清分離蛋 白(美國(guó)哥倫比亞公司)，在磁力攪拌下緩慢加入水中，用2MNa0H調(diào)節(jié)pH6. 5，在45°C的條 件下使乳清分離蛋白全部溶解，使酶解反應(yīng)器中乳清分離蛋白的濃度為4% (w/v)。(2)酶角軍按照酶量為底物(乳清分離蛋白)的2. 2 (wt) %的比例(500U/g酶)，加入木瓜蛋 白酶，維持反應(yīng)溫度為45°C，并通過(guò)ZDJ-4A自動(dòng)電位滴定儀滴加2M的NaOH維持酶解液的 pH6. 5恒定，酶解時(shí)間為3. 5h。2、離心將酶解液加熱至100°C，IOmin進(jìn)行滅酶，然后冰浴快速冷卻至室溫，用2M鹽酸調(diào) 酶解液至PH 7. 0，有沉淀析出，以IOOOOrpm離心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。3、超濾將離心后的酶解物上清液用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，收集分子量小 于5000Da的組分。將濾過(guò)液減壓濃縮后，采用LABC0NC0凍干機(jī)真空冷凍干燥。凍干品置 于-20°C貯存?zhèn)溆谩?shí)施例2凝膠過(guò)濾層析將實(shí)施例1中所得的凍干品用蒸餾水溶解，配制成濃度為lOmg/mL的溶液， 12，OOOXg 離心 15min，上清液用于凝膠過(guò)濾色譜(gel fiItrationchromatography，GFC) 分離。凝膠過(guò)濾色譜參數(shù)如下色譜柱*kphadexG-15柱(1.6cmX72cm)，用20mM醋酸-醋 酸鈉緩沖液平衡；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ；進(jìn)樣量為IOmL ；洗脫液為20mM的醋酸-醋酸鈉緩沖 液，流速為0. 5mL/min ；自動(dòng)分布收集器收集洗脫峰。凝膠層析圖譜見(jiàn)圖1，從圖1可見(jiàn)有5 個(gè)洗脫峰組分。合并每次收集的相同洗脫峰組分凍干，對(duì)所得的每種組分分別進(jìn)行抗氧化 活性測(cè)定。實(shí)施例3DPPH自由基清除能力的檢測(cè)2，2-二苯基-1-苦胼基自由基(2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl,DPPH)分析法 是一種篩選自由基清除劑的簡(jiǎn)便方法。DPPH自由基在有機(jī)溶劑中由于苯環(huán)的共軛和位阻效 應(yīng)以及硝基的吸電子作用是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，溶液顏色為紫色；其結(jié)構(gòu)中 含有3個(gè)苯環(huán)，其中1個(gè)氮原子上有1個(gè)孤對(duì)電子，在517nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除 劑存在時(shí)，DPPH自由基的孤對(duì)電子被配對(duì)而使溶液顏色變淺，反應(yīng)結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定；而且 這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈量效關(guān)系。若樣品能將DPPH自由基清除，則表明樣品 具有降低羥基自由基、烷基自由基或超氧陰離子自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反 應(yīng)的作用。因此，可以通過(guò)此波長(zhǎng)處吸光度的變化來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除情況， 從而評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。將2mL 0. 2mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液加入到含有2mL樣品溶液的潔凈試管中，混 勻。室溫下放置30min后，于517nm處測(cè)定吸光值。清除率(%) = [I-(Ai-Aj)/A0] X 100%A0為2mL 0. 2mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液，加2mL的樣品溶劑時(shí)測(cè)得的吸光值，為空 白對(duì)照；Ai為2mL 0. 2mM的DPPH無(wú)水乙醇溶液，加2mL的樣品時(shí)測(cè)得的吸光值；
Aj為2mL無(wú)水乙醇，加2mL的樣品時(shí)測(cè)得的吸光值。分別將實(shí)施例2分布收集的洗脫液P1_P5(第一至第五個(gè)峰)組分凍干，用蒸餾水 稀釋到相同濃度，按照上述方法測(cè)定抗氧化活性。P1-P5組分的DPPH自由基清除率分別為 29. 1%,37. 4%,40. 6%,53. 3%和 30. 2%。P1-P5 均有一定的抗氧化活性，P4 > P3 > P2 > P5 > P1，P1和P2清除率較低，小于分離前的樣品峰。P4組分的自由基清除能力最強(qiáng)，抗氧 化活性最高，相對(duì)于其它峰抗氧化活性較顯著。收集抗氧化活性最強(qiáng)的P4組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，將濃縮液經(jīng)真空冷凍干 燥后得到凍干品。 實(shí)施例4RP-HPLC純化(反相-高效液相色譜)1、半制備型 RP-HPLC將實(shí)施例3制得的抗氧化活性最強(qiáng)的P4組分凍干品用蒸餾水溶解后經(jīng)高速離 心機(jī)12，OOOXg離心15min，再過(guò)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后，用半制備型RP-HPLC進(jìn)行純化。 RP-HPLC的分離純化條件半制備型柱(UBondapakQ8 19mmX 300mm)；流動(dòng)相A，5%乙腈， 含0.05%三氟乙酸(TFA)出，80%乙腈，含0.05%1 六；檢測(cè)波長(zhǎng)220歷，流速1111171^11，進(jìn) 樣量2mL。梯度洗脫程序?yàn)?0 5min，100% A ;5 20min，100% A 40% B ；20 30min， 40% B 100% B ；30 40min，100% B ；40 50min，100% B 100% A ；50 55min，100% Α。所述百分比為體積百分比。半制備型RP-HPLC圖譜見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，將待分離的P4組分經(jīng)半制備型 RP-HPLC分離后主要得到6個(gè)洗脫峰組分，分別收集并冷凍干燥后測(cè)定其抗氧化活性。結(jié) 果如下:P1(27. 5% ), P2(42. 5% )，P3 (61. 3% ), P4 (40. 8% ), P5(31. 7% ), P6 (24. 5% )。 其中第3個(gè)洗脫峰組分的抗氧化活性最強(qiáng)P3 (61. 3%)0從梯度洗脫程序看，在此區(qū)域內(nèi)采 用的是降低流動(dòng)相極性(即降低流動(dòng)相中水的含量)的線性梯度洗脫。2、分析型 RP-HPLC將半制備型RP-HPLC分離得到抗氧化活性最強(qiáng)的第3個(gè)洗脫峰組分收集凍 干；繼續(xù)用分析型RP-HPLC分離。RP-HPLC的分離純化條件分析型柱(μ Bondapak C18 3.9_X30(toim)；流動(dòng)相A，5 % 乙腈，含 0. 05 %三氟乙酸(TFA) ；B，80 % 乙腈，含 0. 05 % TFA ；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，流速lmL/min，進(jìn)樣量2mL。梯度洗脫程序?yàn)? 5min，100% A ;5 20min, 100% A 40% B ；20 30min，40% B 100% B ；30 40min，100% B ；40 50min， 100% B 100% A ；50 55min，100% Α。所述百分比為體積百分比。分析型RP-HPLC圖譜見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)，獲得了單一的1個(gè)洗脫峰組分。實(shí)施例5結(jié)構(gòu)鑒定(1)質(zhì)譜分析將實(shí)施例4分析型RP-HPLC純化后的洗脫峰組分采用 MALDI-T0F-T0F-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜分析參數(shù)如下激光源波長(zhǎng)355nm =YAG激光器， 加速電壓20kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 100 800。質(zhì)譜儀的分析軟件采用4700Explorer TM Software。MALDI-T0F-T0F-MS的一級(jí)圖譜見(jiàn)圖4，二級(jí)圖譜見(jiàn)圖5。由圖4，5中可以看出，質(zhì) 譜圖中大部分出現(xiàn)的是b和y系列碎片，這驗(yàn)證了肽鏈中酰胺鍵較容易斷裂的推斷，其中 豐度較強(qiáng)的主要離子峰都可以從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行解釋。此外，堿性氨基酸對(duì)肽鍵斷裂也有特殊 的作用，它們的質(zhì)子親和能較高，具有使質(zhì)子在肽鏈或碎片上定位的傾向。如果精氨酸在肽鏈的N端，碎裂中傾向于產(chǎn)生N端離子，精氨酸在C端則傾向于產(chǎn)生C端離子。由于木瓜 蛋白酶水解作用的專一性較強(qiáng)，只斷裂賴氨酸或精氨酸羧基末端參與形成的肽鍵，精氨酸 應(yīng)在肽鏈的C末端。因此，質(zhì)譜圖中應(yīng)是y系列的離子(圖4)。經(jīng)過(guò)軟件分析并標(biāo)注(圖 5)，可以看出在此區(qū)域內(nèi)顯示H(His)、I (lie)、R(Arg) 3種氨基酸的多個(gè)相關(guān)特征離子峰， 其中分別標(biāo)注為H、I和R的3個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的是這3種氨基酸的亞氨正離子的質(zhì)荷比。由于 L(Leu)與I (Ile)的相關(guān)特征離子峰是完全相同的。因此，圖5中的離子峰可能是I。在得 到肽段的氨基酸殘基種類的信息之后，運(yùn)用De Novo Explorer分析軟件對(duì)這幾種氨基酸排 列的順序進(jìn)行分析。經(jīng)過(guò)分析，我們認(rèn)為這個(gè)抗氧化肽的氨基酸序列為HI(L)R,分子質(zhì)量 為425.28Da。由于軟件無(wú)法區(qū)分L(Leu)與I (lie)。因此，必須結(jié)合氨基酸組成分析的結(jié) 果進(jìn)一步確定，這樣才能最后確定該抗氧化肽氨基酸的種類和數(shù)量。(2)氨基酸序列分析將實(shí)施例4分析型RP-HPLC純化后的組分用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組成分 析。結(jié)果表明該抗氧化肽主要由組氨酸(His，H)，異亮氨酸(lie，I)和精氨酸(Arg，R)組 成，相對(duì)摩爾比例為1 1 1，相對(duì)分子質(zhì)量為425. ^Da。綜上所述，本發(fā)明根據(jù)質(zhì)譜分析和氨基酸組成分析結(jié)果兩方面確證分離得到的乳 抗氧化肽的氨基酸序列為MR(His-Ile-Arg)。
權(quán)利要求
1.一種乳源性抗氧化活性肽，其特征在于，其氨基酸序列是組氨酸-異亮氨酸-精氨酸。
2.含有如權(quán)利要求1所述的乳源性抗氧化活性肽的組合物，其特征在于，至少包括一 種活性成分為所述的乳源性抗氧化活性肽和一種載體。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述的載體是藥用載體、食用載體和/或 者化妝品用載體。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述的乳源性抗氧化活性肽在組合物中 的含量是0. 1 99. 9 (wt) %。
5.氨基酸序列是組氨酸-異亮氨酸-精氨酸的小肽作為抗氧化活性肽的應(yīng)用。
全文摘要
一種乳源性抗氧化活性肽及其組合物。該乳源性抗氧化活性肽的氨基酸序列是組氨酸-異亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。經(jīng)體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示，其具有良好的抗氧化活性，可以應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A23L1/305GK102093469SQ200910200320
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者劉志東, 劉振民, 王蔭榆, 郭本恒 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司