專利名稱：HER2過量表達的mRNA原位雜交檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子病理診斷領域，尤其涉及一種在臨床樣本中檢測乳腺癌患者人表 皮生長因子受體2(HER2)基因過量表達的RNA原位雜交(ISH)檢測試劑盒。
背景技術：
乳腺癌嚴重地威脅著人們的健康，幾乎所有人群的乳腺癌發(fā)病率都在上升，平均 每年約升高1 %，估計全球每年發(fā)病患者超過100萬，衛(wèi)生部2008年發(fā)布的《第三次全國死 因調(diào)查主要情況》顯示，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢，且發(fā)病人 群越來越年輕。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)全世界每年約有140萬婦女罹患乳腺癌，有40 萬婦女死于乳腺癌。在我國，乳腺癌已成為居女性惡性腫瘤死亡率的首位，上海乳腺癌發(fā)病 率居全國之首，高達60/10萬人。同時衛(wèi)生部發(fā)布的最新調(diào)查報告顯示，乳腺癌已成為我國 上升幅度最快的惡性腫瘤之一，患者數(shù)量在過去30年間上升了 96%，升幅僅次于肺癌，發(fā) 病高危人群以45 55歲左右女性為主。目前乳腺癌發(fā)病快速上升的原因尚不十分清楚，一般認為與遺傳、生殖因素、精 神環(huán)境因素、西方化的生活方式等有關。但病理研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌與人類表皮生長因子受 體-2(HER2)關系密切。HER2是由HER2原癌基因表達產(chǎn)生，是一種存在于乳腺癌細胞表面。 與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展密切相關的蛋白質。作為原癌基因，HER2表達的是一個危險信號和因 素，它的狀態(tài)預示了患者存活的時間較短、患者更容易復發(fā)以及治療效果等。如果不治療， HER2陽性乳腺癌患者存活時間是1 3年，而HER2陰性的患者至少能存活4 6年。據(jù) 統(tǒng)計，大約有20% 30%的乳腺癌患者出現(xiàn)HER2 (人類表皮生長因子受體2)陽性現(xiàn)象，其 HER2蛋白表達增加，HER2的過度表達往往預示著對內(nèi)分泌治療不敏感、腫瘤進展快、容易 發(fā)生復發(fā)和轉移。每個乳腺癌患者的疾病進展情況不完全一樣，一旦確診為乳腺癌，應立即進行 HER2病理檢測，使臨床醫(yī)生能夠全面地判定患者乳腺癌的狀態(tài)和類型，以便實施有效的個 體化靶向治療。在臨床上，大約有一小部分的HER2陽性的乳腺癌細胞也表達雌激素和孕激 素受體，然而，受體的數(shù)量大大少于HER2陰性的乳腺癌細胞。因此，HER2陽性的患者對他 莫西芬等內(nèi)分泌治療藥物不敏感，這不僅給HER2陽性乳腺癌患者的治療帶來了麻煩，而且 也使患者復發(fā)的可能性大大增加。臨床亦證實，與一般的乳腺癌患者相比，HER2陽性乳腺 癌患者的癌細胞生長更為迅速，短期內(nèi)容易出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)和轉移，生存期縮短。因此，為 了抓住最佳治療時機，乳腺癌的患者都應該進行HER2檢測；在歐美國家，所有乳腺癌患者 確診都會做HER2檢測，以排查惡化速度更快的癌癥，這也是國外乳腺癌患者治療更合理、 生存質量更高的重要原因。通常，臨床上采用免疫組織化學方法(IHC)，顯色原位雜交法(CISH)或熒光染色 體原位雜交法(FISH)檢測HER2的過量表達。如果乳腺癌患者手術后的病理診斷報告上， 注明免疫組織化學方法(IHC)檢測結果為(+++)，即顯色原位雜交法(CISH)檢測結果為陽 性，或熒光染色體原位雜交法(FISH)檢測結果為陽性，那么，她就是HER2陽性乳腺癌患者。如果IHC檢測結果為(++)，建議再做FISH或CISH檢測。對于這種免疫組織化學方法(IHC) 檢測結果為臨界狀態(tài)的患者(++)，必須再重新做一遍以確定其是否為HER2陽性。但相同方 法的重復存在著缺乏可比性和對照性的缺點，亟需更多的方法來檢測HER2的過表達來幫 助我們確診HER2陽性乳腺癌患者，以便及早的開展個體化的治療方案。原位雜交技術(In situ hybridization, ISH)是分子生物學、組織化學及細胞 學相結合而產(chǎn)生的一門新興技術，始于20世紀60年代。1969年美國耶魯大學的Gall 等(1969)首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時 Buongiorno-Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組 織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發(fā)展，特 別是20世紀70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，為原位雜交 技術的發(fā)展奠定了深厚的技術基礎。原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射 性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結 合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置 顯示出來。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA雜 交。RNA原位雜交經(jīng)常被用于檢測動物或植物組織中某種特定基因的mRNA的分布狀況，以 了解該基因的表達模式。RNA原位雜交主要是利用堿基互補原理，將體外合成的帶有標記的 單鏈反義mRNA與組織或細胞中特定基因的mRNA發(fā)生雜交，從而將反義探針定位在特定基 因的表達區(qū)域內(nèi)，并根據(jù)顯色信號的強弱來確定基因的表達量。目前市場上還沒有利用RNA原位雜交技術進行HER2過量表達檢測的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
為了提供一種新的HER2過量表達檢測方法，為臨床提供更多的診斷依據(jù)，以便快 速準確的篩查HER2陽性乳腺癌患者，本發(fā)明提供了一種可檢測HER2的mRNA的檢測產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種人表皮生長因子受體2 (HER2)基因過量表達的RNA原位雜交檢 測試劑盒，包括固定液、PBS-Buffer I、PBS-Buffer II、PBS-BufferIII、消化液、預雜交 液、雜交液、Washing Buffer I、Washing Buffer II、緩沖液I、緩沖液II、封閉液、顯色液 I、顯色液II、陽性對照組織玻片。所述的雜交液為含有特異性探針的預雜交液，所述的特異性探針為單鏈反義RNA 探針，是根據(jù)HER2 mRNA序列設計的特異引物經(jīng)RT-PCR得到的cDNA，再經(jīng)體外轉錄獲得； 所述的特異引物序列如下HER2 正向引物序列為GATGCCCAACCAGGCGCAGAT 2 Ibp ；HER2 反向引物序列為ACCAGCTGCACCGTGGATGTCAG 23bp ；所述的特異性探針序列為CUACGGGUUGGUCCGCGUCUACGCCUAGGACUUUCUCUGCCUCGACUCCUUCCACUUCCACGAACCUA GACCGCGAAAACCGUGUCAGAU⑶UCCC⑶AGACCUAGGGACUACCCCUCUUACACUUUUAAG⑶CACCGGUAGUU UCACAACUCCCUUUU ⑶⑶ AGGGGGUUUCGGUU ⑶ UUCUUUAGAAUCUGCUUCGUAUGCACUACCGACCACACCCG AGGGGUAUACAGAGGGCGGAAGACCCGUAGACGGACUGUAGGUGCCACGUCGACCA 276bp。
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所述的特異性探針在轉錄過程中摻入了地高辛(DIG)標記的核糖核酸。所述的固定液為無RNA酶的PBS配制的4%的多聚甲醛(pH7. 4)。所述的PBS-Buffer I 為經(jīng) DEPC 處理的由 140mmol/LNaCl、2. 7mmolKCl、IOmmol/ LNa2HPO4 和 1. 8mmol/L KH2PO4 組成的 ρΗ7· 4 的緩沖液。所述的PBS-Buffer II 是含 100mmol/L 甘氨酸的 PBS-Buffer I。所述的PBS-BufferIII 是含 0. 3% TritonX-IOO 的 PBS-Buffer I。所述的消化液是由TE 緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，5(kimol/LEDTA，pH8. 0)配制 的不含RNA酶的20 μ g/ml蛋白酶K溶液。所述的預雜交液為由50 %去離子甲酰胺、20XSSC、50X Denhardt和0. Img/ mltRNA組成的溶液。所述的Washing Buffer I 為含有 300mol/LNaCl 和 30mol/L 檸檬酸鈉(pH7. 0)的溶液。所述的Washing Buffer II 為含有 150mmol/LNaCl 和 15mmol/L檸檬酸鈉(ρΗ7. 0) 的溶液。所述的緩沖液I 為含 100mmol/LTris-HCl 和 150mmol/L NaCl (pH 7. 5)的溶液。所述的緩沖液II 為含 100mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl 和 50mmol/L MgCl2 (ρΗ9· 5)的溶液。所述的封閉液為含Trix-IOO和NSS的緩沖液I。所述的顯色液I為含Trix-100、NSS和抗地高辛抗體堿性磷酸酶復合物的緩沖液 I。所述的顯色液II為由緩沖液II配制的快紅溶液。所述的陽性對照組織玻片為顯色原位雜交法(CISH)或熒光染色體原位雜交法 (FISH)檢測HER2過表達的HER2陽性乳腺癌患者病理切片。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點和效果①本發(fā)明雜交液中的探針為單鏈反義RNA探針，是以cDNA為模板，在RNA聚合酶 的作用下，通過體外轉錄而獲得的。這種探針與切口平移標記的DNA探針相比，特異性高， RNA-RNA形成的雜交分子具有熱穩(wěn)定性，而且探針的大小也比較恒定，因而增加了雜交的敏 感性及均一性。此反義RNA探針不含有載體順序，減少了非特異性雜交，還能防止dsDNA中 第二條鏈的競爭性雜交。雜交后用RNA酶消化單鏈未雜交的探針，可明顯減少本底。②本發(fā)明雜交液中的探針是一種單鏈探針，避免了應用雙鏈cDNA探針做雜交反 應時存在的兩條之間的復性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn) 定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應后可用RNA酶處理，以 除去未結合的探針。由于cRNA探針具有以上這些優(yōu)點，cRNA探針的雜交飽和水平又比雙 鏈DNA探針高出8倍。③本發(fā)明雜交液中的探針采用地高辛標記，與放射性核素標記探針相比，其具有 安全、無放射性污染，穩(wěn)定性好，顯色快而易于觀察等特點。地高辛標記的探針不僅具有生 物素標記的優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干擾 等缺點，增強了檢測的特異性。④探針設計的位置選擇在跨內(nèi)含子的部位，避免了檢測mRNA時基因組序列的干擾，就是能檢測到mRNA，但檢測不到基因組序列，因此能夠特異的檢測出HER2基因mRNA的量。⑤具高度敏感性和特異性。⑥檢測設備簡單，無需熒光顯微鏡，普通顯微鏡即可進行鏡檢?？傊甿RNA原位雜交技術靈敏度高，特異性好，可特異的檢測基因mRNA，即檢測此 基因的表達情況。可以作為對顯色原位雜交法(CISH)或熒光染色體原位雜交法(FISH)檢 測HER2過表達檢測的參考，豐富了 HER2基因表達檢測方法，為確診HER2陽性乳腺癌患者 提供了參考依據(jù)。


附圖為RT-PCR擴增的HER2探針片段的電泳圖左側泳道為MARK，從上至下的條 帶大小為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；右側泳道為擴增的HER2特異探針片 段，大小為276bp。
具體實施例方式應當理解，下面實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員 常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠 商所建議的步驟和條件。實施例1 引物設計與探針的合成根據(jù)HER2基因核苷酸序列(N0.M11730)設計用于RT-PCR的特異引物，序列如下HER2 正向引物序列為GATGCCCAACCAGGCGCAGAT 2 Ibp ；HER2 反向引物序列為ACCAGCTGCACCGTGGATGTCAG 23bp。以Trizol法抽提的人血液RNA為模板進行RT-PCR擴增，得到探針特異片段，如 圖=RT-PCR擴增的HER2探針片段的電泳圖；RT-PCR擴增所得的特異性序列如下GATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGAT CTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAA AGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGC TCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGT 276bp0并將上述RT-PCR擴增得到的探針片段克隆到T載體中，用限制性內(nèi)切酶線性化質 粒并純化，用RNA聚合酶37°C體外轉錄并摻入DIG標記的核糖核苷酸。序列如下CUACGGGUUGGUCCGCGUCUACGCCUAGGACUUUCUCUGCCUCGACUCCUUCCACUUCCACGAACCUAG ACCGCGAAAACC ⑶⑶ CAGAUGUUCCCGUAGACCUAGGGACUACCCCUCUUACACUUUUAAG ⑶ CACCGGUA ⑶ UUC ACAACUCCCUUUUGUGUAGGGG⑶UUCG⑶UGUUUCUUUAGAAUCUGCUUCGUAUGCACUACCGACCACACCCGAGG GGUAUACAGAGGGCGGAAGACCCGUAGACGGACUGUAG⑶GCCACGUCGACCA 276bp。引物委托專業(yè)公司(生工)合成，其中引物為PAGE純化。擴增序列如表1 表1.特異性引物序列序列名稱寡核苷酸序列(5’ -3’ )堿基長度(bp)逆轉錄引物ττττττττττττττττττ18HER2正向引物GATGCCCAACCAGGCGCAGAT21HER2反向引物ACCAGCTGCACCGTGGATGTCAG23轉錄反應體系如表2 表2.探針體外轉錄體系
試劑名稱加樣量Transcription buffer(5x)4μ LDTT(IOOmM)2μ LRnase inhibitor(40U)0. 5μ LLinear DNA6μ L10XDIG Mix2μ LSP6 RNA Polymerase 20U/ulIuL0. 1% DEPC Millipore H2O補足至20 μ L實施例2 試劑配制1.固定液為無RNA酶的PBS配制的4%的多聚甲醛(pH7. 4)。2. PBS-Buffer I 為經(jīng) DEPC 處理的由 140mmol/LNaCl、2. 7mmolKCl、IOmmol/ LNa2HPO4 和 1. 8mmol/L KH2PO4 組成的 ρΗ7· 4 的緩沖液。3. PBS-Buffer II 含 100mmol/L 甘氨酸的 PBS-Buffer I。4. PBS-BufferIII 含 0. 3% TritonX-IOO 的 PBS-Buffer I。5.消化液由 TE 緩沖液(100mmol/L Tris-HCl, 50mmol/LEDTA,pH8. 0)配制的不 含RNA酶的20 μ g/ml蛋白酶K溶液。6.預雜交液 為由 50%去離子甲酰胺、20XSSC、50XDenhardt 和 0. lmg/mltRNA 組成的溶液。7. Washing Buffer I 為含有 300mol/LNaCl 和 30mol/L 檸檬酸鈉(pH7. 0)的溶液。8. Washing Buffer II 為含有 150mmol/LNaCl 和 15mmol/L 檸檬酸鈉(ρΗ7· 0)的溶液。9.緩沖液 I 為含 100mmol/L Tris-HCl 和 150mmol/L NaCl (pH 7. 5)的溶液。10.緩沖液 II 為含 100mmol/L Tris-HClU00mmol/L NaCl 禾Π 50mmol/LMgCl2 (ρΗ9· 5)的溶液。11.封閉液為含iTrix-IOO和NSS的緩沖液I。12.顯色液I 為含Trix-100、NSS和抗地高辛抗體堿性磷酸酶復合物的緩沖液 I。13.顯色液II為由緩沖液II配制的快紅溶液。14.陽性對照組織玻片為顯色原位雜交法(CISH)或熒光染色體原位雜交法 (FISH)檢測HER2過表達的HER2陽性乳腺癌患者病理切片。實施例3 試劑盒的使用1.組織切片處理1) 二甲苯于37°C脫蠟2次，每次15分鐘；2)無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；3) 95 %乙醇浸泡2次，每次3分鐘；4) PBS-Buffer I 清洗 2 次，每次 3 分鐘；5) PBS-Buffer II 清洗 2 次，每次 3 分鐘；6)加入消化液，37°C孵育20分鐘；7) PBS-BufferI11 清洗 2 次，每次 5 分鐘；8)固定液處理10分鐘；9) PBS-Buffer I 清洗 2 次，每次 5 分鐘；2.預雜交加入預雜交液，50°C孵育1小時；3.雜交加入雜交液，50°C孵育過夜。4.洗脫Dffashing Buffer I 清洗 2 次，每次 15 分鐘；2) Washing Buffer II 清洗 2 次，每次 15 分鐘；3)緩沖液I處理2次，每次5分鐘；4)封閉液孵育15分鐘；5.顯色1)加入顯色液I，37°C處理2小時；2)緩沖液I處理2次，每次5分鐘；3)緩沖液II處理2次，每次5分鐘；4)加入顯色液II，避光孵育3小時；5)緩沖液II處理2次，每次15分鐘；6.封片1)脫水用75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度脫水；2)透明二甲苯浸洗一次；3)常規(guī)用樹脂膠封片，保存。7.鏡檢序列表0103]<110>上海裕隆臨床檢崔i中心有限公司0104]<120>HER2過量表達的mRNA原位雜交檢測試劑羞0105]<160>30106]<210>10107]<211>2760108]<212>RNA0109]<213>人屬(HOMO)0110]<400>10111]cuacggguugguccgcgucuacgccuagga cuuucucugccucgacuccuuccacuucca600112]cgaaccuagaccgcgaaaaccgugucagau guucccguagaccuagggacuaccccucuu1200113]acacuuuuaaggucaccgguaguuucacaa cucccuuuuguguaggggguUUCggUUgUU1800114]ucuuuagaaucugcuucguaugcacuaccg accacacccgagggguauacagagggcgga2400115]agacccguagacggacuguaggugccacgu cgacca2760116]<210>20117]<211>210118]<212>DNA0119]<213>人工序列0120]<220>0121]<223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設計，以用作HER2過量表達的
mRNA原位雜交檢測試劑盒中擴增檢測HER2正向引物。<400>2gatgcccaac caggcgcaga t21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對原理和基因芯片雜交條件設計，以用作HER2過量表達的 mRNA原位雜交檢測試劑盒中擴增檢測HER2反向引物。<400>3accagctgca ccgtggatgt cag23
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權利要求
1.一種人表皮生長因子受體2基因過量表達的RNA原位雜交檢測試劑盒，包括固定 液、PBS-Buffer I、PBS-Buffer II、PBS-Buffer III、消化液、預雜交液、雜交液、Washing BufferI, Washing Buffer II、緩沖液I、緩沖液II、封閉液、顯色液I、顯色液II、陽性對照 組織玻片。
2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的雜交液為含有特異性探針的預 雜交液，所述的特異性探針為單鏈反義RNA探針，是根據(jù)HER2mRNA序列設計的特異引物經(jīng) RT-PCR得到的cDNA，再經(jīng)體外轉錄獲得；所述的特異引物序列如下HER2 正向引物列為GATGCCCAACCAGGCGCAGAT 2 Ibp ； HER2 反向引物序列為ACCAGCTGCACCGTGGATGTCAG 23bp ； 所述的特異性探針序列為CUACGGGUUGGUCCGCGUCUACGCCUAGGACUUUCUCUGCCUCGACUCCUUCCACUUCCACG AACCUAGACCGCGAAAACC ⑶⑶ CAGAUGUUCCCGUAGACCUAGGGACUACCCCUCUUACACUUU UAAG⑶CACCGGUA⑶UUCACAACUCCCUUUUGUGUAGGGG⑶UUCG⑶UGUUUCUUUAGAAUC UGCUUCGUAUGCACUACCGACCACACCCGAGGGGUAUACAGAGGGCGGAAGACCCGUAGACGGA CUGUAG⑶GCCACGUCGACCA276bp。
3.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的特異性探針是在轉錄過程中摻 入了地高辛標記的核糖核酸。
4.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的固定液為無RNA酶的PBS配制， pH7. 4的4%的多聚甲醛；所述的 PBS-Buffer I 為經(jīng) DEPC 處理的由 140mmol/LNaCl、2. 7mmolKCl、IOmmol/ LNa2HPO4 和 1. 8mmol/L KH2PO4 組成的 ρΗ7· 4 的緩沖液；所述的 PBS-BufferII 是含 100mmol/L 甘氨酸的 PBS-Buffer I ； 所述的 PBS-BufferIII 是含 0. 3% TritonX-100 的 PBS-Buffer I ； 所述的消化液是由TE緩沖液配制的不含RNA酶的20 μ g/ml蛋白酶K溶液； 所述的預雜交液為由50%去離子甲酰胺、20XSSC、50XDenhardt和0. lmg/mltRNA組 成的溶液；所述的Washing Buffer I為含有300mol/LNaCl和30mol/L檸檬酸鈉，pH7. 0的溶液； 所述的 Washing BufferII 為含有 150mmol/LNaCl 和 15mmol/L 檸檬酸鈉，pH7. 0 的溶液；所述的緩沖液 I 為含 lOOmmol/UTris-HCl 禾Π 150mmol/LNaCl, pH 7. 5 的溶液； 所述的緩沖液 II 為含 100mmol/L Tris-HClU00mmol/L NaCl 和 50mmol/L MgCl2, pH9. 5 的溶液；所述的封閉液為含Trix-100和NSS的緩沖液I ；所述的顯色液I為含Trix-100、NSS和抗地高辛抗體堿性磷酸酶復合物的緩沖液I ； 所述的顯色液II為由緩沖液II配制的快紅溶液；所述的陽性對照組織玻片為顯色原位雜交法或熒光染色體原位雜交法檢測HER2過表 達的HER2陽性乳腺癌患者病理切片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于乳腺癌患者HER2(人表皮生長因子受體2)基因過量表達的RNA原位雜交(ISH)檢測的試劑盒，屬于分子病理診斷領域。該試劑盒包括固定液、PBS-BufferI、PBS-BufferII、PBS-BufferIII、消化液、預雜交液、雜交液、Washing BufferI、WashingBufferII、緩沖液I、緩沖液II、封閉液、顯色液I、顯色液II、陽性對照組織玻片。本發(fā)明通過檢測HER2基因的表達量，可以作為診斷陽性乳腺癌患者的參考依據(jù)，對乳腺癌的早期診斷和個體化用藥的制定有重要的臨床價值。
文檔編號C12Q1/68GK102094070SQ20091020037
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2009年12月11日
發(fā)明者汪寧梅, 穆宇豪, 穆海東, 黎颯 申請人:上海裕隆臨床檢驗中心有限公司