專利名稱：：巢氏pcr支原體檢測用引物組、檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及巢氏PCR支原體檢測用引物組、檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑O.2um)并獨立生活的微生物，約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6-8.0)，對酸耐受性差，對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。細(xì)胞培養(yǎng)(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染是個世界性問題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。國內(nèi)外研究表明，95%以上的污染是由以下四種支原體引起口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii)。但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時污染兩種以上的支原體。支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。目前檢測有無支原體污染的方法主要有①相差顯微境檢測；②熒光染色法；③電鏡檢查；④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法，但上述方法有的精確度不夠，有的則方法過于復(fù)雜。巢式PCR檢測支原體的方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測快速，但是現(xiàn)有的巢氏PCR支原體檢測試劑盒有對實驗環(huán)境要求嚴(yán)格，實驗成本相對較高，有時還會出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一套快速檢測支原體的巢氏PCR支原體檢測引物組及試劑盒。本發(fā)明的另外目的在于提供巢氏PCR支原體檢測試劑盒的使用方法及其應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一種巢氏PCR支原體檢測用引物組，包括外引物組與內(nèi)引物組，外引物組的正向引物序列為5'-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3'(SEQIDNO:1)，反向引物序列為5'-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3'(SEQIDNO:2);內(nèi)引物組的正向引物序列為5'-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3'(SEQIDNO:3)，反向引物序列為5'-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3'(SEQIDNO:4)。本發(fā)明第二方面提供了一種巢氏PCR支原體檢測試劑盒，包括上述引物組。本發(fā)明的試劑盒是采用高靈敏性的巢式PCR技術(shù)來進(jìn)行支原體檢測。原核生物的rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)，如16s和23s間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大，而支原體各個種間在這一段既有保守又有差異部分，在16s和23s上設(shè)計一對引物(Fl和Rl)擴(kuò)增16S和23S基因間區(qū)域，在16s23s序列保守區(qū)和23s上設(shè)計另外一對引物(F2和R2)進(jìn)行巢式PCR，進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增情況可分析來判斷支原體污染情況。因此，外引物組與內(nèi)引物組的設(shè)計是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵?；谠噭┖胁捎玫氖浅彩絇CR技術(shù)來進(jìn)行檢測的，所以試劑盒中還可以包括其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反應(yīng)試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場途徑單獨購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)客戶實際需要配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。所述試劑盒中還含有陽性對照。陽性對照含有支原體16s和23s間隔區(qū)保守序列，可為含有支原體16s和23s間隔區(qū)保守序列的質(zhì)粒，可采用現(xiàn)有支原體檢測試劑盒中的陽性對照，也可單獨市購或根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)自行構(gòu)建。所述試劑盒中還可含有陰性對照。陰性對照可為各種不含有支原體DNA序列的溶液，如PCR緩沖液、無菌水、生理鹽水等。更佳的，所述試劑盒中還可含有內(nèi)部對照。內(nèi)部對照的存在可輔助判斷PCR體系本身有沒有問題。內(nèi)部對照的作用是與支原體的DNA序列形成競爭關(guān)系，當(dāng)沒有支原體污染時，可以擴(kuò)增出條帶，當(dāng)有污染時，它被抑制不被擴(kuò)增。內(nèi)部對照可為滿足下列條件的人工序列，該人工序列與支原體16s和23s間隔區(qū)的序列無關(guān)，且可以被試劑盒的內(nèi)外引物組擴(kuò)增，并且擴(kuò)增片段大小能與支原體的擴(kuò)增片段明顯區(qū)分。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計出符合上述條件的各種人工序列用作內(nèi)部對照，如上游從外引物正向序列開始，下游到外引物反向序列結(jié)束，中間為與支原體16s和23s間隔區(qū)無關(guān)的序列且包括內(nèi)引物的正向序列與外引物的反向序列。內(nèi)部對照在現(xiàn)有的支原體檢測試劑盒中也已被廣泛使用。本發(fā)明第三方面，公開了上述試劑盒用于檢測支原體污染的用途。所述支原體污染可以是培養(yǎng)基、D-Hanks液、細(xì)胞以及實驗室環(huán)境中的支原體污染。所述支原體包括各禾中支原體如A.Laidlawii、M.hyorhinis、M.arginini、M.hominis、M.salivari咖、M.orale、M.fermentans、M.pirum等。用了本發(fā)明的引物PCR擴(kuò)增后，不同的支原體與擴(kuò)增條帶之間的對應(yīng)關(guān)系如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明第四方面，公開了上述試劑盒的使用方法，包括下列步驟1.將待檢樣本煮沸后離心；2.分別以步驟1離心后的上清及陰性對照為模板，外引物組為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再分別以第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物及陽性對照為模板，內(nèi)引物組為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；3.將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上電泳，根據(jù)電泳擴(kuò)增條帶情況判斷是否污染支原體或污染支原體的種類。較佳的，上述第一輪PCR的反應(yīng)條件為第一循環(huán)94°C2分鐘；而后94°C30秒，62°C1分鐘，72t:1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C10分鐘后冷卻。較佳的，上述第二輪PCR的反應(yīng)條件為第一循環(huán)94°C2分鐘；而后94°C30秒，53°C30秒，72。C30秒，共30個循環(huán)；最后72°C10分鐘后冷卻。較佳的，上述第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中加有內(nèi)部對照。較佳的，上述第一輪PCR及第二輪PCR的反應(yīng)體系為5XBufferlOiil;dNTP3iU;引物2.5iU;Taq酶O.5iU;模板2iU;總體積50iU;其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)平。上述第一輪PCR反應(yīng)體系中如加入內(nèi)部對照，則內(nèi)部對照的加量為2ul。由于巢式PCR容易被污染，因此檢測前需用消毒酒精擦拭所有實驗器材與物料，再用去支原體噴霧劑噴灑重要物料與器材，擦拭器材表面以徹底去除環(huán)境中的支原體。所述樣本可為細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液、血清、培養(yǎng)箱水槽中的水或其他細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的液體試劑。支原體經(jīng)過煮沸后其DNA片段會溶于離心后的上清中。本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明的巢氏PCR支原體檢測試劑盒具有極高的特異性，所含引物能特異性擴(kuò)增支原體rRNA的保守區(qū)域，并可同時分辨多種支原體，擴(kuò)增效率高，條帶清晰，不會擴(kuò)增細(xì)胞5基因組，大大提高了檢測速度，操作簡便而且成本低，用于檢測所需的樣品量極少，可同時高通量對樣品進(jìn)行檢測。圖1:內(nèi)部對照濃度優(yōu)化的電泳結(jié)果圖A:PC1000倍稀釋B:PC10000倍稀釋C:PC100000倍稀釋D:PC1000000倍稀釋E:無PCIC由原液濃度390ng/ul稀釋所得，條帶從左至右，分別依次為稀釋1000倍，104倍，105倍，2xl05倍，4xl05倍，8xl05倍，lxlO6倍，2xl06倍，4xl06倍，8xl06倍圖2:陽性對照濃度優(yōu)化的電泳結(jié)果圖最左列的條帶為Marker,其余條帶從左至右，第一個條帶對應(yīng)PC原液稀釋100倍的樣品，之后分別對應(yīng)在此基礎(chǔ)上PC再逐一稀釋10倍的樣品圖3:本發(fā)明試劑盒與市購試劑盒檢測比較電泳結(jié)果圖左側(cè)條帶1-8為本發(fā)明試劑盒電泳結(jié)果，右側(cè)條帶1-8為市購試劑盒電泳結(jié)果條帶編碼分別對應(yīng)不同樣本1:293T2:H12993:SGC_79014:HCCLM35:H印3B6:Panc-l7:IC8:PC圖4:巢氏PCR支原體檢測試劑盒靈敏度檢測電泳結(jié)果圖條帶1-9均上樣2ul，1-8最終的拷貝數(shù)依次為lxl08，lx107……，10。逐步10倍稀釋8個梯度的陽性質(zhì)粒，條帶9對應(yīng)2ul只含有1個拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒圖5:巢氏PCR支原體檢測試劑盒檢測支原體污染電泳結(jié)果圖圖6:巢氏PCR支原體檢測試劑盒檢測支原體污染電泳結(jié)果圖具體實施例方式以下列舉具體實例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1:巢氏PCR支原體檢測試劑盒制備1.內(nèi)外引物組的合成設(shè)計巢式PCR檢測內(nèi)外引物組，經(jīng)篩選比較后獲得下列可同時鑒別多種支原體的高特異性引物序列外引物組的正向引物序列為5'-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3'，反向引物序列為5'-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3';內(nèi)引物組的正向引物序列為5'-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3'，反向引物序列為5'-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3'。采用常規(guī)方法合成上述弓I物。2.陽性對照和陰性對照陽性對照購自上海吉凱基因，濃度250ng/ul。陰性對照無菌水。3.內(nèi)部對照序列如下內(nèi)部對照采用常規(guī)方法合成。4.試劑盒的裝配將上述合成的引物分別置于密閉容器中或配對混合后分別置于密閉容器，將陰性對照與陽性對照分別置于密閉容器，裝配獲得試劑盒。試劑盒中還可裝配入內(nèi)部對照。也可按需要與其他獨立置于密閉容器中的PCR常用試劑一起裝配入試劑盒。5.試劑盒的條件優(yōu)化第一輪PCR體系5XBuffer(Mg2+)10ii1;dNTP3ii1;引物2.5ii1;Taq酶O.5ii1;模板21;內(nèi)部對照21;總體積501;其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)平。第二輪PCR體系5XBuffer(Mg2+)10ii1;dNTP3ii1;引物2.5ii1;Taq酶O.5ii1;模板21;總體積501;其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)平。第一輪PCR的反應(yīng)條件第一循環(huán)94t:2分鐘；而后94"30秒，62°C1分鐘，72°C1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C10分鐘后冷卻。第二輪PCR的反應(yīng)條件第一循環(huán)94。C2分鐘；而后94°C30秒，53°C30秒，72°C30秒，共30個循環(huán)；最后72°C10分鐘后冷卻。(—)內(nèi)部對照(InternalControl)濃度的優(yōu)化InternalControl在支原體檢測試劑盒中的作用是當(dāng)沒有污染時，可以擴(kuò)增出條帶，當(dāng)有污染時，它被抑制。恰當(dāng)濃度的InternalControl可以提高試劑盒的準(zhǔn)確性。實驗設(shè)計用一系列稀釋的IC(InternalControl)和不同濃度的PC(PositiveControl)做PCR，當(dāng)PC濃度提高后，IC會被抑制。實驗?zāi)康恼业揭粋€IC濃度，既能在PC低濃度時，有明顯條帶，又能在PC高濃度時被抑制。結(jié)果見圖1。從圖1可以看到，左數(shù)第四，五個孔在PC低濃度時，條帶較明顯，而高濃度時，條帶消失。它們的稀釋倍數(shù)分別是200000倍和600000倍，采用同樣的方法進(jìn)一步優(yōu)化得到最理想的濃度是300000倍稀釋。(二)陽性對照(PositiveControl)濃度的優(yōu)化在確定IC濃度的基礎(chǔ)上，我們將高濃度PositiveControlDNA進(jìn)行了7個濃度的10倍稀釋，進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果如圖2。最終確定PC在高濃度稀釋100倍的時候，效果最好。實施例2巢氏PCR支原體檢測試劑盒靈敏度檢測采用實施例1制備的試劑盒檢測梯度稀釋的陽性對照。逐步10倍稀釋8個梯度，最后一個稀釋樣品取2ul只含有1個拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒)。PCR體系及檢測條件同實施例1試驗結(jié)果如圖4，結(jié)果表明，當(dāng)拷貝數(shù)〉100時，PCR可以檢測出陽性樣品，說明靈敏度高。實施例3巢氏PCR支原體檢測試劑盒與現(xiàn)有試劑盒的比較試驗內(nèi)容采用等量的陽性樣本，同時采用實施例1制備的巢氏PCR支原體檢測試劑盒與市購的支原體檢測試劑盒(華大天源微探TM支原體檢測試劑盒)進(jìn)行檢測并在相同條件下同時電泳，比較結(jié)果。試驗方法實施例1制備的試劑盒檢測條件參考實施例1的體系及PCR條件。市購支原體檢測試劑盒的檢測條件參考其說明書。檢測對象在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長明顯減慢，細(xì)胞表面隨便增加，黑色顆粒狀物質(zhì)增多，細(xì)胞容易飄起死亡，使用華大試劑盒檢測出有污染，從而驗證支原體污染呈陽性的6個樣品，它們包括293T細(xì)胞，H1299細(xì)胞，SGC-7901細(xì)胞，HCCLM3細(xì)胞，H印3B細(xì)胞，Panc-l細(xì)胞。試驗結(jié)果檢測結(jié)果如圖3，將6個樣品進(jìn)行PCR檢測對比試驗，與現(xiàn)有試劑盒相比，對于同樣的檢測樣本，檢測結(jié)果相符，同時條帶更清晰，PCR效率更高，雜帶更少，例如以HCCLM3細(xì)胞樣本對應(yīng)的檢測結(jié)果來看，在等量樣本的情況下，本發(fā)明試劑盒的擴(kuò)增條帶就比現(xiàn)有的試劑盒條帶清晰很多。上述結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒特性更強(qiáng)，檢測范圍更廣。實施例4巢氏PCR支原體檢測試劑盒檢測支原體污染實驗?zāi)康耐ㄟ^巢式PCR技術(shù)檢測細(xì)胞平臺日常實驗過程中培養(yǎng)基，D-Hanks液，細(xì)胞以及實驗室環(huán)境中的支原體污染情況，找到污染源從而控制支原體污染途徑，使細(xì)胞在無支原體影響的條件下做出客觀與科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)；對后期支原體快速診斷試劑盒的開發(fā)提供有力數(shù)據(jù)。實驗器材超鏡臺水浴鍋離心機(jī)負(fù)80度冰箱PCR儀電泳槽凝膠成像儀電泳儀無菌PCR管無菌1.5mlEP管PCR管架無菌槍頭棉球移液器(lml200ul10ul2ul)實驗試劑無菌超純水待檢樣品75%消毒酒精去支原體噴霧劑實施例1制備的試劑盒，包括PCR弓I物Taq酶5xBuffer(Mg2+)dNTPPositiveControlDNAInternalControlDNA2%瓊脂糖膠EB電泳緩沖液Mark(DL250+)6xLoadingBuffer實驗步驟1.收集需要檢測的樣品，負(fù)80度冰箱保存2.95度沸水浴中煮待檢樣品510min，12000轉(zhuǎn)每分鐘離心2min3.用75%消毒酒精擦拭所有實驗器材與物料，再用去支原體噴霧劑噴灑重要物料與器材，均勻擦拭表面以徹底去除環(huán)境中的支原體4.取出PCR管若干，1.5mlEP管若干，放置備用5.稀釋引物，PC與IC質(zhì)粒到適當(dāng)濃度6.配置第一輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備的PCR管內(nèi)，其中需添加水對照與IC對照7.加入待檢樣品，振蕩器上混勻后進(jìn)行第一輪PCR8.第一輪PCR結(jié)束后，配置第二輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備的PCR管內(nèi)，其中需添加PC對照9.加入第一輪PCR產(chǎn)物，振蕩器上混勻后進(jìn)行第二輪PCR10.結(jié)束后加入LoadingBuffer,配置2%瓊脂糖膠，上樣進(jìn)行電泳，拍照PCR體系同實施例1第一輪循環(huán)1循環(huán)94°Cfor2min30循環(huán)cycle94°Cfor30sec62°Cforlmin72°Cforlmin1循環(huán)72°CforlOmin冷卻至4"第二輪循環(huán)1循環(huán)94°Cfor2min30循環(huán)e94°Cfor30sec53°Cfor30sec72°Cfor30secl循環(huán)72°CforlOmin冷卻至4"實驗結(jié)果與分析(電泳結(jié)果如圖5所示)上樣編號(下列所有細(xì)胞對應(yīng)的樣本均為該細(xì)胞的培養(yǎng)上清)l:D-Hanks緩沖液2:1640完全培養(yǎng)基3:DMEM完全培養(yǎng)基4:DMEM完全培養(yǎng)基(加入Mycoplasma-0UT)5:293T細(xì)胞6:MCF-7細(xì)胞7:panc-l細(xì)胞8:SGC-7901細(xì)胞9:H1299細(xì)胞10:D-Hanks緩沖液0138]11:1640完全培養(yǎng)基0139]12掘細(xì)胞(力口入Mycoplasma-OUT)0140]13:RK0細(xì)胞0141]14:MHCC-97-H細(xì)胞(1)(剛復(fù)蘇的)OH2]15;MHCC-97-H細(xì)胞(2)(復(fù)蘇以后傳代5次)0143]16:HCCLM3細(xì)胞0144]17:GS-2細(xì)胞0145]18:HEY細(xì)胞0146]19:陰性對照0147]20:PC0148]21:IC0149]M:Mark0150]PCR結(jié)果達(dá)到預(yù)期的效果0151]1.從1921號PCR條帶可以看出，整個體系沒有受到支原體的污染，IC與PC都出現(xiàn)在理論大小的位置，說明整個實驗過程中水，樣品與實驗環(huán)境都是支原體呈陰性0152]2.5號與8號樣品呈陽性屬于重度污染，7號、9號與16號屬于輕度污染，其余樣品正常。0153]實施例5巢氏PCR支原體檢測試劑盒檢測支原體污染0154]實驗?zāi)康?155]實施例4用巢式PCR支原體快速檢測試劑盒檢測出細(xì)胞平臺日常實驗過程中的一些工具細(xì)胞有支原體污染，實驗中的陽性與陰性樣品都很正常，而嚴(yán)格的環(huán)境處理也排除了外界污染的可能性，因此判斷這些細(xì)胞本身帶有支原體或者保種過程中就已經(jīng)受到了支原體的污染，檢測后期再使用支原體去除試劑對檢測有污染可能的細(xì)胞進(jìn)行了一個周期的處理，然后收集上清再次通過該試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)所有支原體擴(kuò)增條帶區(qū)域全部轉(zhuǎn)陰，陽性與陰性樣品一切正常，事實證明絕大部分支原體已經(jīng)被徹底殺滅。實驗器材超鏡臺水浴鍋離心機(jī)負(fù)80度冰箱PCR儀電泳槽凝膠成像儀電泳儀無菌PCR管無菌1.5mlEP管PCR管架無菌槍頭棉球移液器(lml200ul10ul2ul)實驗試劑無菌超純水待檢樣品75%消毒酒精去支原體噴霧劑Mycoplasma-OUTGerm-freetestmedium實施例1制備的試劑盒(包括PCR引物Taq酶5xBuffer(Mg2+)dNTPPositiveControlDNAInternalControlDNA)2%瓊脂糖膠EB電泳緩沖液Mark(DL250+)6xLoadingBuffer實驗步驟1.收集需要檢測的樣品，負(fù)80度冰箱保存2.95度沸水浴中煮待檢樣品5lOmin，12000轉(zhuǎn)每分鐘離心2min3.用75%消毒酒精擦拭所有實驗器材與物料，再用去支原體噴霧劑噴灑重要物料與器材，均勻擦拭表面以徹底去除環(huán)境中的支原體4.取出PCR管若干，1.5mlEP管若干，放置備用5.稀釋引物，PC與IC質(zhì)粒到適當(dāng)濃度6.配置第一輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備的PCR管內(nèi)，其中需添加水對照與IC對照7.加入待檢樣品，振蕩器上混勻后進(jìn)行第一輪PCR8.第一輪PCR結(jié)束后，配置第二輪PCR體系總管，然后每管48ul分裝到事先準(zhǔn)備的PCR管內(nèi)，其中需添加PC對照9.加入第一輪PCR產(chǎn)物，振蕩器上混勻后進(jìn)行第二輪PCR10.結(jié)束后加入LoadingBuffer,配置2%瓊脂糖膠，上樣進(jìn)行電泳，拍照PCR體系及條件同實施例4實驗結(jié)果與分析(電泳結(jié)果如圖6所示)上樣編號13:293T細(xì)胞(復(fù)蘇后)；293T細(xì)胞(加藥前)；293T細(xì)胞(加藥后)46:panc-l細(xì)胞(復(fù)蘇后)；panc-1細(xì)胞(加藥前)；panc-1細(xì)胞(加藥后)79:SGC-7901細(xì)胞(復(fù)蘇后)；SGC-7901細(xì)胞(加藥前)；SGC-7901細(xì)胞(加藥后)1012:H1299細(xì)胞(復(fù)蘇后);H1299細(xì)胞(加藥前);H1299細(xì)胞(加藥后)1315:IC;IC+PC;PC其中"復(fù)蘇后"的樣品是上一輪PCR的剩余上清；"加藥前"的樣品是細(xì)胞復(fù)蘇傳了4-5傳后，用含有雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)到密度達(dá)到8090%的細(xì)胞培養(yǎng)上清；"加藥后"的樣品是用藥物處理一周后，換成Germ-freetestmedium培養(yǎng)2天后密度達(dá)8090%的細(xì)胞培養(yǎng)上清。PCR結(jié)果處理前與處理后的細(xì)胞上清形成鮮明對比，達(dá)到預(yù)期的效果1.本次實驗選擇293T、panc-l、SGC_7901、H1299四株細(xì)胞進(jìn)行檢測，每株細(xì)胞設(shè)置3組(復(fù)蘇后、加藥前、加藥后)，目的就是想看看細(xì)胞在復(fù)蘇傳代過程的污染深度情況，用抗生素處理后的細(xì)胞是否還有支原體污染的可能。2.從PCR結(jié)果可以看出，第一輪檢測有污染的細(xì)胞確實受到支原體污染，細(xì)胞在加藥處理后全部轉(zhuǎn)成陰性。3.加藥處理后的細(xì)胞，外表面碎片消失，細(xì)胞通體光滑，折光度好，細(xì)胞貼壁更開，生長速度顯著提高，初步實驗證明轉(zhuǎn)染與感染效率提高。序列表〈110〉上海吉盛制藥技術(shù)有限公司〈120〉巢氏PCR支原體檢測用引物組、檢測試劑盒及其使用方法〈130〉PCNJK091860〈160>5〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>22〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>1gatccatgggagctggteatgc22〈210〉2<211>24〈212>DNA<213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>2agcgttcatcgactttcagaccca24〈210>3〈211〉26〈212〉DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉3tcatgttctttgaaaactgaatatcg26〈210>4〈211>21〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>4caaggcatccaccaaaaactc21〈210〉5<211>508〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉內(nèi)部對照<400>5gatccatgggagctggteatgccttcgtggtggg卿ggcc朋caggtcgg3C3gCgCC360ggtgtegcacccaggtggtgaccacggtctggcgcatgcggcaggcttccctgcccttct120tcacctecttcttgtcatgttctttgaaaactgaatetcgg￡lgg￡lgtgC￡lgtttgcag朋180ggtggtgccctgctcccacgagtggcccacggctgttcgccagcggcttcctgctcagcg240ccttcaccctggaccgctgcctgcaggtggtgcggccggtgtgggCgC3g朋CC3CCgC3300ccgtggccgcggcgcaccgtgttgagcaccgctggtgccc3朋gC3CC3ggagtttttgg360tggatgccttgcgtgttccgggacaccatctcacggctgg3C3ggCgC3ttetgtgctec420cccggggcctgaccgcgatgccacgtgcaactcgcgccaggcggccctggccctc朋c朋■gteatgggtctg朋3gtcgatgaacgct5081權(quán)利要求一種巢氏PCR支原體檢測用引物組，包括外引物組與內(nèi)引物組，外引物組的正向引物序列為5’-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3’，反向引物序列為5’-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3’；內(nèi)引物組的正向引物序列為5’-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3’，反向引物序列為5’-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3’。2.—種巢氏PCR支原體檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1所述巢氏PCR支原體檢測用引物組。3.如權(quán)利要求2所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括陽性對照，或同時包括陽性對照和陰性對照。4.如權(quán)利要求3所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR所需要的常規(guī)試劑。5.如權(quán)利要求4所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部對照。6.如權(quán)利要求2-5中任一權(quán)利要求所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒用于檢測支原體污染的用途。7.如權(quán)利要求6所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒的用途，其特征在于，所述支原體污染為培養(yǎng)基、D-Hanks液、細(xì)胞或?qū)嶒炇噎h(huán)境中的支原體污染。8.如權(quán)利要求2-5中任一權(quán)利要求所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒的使用方法，包括下列步驟a、將待檢樣本煮沸后離心；b、分別以步驟a離心后的上清及陰性對照為模板，外引物組為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再分別以第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物及陽性對照為模板，內(nèi)引物組為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)+幽《>曰5c、將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上電泳，根據(jù)電泳擴(kuò)增條帶情況判斷是否污染支原體或污染支原體的種類。9.如權(quán)利要求8所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中加有內(nèi)部對照。10.如權(quán)利要求8或9所述巢氏PCR支原體檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述第一輪PCR的反應(yīng)條件為第一循環(huán)94°C2分鐘；而后94°C30秒，62。C1分鐘，72。C1分鐘，共30個循環(huán)；最后72t:IO分鐘后冷卻；所述第二輪PCR的反應(yīng)條件為第一循環(huán)94t:2分鐘；而后94°C30秒，53。C30秒，72。C30秒，共30個循環(huán)；最后72°C10分鐘后冷卻。全文摘要本發(fā)明公開了一種巢氏PCR支原體檢測用引物組、檢測試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的巢氏PCR支原體檢測用引物組包括外引物組與內(nèi)引物組，外引物組的正向引物序列為5′-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3′，反向引物序列為5′-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3′；內(nèi)引物組的正向引物序列為5′-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3′，反向引物序列為5′-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3′。本發(fā)明的巢氏PCR支原體檢測試劑盒中包括巢氏PCR支原體檢測用引物組。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了該試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒具有極高的特異性，可同時分辨多種支原體，擴(kuò)增效率高，條帶清晰，可同時高通量對樣品進(jìn)行檢測。文檔編號C12N15/11GK101724693SQ20091020072公開日2010年6月9日申請日期2009年12月24日優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日發(fā)明者曹躍瓊,王海峰,逄淑召,韋有恒,高博申請人:上海吉盛制藥技術(shù)有限公司