專利名稱：按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶cxyI1基因及其表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶 cxyll (Codon bias optimized xyll)基因及其表達。
背景技術(shù)：
木聚糖是半纖維素的重要組成部分，廣泛存在于植物細胞壁中，是一種重要的可 再生資源。由于木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，要徹底降解木聚糖需要多種酶的共同參與和協(xié)同。降解 時起主要作用的酶為2類(1)木聚糖酶(endo-1，4-β-Xylanases，EC 3.2.1.8)可以特異 的切斷β _1，4木糖苷鍵，使木聚糖降解為低聚木糖和木糖，是木聚糖降解過程中最關(guān)鍵的 酶。(2)0-0-木糖苷酶(0-0-巧1081(1￡1%工0 3. 2. 1.37)，作用于寡聚木糖的還原端，并釋 放出木糖，屬外切酶。木聚糖酶具有重要的潛在應(yīng)用價值，自20世紀80年代以來，木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域 不斷擴大。目前，木聚糖酶已成功應(yīng)用于制漿造紙、食品、飼料、醫(yī)藥等工業(yè)中。(1)植物纖 維是造紙的主要原料，在造紙工業(yè)中，利用木聚糖酶進行紙漿漂白，可以減少氯的用量，降 低環(huán)境污染；( 木聚糖酶的分解產(chǎn)物低聚木糖是一種功能性低聚糖，具有良好的酸堿穩(wěn) 定性和耐熱性，適用于不同食品中，其甜度僅為蔗糖的40%，食用后不會導(dǎo)致血漿中葡萄糖 含量大幅度上升，因而可以作為糖尿病或肥胖癥患者的甜味劑；C3)飼料中添加木聚糖酶 可以把聚合度較高的木聚糖降解為聚合度較低的小分子片段，破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)，將細胞 壁束縛的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，和動物消化道內(nèi)的消化酶充分接觸，從而提高各種養(yǎng)分的消 化率。(4)隨著現(xiàn)代化工業(yè)的快速發(fā)展，能源短缺問題日益嚴重，尋找新的能源已迫在眉睫。 植物纖維的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中半纖維素約占植物干質(zhì)量的35%， 是自然界中僅次于纖維素含量的第二豐富可再生資源。木聚糖酶可與其它酶協(xié)同將植物纖 維降解為戊糖和己糖，然后將戊糖和己糖作為發(fā)酵底物，進一步通過微生物作用生產(chǎn)乙醇， 作為工業(yè)生產(chǎn)直接利用的能源，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，并且可減少對環(huán)境的污染，促進自 然界碳素循環(huán)。目前木聚糖酶的生產(chǎn)主要依靠真菌、細菌等微生物的發(fā)酵。畢赤酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達系統(tǒng)，許多有活性的蛋白質(zhì)已經(jīng)在畢赤 酵母系統(tǒng)中大量表達。畢赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能以甲醇為唯一碳源 生長。畢赤酵母表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)，可以對表達的蛋白質(zhì)進行加工折疊和修飾，還 具有發(fā)酵方法成熟、發(fā)酵密度高、培養(yǎng)簡單廉價、外源蛋白質(zhì)既可以胞內(nèi)積累又可分泌；表 達產(chǎn)量高、背景蛋白質(zhì)少、易于表達產(chǎn)物純化等優(yōu)點，是生產(chǎn)木聚糖酶的較為理想的表達系 統(tǒng)。而且，偏愛密碼子的使用能夠較大幅度提高基因的表達水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶cxynll基因及其表達，以使所述基因在畢赤酵母中表達出高比活的木聚糖酶。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶cxynll基因，采用連續(xù)延伸PCR方法 合成，其核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。所述優(yōu)化的木聚糖酶cxynll基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。本發(fā)明按照畢赤酵母偏愛密碼子對原始的xyll進行改造，改造后的基因序列與 原序列(GenBank Accession No. X98518)同源性為76% (參見圖1)，其編碼的蛋白質(zhì)含 162個氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)化的木聚糖酶cxynl 1基因合成采用連續(xù)延伸PCR方法制備而成熊 愛生等，A simple, rapid, high fidelity and cost-effective PCR-basedtwo-step DNA synthesis (PTDS)method for long gene sequences,核酸研究，2004，32 :e98。使用的引 物如下Pl:TCTGTCTCCATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGGCAACTTC GTTGCTGGTAAGGP2 :TGMGGMCCAGAGTAGTTGACAGTTCTTCTAGCACCGTTAGCCCMCCCTTACCAGCMCGMGTTGCP3 :TCMCTACTCTGGTTCCTTCMTCCTTCTGGTMCGCTTACCTGACTTTGTACGGTTGGACTGCTMCCCP4 :AGGTCTGTAGGTTCCCCAGTTGTCMCGATGTAGTACTCMCCAGAGGGTTAGCAGTCCMCCGTACAAP5 :TTGTACGGTTGGACTGCTMCCCACTGGMCCTACMGGGTACTGTCACCTCCGATGGTGGMCCTACGP6 :CTTGGTTCCTTCMCAGMGGAGCGTTGACTCTAGTAGTTTGATAGACATCGTAGGTTCCACCATCGGAP7 :TCCTTCTGTTGMGGMCCMGACCTTCMCCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCMGAGMCTGGTGP8 :CCGTATCTAGCCCMGCATCGMGTGGTTGCCAGCAGTGATGGMCCACCAGTTCTCTTGGACTGTCTP9 :ACTTCGATGCTT腳CTAGATACOTATGCCTCTGGGTTCCTTCMCTACTACATGATCATGGCTACTGAPlO CGCGAGCTCTTAGGAAACAGAGATGGAAGAGGAACCAGAGGACTGGTATCCTTCAGTAGCCATGA TCATGTAGTAGTT回收PCR擴增產(chǎn)物，使其與pMD18-T載體相連(Takara)，4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn) 化DH5ci感受態(tài)中，獲得陽性克隆。抽取該陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)BioI和McI雙酶切后，通過 T4DNA連接酶與畢赤酵母表達載體pYPX88 (invitrogen)連接，酶切鑒定和序列測定獲得了 含有目的基因的重組質(zhì)粒載體pYPX88-CXynIl。包含所述優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因的重組質(zhì)粒pYPX88-CXynIl載體，成功應(yīng)用 于畢赤酵母表達中，可以在畢赤酵母中表達出高比活的木聚糖酶。1.利用電擊法將上述重組質(zhì)粒pYPX88-CXynIl載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌 (Pichia pastoris, strain GS115, invitrogen)中，篩選到的菌株經(jīng) lwt% 甲醇搖瓶誘導(dǎo) 7 后，上清中表達量達到0. 05mg/mL,酶活達到254. 9U/mL。最適pH為5. 5，最適反應(yīng)溫度 為50°C。Km值和最大反應(yīng)速率分別為llmg/mL、10000U mg-lmin-1。有益效果本發(fā)明的按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的cxyll基因可以在畢赤酵母中表達出高 比活的木聚糖酶，在制漿造紙、食品、飼料、醫(yī)藥等工業(yè)有廣泛的應(yīng)用潛力。


圖1為本發(fā)明優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因和原始的xyll基因的序列比對圖。圖2為本發(fā)明的用于畢赤酵母表達的pYPXSS-cxynll載體。圖3為本發(fā)明優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白分子 量標準；1為表達的Cbo-xynll蛋白。圖4為pH值對本發(fā)明優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因的活性影響。圖5為溫度對本發(fā)明優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因的活性影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
來進一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明實施中未注明的實驗方法，如連接、轉(zhuǎn)化、相關(guān)培養(yǎng)基的配制等參照分 子克隆實驗指南第三版(黃培堂等譯，中國，科學(xué)出版社，200 和畢赤酵母表達手冊 (invitrogen)中方法進行。未注明的化學(xué)藥品為分析純級，購自上海國藥集團有限公司。實施例1密碼子優(yōu)化木聚糖酶基因的合成本發(fā)明根據(jù)來源于鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. S38)的xyll序列 (GenBankAccession No. X98518)，采取連續(xù)延伸PCR方法合成按照畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu) 化的木聚糖酶cxyll基因。由上海生物工程有限公司合成10條引物，用于木聚糖酶cxyll 基因的合成。在50 μ L反應(yīng)體系中，內(nèi)側(cè)引物(Ρ2-Ρ9)的添加量為10ng，外側(cè)引物(P1，P10) 添加量為 lOOng，擴增條件為94°C預(yù)熱 IOmin ；94°C, 30s, 54°C, 30s, 72°C, 40s, 35 個循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin。使用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)擴增 目的基因。P1TCTGTCTCCATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGGCAACTTC GTTGCTGGTAAGGP2:TGMGGMCCAGAGTAGTTGACAGTTCTTCTAGCACCGTTAGCCCMCCCTTACCAGCMCGMGTTGC
P3 :TCMCTACTCTGGTTCCTTCMTCCTTCTGGTMCGCTTACCTGACTTTGTACGGTTGGACTGCTMCCC
P4:AGGTCTGTAGGTTCCCCAGTTGTCMCGATGTAGTACTCMCCAGAGGGTTAGCAGTCCMCCGTACAA
P5:TTGTACGGTTGGACTGCTMCCCACTGGMCCTACMGGGTACTGTCACCTCCGATGGTGGMCCTACG
P6:CTTGGTTCCTTCMCAGMGGAGCGTTGACTCTAGTAGTTTGATAGACATCGTAGGTTCCACCATCGGA
P7:TCCTTCTGTTGMGGMCCMGACCTTCMCCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCMGAGMCTGGTG
P8:CCGTATCTAGCCCMGCATCGMGTGGTTGCCAGCAGTGATGGMCCACCAGTTCTCTTGGACTGTCT
P9 :ACTTCGATGCTT 腳 CTAGATACOTATGCCTCTGGGTTCCTTCMCTACTACATGATCATGGCTACTGA
PlO CGCGAGCTCTTAGGAAACAGAGATGGAAGAGGAACCAGAGGACTGGTATCCTTCAGTAGCCATGA
TCATGTAGTAGTT按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化合成的木聚糖酶cxyll基因的開放閱讀框為489堿 基，不包含保護堿基和酶切位點。通過DNAMAN軟件進行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該合成序列 與原序列(GenBank Accession No. X98518)同源性為76% (參見圖1)，其編碼的蛋白質(zhì)共 162個氨基酸。實施例2
木聚糖酶cxyll基因在畢赤酵母中的分泌表達一、畢赤酵母表達載體的構(gòu)建1. 5wt%瓊脂糖膠回收實例1中的PCR擴增產(chǎn)物，取10 μ L與pMD18_T載體相連。 4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)中，獲得陽性克隆。抽取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)BioI和McI 雙酶切后，以正確的閱讀框插入到畢赤酵母表達載體ΡΥΡΧ88中，測序驗證，得到重組質(zhì)粒 pYPX88-CxyIl載體(參見圖幻。相關(guān)的DNA回收試劑盒、載體、連接酶、核酸內(nèi)切酶均購自 Takara公司，DH5 α感受態(tài)由本實驗室保存。二、畢赤酵母的轉(zhuǎn)化挑取劃線培養(yǎng)的GS115(mut+his-，invitrogen)單克隆接種到 IOmL YPD, 30°C, 225rpm培養(yǎng)過夜，取ImL轉(zhuǎn)接到IOOmL新鮮YPD中繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3- 至0D600 = 0. 5， 5000rpm離心收集菌體。用等體積重蒸水洗滌兩次后，加入ImL預(yù)冷的山梨醇懸浮菌體，即 可作為畢赤酵母感受態(tài)。大量抽取重組質(zhì)粒pYPX88-CxyIl載體DNA，經(jīng)bglII線性化后，用電擊法轉(zhuǎn)入感受 態(tài)細胞。用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數(shù)2. 5kV，25 μ F。電擊結(jié)束后，立即加入 1. OmL預(yù)冷的1. Omol/L山梨醇，取200 μ L涂布于SD_his培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)3_4天至轉(zhuǎn) 化子出現(xiàn)。由于受體酵母為His缺陷型(His-)，在不加His的基本培養(yǎng)基上不生長，只有整 合得到的重組酵母才能正常生長。通過這一標記，篩選得到各質(zhì)粒大量的His+轉(zhuǎn)化子。三、畢赤酵母的篩選與誘導(dǎo)表達采用小規(guī)模發(fā)酵篩選活性高的轉(zhuǎn)化子，具體操作方法為接種單個轉(zhuǎn)化子到含 有 50 μ L BMMY(10g/L 酵母提取物、20g/L 蛋白胨、13. 4g/L YNB、0. 4mg/L 生物素、Iwt % 甲 醇)的96孔板中，28°C，225rpm振蕩培養(yǎng)他，加入反應(yīng)底物樺木木聚糖(sigma)，37°C反應(yīng) 30min，然后用DNS法測定酶的活性。選取活性相對較高的轉(zhuǎn)化子，接種到50mL BMGY(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白 胨、13. 4g/L YNB,0. 4mg/L生物素、10g/L甘油)，培養(yǎng)至0D600 = 2_3時，離心收集菌體，然 后加入等體積BMMY誘導(dǎo)72h，其間每隔1 補加甲醇至終濃度lwt%。表達的目的蛋白分泌 在上清液中，因此誘導(dǎo)完成后，12000rpm，離心IOmin收集上清。吸取10 μ L上清用12wt% SDS-PAGE進行電泳檢測，結(jié)果參見圖3，分析得到蛋白質(zhì)的表達量為0. 05mg/mL。上清用pH =5. 5檸檬酸-磷酸二氫鈉稀釋600倍后用于酶活力的測定。實施例3木聚糖酶cxyll基因在畢赤酵母表達產(chǎn)物的酶活測定一、木聚糖酶cxyll基因的活力測定酶活測定采用DNS法。具體實施方法如下取600倍稀釋的酶液50yL，加入Iwt %樺木木聚糖50 μ L，置50°C水浴保 溫lOmin，然后加入DNS試劑150 μ L于沸水浴中顯色反應(yīng)8min，迅速冷卻至室溫，使用 infiniteM200多功能酶標儀(TECAN)測定MOnm處比色測定光吸收值的變化。根據(jù)木糖標 準曲線計算木聚糖酶的活力。相關(guān)試劑的配制DNS試劑稱取酒石酸鉀鈉182. 0g，溶于500mL蒸餾水中，加熱(不超過50°C )，于 熱溶液中依次加入3,5- 二硝基水楊酸6. 3g，NaOH 21. 0g，苯酚5. 0g，無水亞硫酸鈉5. Og,攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至IOOOmL,用玻璃漏斗過濾，濾液貯存于棕色瓶中， 室溫放置7天后使用，有效期為6個月。木糖標準曲線吸取Iwt %木糖(sigma)溶液 30 μ L、40 μ L、50 μ L、60 μ L、70 μ L、 80 μ L、90 μ L、100y L，用緩沖液定容到 lmL，配制成濃度為 0. 3mg/mL,0. 4mg/mL,0. 5mg/mL、 0. 6mg/mL、0. 7mg/mL、0. 8mg/mL,0. 9mg/mL、l. Omg/mL木糖標準溶液。分別吸取上述濃度木糖 標準溶液50 μ L，代替酶液參與反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定540nm的光吸收值。以木糖濃度為Y 軸，光吸收值為X軸，繪制標準曲線。其中，酶活力單位(U)的定義在該反應(yīng)條件下，以每分鐘產(chǎn)生Iymol還原糖所需 的酶量定義為1個單位。二、木聚糖酶cxyll基因的性質(zhì)測定最適pH值測定在不同pH緩沖液下進行酶促反應(yīng)，緩沖液分別為檸檬酸-磷酸二 氫鈉(pH 2. 5-8.0)，甘氨酸-氫氧化鈉(pH> 8.0)，然后按照DNS法測定酶的活性。測得 cxyll木聚糖酶的最適pH值為5. O (參見圖4)。最適反應(yīng)溫度在最適pH，不同溫度Q0-80°C )下進行酶促反應(yīng)，然后按照DNS法 測定酶的活性。測得cxyll木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50°C (參見圖5)。Km值和最大反應(yīng)速率的測定分別用不同濃度(5,7. 5，10，12. 5，15，17. 5，20mg/ mL)的樺木木聚糖為底物，50°C、pH 5. 5測定酶活性，利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值和最 大反應(yīng)速率，分別為 llmg/mL、10000U mg-lmin-1。附本發(fā)明涉及到的核苷!酸/氨基酸序列表如下
<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因及其表達
<160>1
<170>PatentIn version3. 3
<210>SEQ ID No 1
<211>489
<212>DNA
<213> 鏈霉菌(Streptomyces sp. S38)
<400>1
ATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGG50
CAACTTCGTTGCTGGTAAGGGTTGGGCTAACGGTGCTAGAAGAACTGTCA100
ACTACTCTGGTTCCTTCAATCCTTCTGGTAACGCTTACCTGACTTTGTAC150
GGTTGGACTGCTAACCCTCTGGTTGAGTACTACATCGTTGACAACTGGGG200
AACCTACAGACCTACTGGAACCTACAAGGGTACTGTCACCTCCGATGGTG250
GAACCTACGATGTCTATCAAACTACTAGAGTCAACGCTCCTTCTGTTGAA300
GGAACCAAGACCTTCAACCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCAAGAGAAC350
TGGTGGTTCCATCACTGCTGGCAACCACTTCGATGCTTGGGCTAGATACG400
GTATGCCTCTGGGTTCCTTCAACTACTACATGATCATGGCTACTGAAGGA450
TACCAGTCCTCTGGTTCCTCTTCCATCTCTGTTTCCTAA489
<210>SEQ ID No 2
<211>162
<212>PRT
<213> 鏈霉菌(Streptomyces sp. S38)
<400>2
METAsnLeuAlaSerGlyGlySerTyrGlyThrSerTrpThrAsn15
CysGlyAsnPheValAlaGlyLysGlyTrpAlaAsnGlyAlaArg30
ArgThrValAsnTyrSerGlySerPheAsnProSerGlyAsnAla45
TyrLeuThrLeuTyrGlyTrpThrAlaAsnProLeuValGluTyr60
TyrlleValAspAsnTrpGlyThrTyrArgProThrGlyThrTyr75
LysGlyThrValThrSerAspGlyGlyThrTyrAspValTyrGln90
ThrThrArgValAsnAlaProSerValGluGlyThrLysThrPhe105
AsnGlnTyrTrpSerValArgGlnSerLysArgThrGlyGlySer120
IleThrAlaGlyAsnHisPheAspAlaTrpAlaArgTyrGlyMET135
ProLeuGlySerPheAsnTyrTyrMETIleMETAlaThrGluGly150
TyrGlnSerSerGlySerSerSerIleSerValSer16權(quán)利要求
1.一種按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶CxyIl基因，其特征在于，所述基因采 用連續(xù)延伸PCR方法合成，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述優(yōu)化的木聚糖酶cxyl1基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.包含權(quán)利要求1所述優(yōu)化的木聚糖酶cxyll基因的pYPX88-CXynIl載體。
4.權(quán)利要求3所述的pYPXSS-cxynll載體在畢赤酵母表達中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述pYPXSS-cxynll載體的蛋白質(zhì)表達量 為 0. 05mg/mLo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的木聚糖酶cxyI1基因及其表達。所述優(yōu)化的木聚糖酶cxyI1基因采用連續(xù)延伸PCR方法合成，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述基因全長489bp，編碼162個氨基酸。通過將該基因序列構(gòu)建到畢赤酵母表達載體并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中表達，可用于木聚糖酶的生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/84GK102108366SQ20091020067
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 高峰 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院