專利名稱：中藥中馬種源性成分的pcr鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及中藥的鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，非常適合于深度加工型馬種源性產(chǎn)品，尤其是針對因 深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的馬皮膠，操作簡單，可用于產(chǎn)品檢驗部門對市場 假冒偽劣的該種中草藥的靈敏快速鑒定。
背景技術(shù)：
我國傳統(tǒng)中藥博大精深，可用作中藥的物質(zhì)種類繁多，其中有一類是利用動物皮、 骨熬制而成的膠類中藥，包括阿膠、龜甲膠、鹿角膠等。這些膠類中藥十分名貴，是滋陰潛 陽、增強體質(zhì)的上乘佳品。阿膠本品為馬科動物驢(Eqims asinus)的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體 膠，作為一種名貴中藥，它有著2000多年的歷史。早在東漢時期就有其藥用記載。阿膠性 平，其功能主要補血滋陰，潤燥、止血。用于血虛萎黃，眩暈心悸，肌痿無力，心煩不眠，虛風(fēng) 內(nèi)動，肺燥咳嗽，勞嗽嘮血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，在臨床上，阿膠常用于各類婦科 疾病的治療如痛經(jīng)、子宮出血、流產(chǎn)和一些慢性病的治療如失眠、焦慮、眩暈、心煩不安、吐 血尿血等。目前，阿膠系列產(chǎn)品已經(jīng)拓展到藥品、食品和保健品領(lǐng)域，它以其良好的功效在 “補血”市場上占據(jù)著重要地位。龜甲膠是以龜科動物烏龜(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲為原料，經(jīng)水煎煮、 濃縮制成的固體膠，性成、甘、涼，歸肝、腎、心經(jīng)。能夠滋陰、養(yǎng)血、止血，主要用于陰虛潮熱、 骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等。有研究表明，長期服用龜甲膠有利于增強機體 自身調(diào)節(jié)，能夠延年益壽，也利于陰虛陽亢患者的身體康復(fù)。據(jù)2005年版中國藥典記載，鹿角膠是用鹿角經(jīng)水煎煮濃縮制成的固體膠，性甘、 成、溫，能夠溫補肝腎，益精養(yǎng)血。用于肝腎不足所致的腰膝酸冷，陽痿遺精，虛勞贏瘦，崩漏 下血，便血尿血，陰疽腫痛等。由此可見，膠類中藥主要用于調(diào)節(jié)身體機能，滋陰潛陽，增強體質(zhì)，并且對腎虛，貧 血病人具有很好的療效。因此，該類中藥在整個中藥市場上占有重要的位置，深受消費者的青睞。近些年來，隨著膠類中藥市場的不斷發(fā)展，生產(chǎn)膠類中藥的廠家也不斷增多，生產(chǎn) 能力以及產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。以阿膠為例，由于驢的畜牧價值在不斷下降，而其經(jīng)濟價值確 未見提高，驢的數(shù)量在世界范圍內(nèi)急劇下降，驢皮的供應(yīng)也逐年緊張，價格不斷上漲。市場 上出現(xiàn)了很多不法分子，在生產(chǎn)阿膠時，部分甚至全部用各種其他動物皮包括馬皮、牛皮、 豬皮等，甚至臟皮、爛皮、病死動物之皮等來取代驢皮進行熬制。這類假冒偽劣產(chǎn)品不止沒 有任何療效，還對人體危害極大，影響著人們的身心健康。此外，對于其他膠類中藥包括龜 甲膠、鹿角膠等，也存在類似情況，這些偽品嚴重阻礙了整個膠類中藥市場的健康發(fā)展。由于膠類中藥一旦成形，無論是外觀或是色澤等都區(qū)別不大，人們難以通過感觀 水平的差異來對膠類中藥進行真?zhèn)舞b別，而只能借助生物學(xué)鑒定的手段，通過生物學(xué)大分子的差異來對真?zhèn)文z類中藥進行區(qū)分。然而，由于驢和馬的親緣關(guān)系較近，它們在生物學(xué)本 質(zhì)上的差異也是十分有限的，因此，檢測膠類中藥中的馬種源性成分用于區(qū)分阿膠和馬皮 膠變得尤其困難。目前，利用DNA分子標記的方法區(qū)分驢、馬源性成分的相關(guān)報道非常有限，并且大 都是利用線粒體DNA(Chisholm JjConyers C,Booth C, Lawley W,Hird H. Thedetection of horse and donkey using real-time PCR. Meat Sci. 2005,70 727-732)(Kesmen Ζ, Sahin F,Yetim H. PCR assay for the identification of animal species incooked sausages. Meat Sci. 2007, 77 :649_653) (Tanabe S, Hase M, Yano T, Sato M, Fujimura T, Akiyama H. A real-time quantitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods. Biosci Biotechnol Biochem. 2007，71 :3131_3135)，其拷貝數(shù) 有限，比較適合DNA保存完好，或者輕度破壞樣品的PCR鑒定。膠類中藥大多經(jīng)過高溫高壓 長時間作用，其DNA含量極少，片段極短，傳統(tǒng)的分子標記難以滿足這類深加工產(chǎn)品的檢測 需要。定位于馬科動物亞中央著絲點染色體著絲粒上的一段馬種源性衛(wèi)星DNA序 列是 Pauciullo 等(Pauciullo，Α.，Kubickova, S.，Cernohorska，H.，Petrova, K.，Di Berardino， D. ， Ramunno, L ， &Rubes， J. (2006).Isolation and physical localization of newchromosome-specific centromeric repeats in farm animals. Veterinarni Medicina，51，224-231)在研究家畜動物的染色體圖譜時發(fā)現(xiàn)的，其能夠與馬中央著絲點染 色體著絲粒特異性結(jié)合，具有馬種動物特異性。它同時屬于高度重復(fù)序列，拷貝數(shù)較線粒體 DNA 多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種中藥中馬種源性成 分的PCR鑒定方法，該PCR鑒定方法操作簡單、靈敏快速、成本低、能有效鑒定種源性產(chǎn)品的 真?zhèn)?，特別適用于鑒定因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的深度加工型馬皮膠的 真?zhèn)?，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特點是，包括下列步驟a)提取所述中藥中的DNA ；b)用根據(jù)具有馬特異性的衛(wèi)星序列設(shè)計的馬種源性特異性引物對所述DNA進行 PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物；c)電泳所述擴增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴增出陽性擴增條帶，如 果所述DNA擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥源自馬種動物，含有馬種源性成分；如果 所述DNA沒有擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥并不源自馬種動物，也不含有任何馬 種源性成分。較佳地，在步驟a)中，所述中藥是深度加工型中藥。更佳地，所述深度加工型中藥是深度加工型馬皮源性中藥。更進一步地，所述深度加工型馬皮源性中藥是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段破壞極其嚴重的馬皮膠。
更佳地，采用消化液和蛋白酶預(yù)處理所述深度加工型中藥，再采用針對短片段DNA 的抽提方法提取所述DNA。較佳地，所述具有馬特異性的衛(wèi)星序列是位于馬科動物亞中央著絲點染色體著絲 粒上的核苷酸序列。更佳地，所述核苷酸序列是GenBank Accesion No. AJ937277代表的序列。更進一步地，所述馬種源性特異性引物包括SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2所示的 核苷酸序列。較佳地，所述陽性擴增條帶的長度在IOObp以下。采用本發(fā)明的方法，能夠快速檢測膠類中藥中是否混雜有馬種源性成分，從而分 辨真?zhèn)?，且由于其采用基于種屬特異性的衛(wèi)星DNA序列，特異性好，大小適中，并且相對 rDNA，mtDNA而言，其拷貝數(shù)更高，比較適合DNA破壞嚴重的樣品的PCR檢測。因此，盡管深 度加工型膠類中藥DNA含量極少，破壞極其嚴重，但本發(fā)明基于衛(wèi)星DNA的PCR檢測方法完 全能夠達到檢測目的，并且能夠?qū)⒂H緣關(guān)系較近的驢源性成分和馬種源性成分進行區(qū)分。 此外，本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，常規(guī)PCR即可完成檢測，操作簡單、 成本低、靈敏快速、能有效鑒定深度加工型膠類中藥產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>

圖1是采用基于馬特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計的馬種源性成分特異性引物進行PCR 反應(yīng)獲得的擴增產(chǎn)物電泳圖，用于檢測各種肉源性成分中的馬種源性成分。其中，1.空白對 照，2.驢肉基因組DNA，3.馬肉基因組DNA，4.牛肉基因組DNA，5.豬肉基因組DNA，6.龜肉 基因組DNA，7.鹿肉基因組DNA，M. DNA Marker。圖2是采用基于馬特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計的馬種源性特異性引物進行PCR反 應(yīng)獲得的擴增產(chǎn)物電泳圖，用于檢測各種膠類中藥中的馬種源性成分。其中M. DNAMarker, 1.陽性對照(馬基因組DNA)，2.阿膠DNA，3.馬皮膠DNA，4.牛皮膠DNA，5.豬皮膠DNA， 6.空白對照。圖3是采用基于馬特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計的馬種源性特異性引物進行PCR反 應(yīng)獲得的擴增產(chǎn)物的測序比對結(jié)果，用于驗證擴增產(chǎn)物的可靠性。其中1.馬肉基因組擴 增產(chǎn)物，2.馬皮膠DNA擴增產(chǎn)物，3.馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列(GenBank AccesionNo. AJ937277)片段。
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細說明。本發(fā)明以鑒定馬皮膠為例，為了檢測膠類中藥中可能混雜的馬種源性成分，并與 其他各類動物源性成分進行區(qū)分，基于馬科動物亞中央著絲點染色體著絲粒上一段馬種源 性特異性衛(wèi)星DNA序列(GenBank Accesion No. AJ937277)優(yōu)化設(shè)計引物如下根據(jù)馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計引物，理論目標條帶大小78bp，用于檢測 膠類中藥的馬種源性成分。其序列如下上游引物Horse up =SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列下游引物Horse down =SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列
各實施例提取膠類中藥的DNA的具體步驟如下1、膠類中藥的預(yù)處理將膠塊錘擊成顆粒狀，取出若干加入一只50ml無菌離心 管中，并向其中加入消化緩沖液，該緩沖液PH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA， 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 5% SDS構(gòu)成，然后將離心管置于50°C _60°C水浴中保溫，其間不時輕微 攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。待溶液冷卻至室溫后，加入蛋白酶K溶液，混勻，56°C 保溫1小時，其間不時輕微搖勻。2、膠類中藥DNA的提取向上述膠類中藥預(yù)處理液中加入PN緩沖液，混勻，分若干 次加入硅吸附柱中，離心，將溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入 PE緩沖液洗滌吸附柱膜，除去附著在膜上的少量蛋白及脂類物質(zhì)，完畢之后用熱的PH 8. 0 的TE緩沖液將吸附柱膜上的DNA洗脫收集下來并置于_20°C保存。提取得到的DNA可用紫 外分光光度法定量。上述提取操作過程中所用試劑、耗材皆來自商業(yè)化試劑(德國QIAGEN公司)，包括 PN 緩沖液(Cat. No. 19071)、PE 緩沖液(Cat. No. 19065)、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。用上述方法提取得到各個膠類制品DNA樣之后，利用上述引物進行常規(guī)的PCR操 作，將產(chǎn)物加于2% -3%的添加了熒光染料的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外下觀察，根據(jù)是否出 現(xiàn)陽性擴增條帶判斷待檢測樣品中是否含有馬種源性成分，從而完成對這些樣品的檢測。實施例1檢測各種肉基因組中所含有的馬種源性成分1材料和試劑材料各種肉類包括驢、馬、牛、豬、龜、鹿的基因組DNA提取液(lng/yL)。試劑PCR預(yù)混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (購于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 熒光染料 10000 XGelRed =DNA 熒光染料(購于 Biotium，Cat. No.41000)。2檢測方法取各種肉基因組DNA提取液備用，使用根據(jù)具有馬種源性成分特異性的衛(wèi)星DNA 序列所設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，引物用無菌水溶解至濃度10 μ M備用。25 μ L反應(yīng)體系的 具體加樣情況如下Premix Εχ-Taq Hot Start Version 12. 5 μ L，引物Horse up 0. 5 μ L，弓 |物Horse downO. 5 μ L，基因組DNA提取液1 μ L，無菌雙蒸水10. 5 μ L ；(在該反應(yīng)體系中，上游及下游引物終濃度皆0.4 μ Μ,各種肉類DNA模板量lng。)擴增條件:94°C6min -MV 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (30 循環(huán))；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作結(jié)束后，用IXTAE電泳緩沖液制備2. 5%瓊脂糖凝膠并按照參考比例混 入熒光染料GelRed 。按照比例將10 μ 1的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合，加入凝膠孔 中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為40-60分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠 塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照。結(jié)果見圖1，由于引物根據(jù)馬種源性成分特異性衛(wèi)星DNA序列來設(shè)計，泳道3具有 陽性條帶，而其它泳道均沒有出現(xiàn)陽性條帶，可見該方法能夠特異性檢測馬種源性成分，而 與其他各種動物源性成分包括驢、牛、豬、龜、鹿等進行區(qū)分。實施例2檢測膠類中藥中所含有的馬種源性成分1材料和試劑
材料阿膠(山東東阿股份有限公司生產(chǎn))DNA提取液(lOng/yL)；馬皮膠(山東 東阿股份有限公司研究所采用馬皮熬制)DNA提取液(lOng/yL)；黃明膠(山東東阿股份 有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(lOng/yL)；豬皮膠(山東東阿股份有限公司 研究所采用豬皮熬制)DNA提取液(lOng/yL)。試劑PCR預(yù)混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (購于 TAKARA，Cat-No. DRR030A) ；DNA 熒光染料 10000 XGelRed :DNA 熒光染料(購于 Biotium，Cat. No.41000)。2檢測方法取各種膠DNA提取液(10ng/ y L)備用，使用根據(jù)馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列所 設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，引物用無菌水溶解至濃度10 y M備用。25 y L反應(yīng)體系的具體加 樣情況如下Premix Taq Hot Start Version 12. 5 u L, Horse up 0. 5 ii L，弓L Horse downO. 5u L,模板5 u L,無菌雙蒸水6. 5 u L ；(在該反應(yīng)體系中，上游及下游引物終濃度皆0.4 y M，待檢測膠類DNA模板量 50ngo )擴增條件:94°C6min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (40 循環(huán))；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作結(jié)束后，用1XTAE電泳緩沖液制備2. 5%瓊脂糖凝膠并按照參考比例混 入熒光染料GelRed 。按照比例將10 yl的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合，加入凝膠孔 中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為40-60分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠 塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照。結(jié)果見圖2，由于引物根據(jù)馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計，所以泳道1，泳道3 都具存陽性條帶，可見盡管由膠類中藥中得到的DNA含量極少，利用針對馬種源性成分特 異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計的引物，通過PCR能夠檢測出膠類制品中的馬種源性成分，而在其它 樣品中沒有擴增出陽性條帶。接著對該實施例中的馬基因組擴增產(chǎn)物以及馬皮膠擴增產(chǎn)物 進行連接載體并測序，將所得到的測序結(jié)果進行比對，結(jié)果見圖3，同源性良好，并且與所設(shè) 計的產(chǎn)物序列相符，進一步驗證了檢測結(jié)果的可靠性。因此利用這種方法能夠特異性識別 膠類中藥中的馬源性成分，實現(xiàn)了膠類中藥中馬源性成分與驢源性成分的區(qū)分。上述試驗結(jié)果表明，針對馬種源性成分特異性衛(wèi)星DNA序列設(shè)計引物，以馬皮膠 DNA提取液作模板，確實能夠得到清晰的條帶。盡管該馬種源性成分特異性衛(wèi)星DNA序列從 未被用于實際加工產(chǎn)品的馬種源性特異性檢測，但由于它具有馬種動物特異性，同時屬于 高度重復(fù)序列，拷貝數(shù)較線粒體DNA多，根據(jù)該序列設(shè)計引物，通過PCR檢測完全有可能特 異性檢測到深度加工型膠類中藥中的馬種源性成分。因此，利用該序列能夠識別馬源性成 分，并與阿膠中的驢源性成分進行區(qū)分，從而實現(xiàn)膠類中藥的真?zhèn)舞b別。衛(wèi)星DNA序列相對rDNA及mtDNA而言，拷貝數(shù)高，特異性好。所以，本發(fā)明對待檢 測樣品的初始DNA模板質(zhì)量要求較低，盡管從深度加工膠類中藥中提取得到的DNA濃度極 低，破壞極其嚴重，但是，利用本發(fā)明進行檢測，依然能夠得到較為理想的結(jié)果。本發(fā)明的基 于馬種源性成分特異性衛(wèi)星DNA序列的PCR檢測方法能夠適用于深度加工的各類膠類中藥 的馬種源性成分檢測，實現(xiàn)了馬皮膠與阿膠的鑒別。這也是本發(fā)明最大的特點和優(yōu)勢。并 且該法并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，常規(guī)PCR即可完成檢測。
因此，這種基于馬種源性成分特異性衛(wèi)星DNA序列所構(gòu)建的深度加工型產(chǎn)品檢測 方法是從深度加工型膠類中藥中鑒定馬種源性成分的關(guān)鍵。這一點在利用分子生物學(xué)技術(shù) 鑒別深度加工型膠類中藥的領(lǐng)域意義重大，它首次實現(xiàn)了阿膠與馬皮膠的區(qū)分鑒別。目前 特異性檢測膠類中藥中馬種源性成分的分子鑒別技術(shù)國內(nèi)外尚未見報道。綜上所述，本發(fā)明的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法操作簡單、靈敏快速、成 本低、能有效鑒定種源性產(chǎn)品的真?zhèn)?，有效區(qū)分馬皮膠與阿膠，特別適用于鑒定因深度加工 而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的深度加工型馬皮膠的真?zhèn)危m于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認為是說明性的 而非限制性的。序列表<110>華東理工大學(xué)，山東東阿阿膠股份有限公司<120>中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (20)<223>根據(jù)馬科動物亞中央著絲點染色體著絲粒的馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列(GenBank Accesion No. AJ937277)設(shè)計的上游引物<400>1cacttgaact acagctcagc20<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (18)<223>根據(jù)馬科動物亞中央著絲點染色體著絲粒的馬種源性特異性衛(wèi)星DNA序列(GenBank Accesion No. AJ937277)設(shè)計的下游引物<400>2gtggttccgt catagcag18
權(quán)利要求
一種中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟a)提取所述中藥中的DNA；b)用根據(jù)具有馬特異性的衛(wèi)星序列設(shè)計的馬種源性特異性引物對所述DNA進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物；c)電泳所述擴增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴增出陽性擴增條帶，如果所述DNA擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥源自馬種動物，含有馬種源性成分；如果所述DNA沒有擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥并不源自馬種動物，也不含有任何馬種源性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，在步驟 a)中，所述中藥是深度加工型中藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述深度 加工型中藥是深度加工型馬皮源性中藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述深度 加工型馬皮源性中藥是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段破壞極其嚴重的馬皮膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，采用消化 液和蛋白酶預(yù)處理所述深度加工型中藥，再采用針對短片段DNA的抽提方法提取所述DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述具有 馬特異性的衛(wèi)星序列是位于馬科動物亞中央著絲點染色體著絲粒上的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述核苷 酸序列是GenBank Accesion No. AJ937277代表的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述馬種 源性特異性引物包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述陽性 擴增條帶的長度在IOObp以下。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法，包括下列步驟a)提取所述中藥中的DNA；b)用根據(jù)具有馬特異性的衛(wèi)星序列設(shè)計的馬種源性特異性引物對所述DNA進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物；c)電泳所述擴增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴增出陽性擴增條帶，如果所述DNA擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥源自馬種動物，含有馬種源性成分；如果所述DNA沒有擴增出所述陽性擴增條帶，則所述中藥并不源自馬種動物，也不含有任何馬種源性成分。本發(fā)明操作簡單、靈敏快速、成本低、能有效鑒定馬種源性產(chǎn)品的真?zhèn)?，特別適用于鑒定因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的深度加工型馬皮膠的真?zhèn)危m于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101812509SQ20091020077
公開日2010年8月25日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者呂品, 周祥山, 尤金花, 張元興, 田守生, 秦玉峰 申請人:華東理工大學(xué);山東東阿阿膠股份有限公司