專利名稱：：一種白地霉生產(chǎn)低溫中性脂肪酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及其產(chǎn)物酶領(lǐng)域，特別是涉及從高寒地區(qū)分離獲得產(chǎn)生低溫中性脂肪酶的白地霉菌林及其由該菌抹產(chǎn)生的新型低溫中性脂肪酶。
背景技術(shù)：
：低溫條件下具有較高催化能力的低溫酶類的最佳來源。有關(guān)低溫酶的最早報(bào)道是在1984年，^^on'等從南極地區(qū)篩選的菌種中成功檢測到堿性磷酸酶的活性并觀察到該酶在低溫時(shí)的高比活力和高溫時(shí)的迅速失活的特性。直到20世紀(jì)90年代前期，隨著世界能源緊缺，石油價(jià)格上漲，節(jié)能降耗成為世界范圍內(nèi)亟待解決的熱點(diǎn)問題，低溫酶的研究才因此在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)外研究較多的是海洋和極地環(huán)境下的低溫微生物及其低溫酶，而對(duì)于內(nèi)陸高寒地區(qū)、冰川凍土的研究較少。新疆是我國西北內(nèi)陸省區(qū)，具有獨(dú)特的自然環(huán)境，其中千旱和低溫是其兩個(gè)顯著的特點(diǎn)，這樣的特殊環(huán)境下蘊(yùn)藏著大量豐富的低溫微生物資源。研究、開發(fā)該地區(qū)低溫微生物資源及其相應(yīng)的低溫酶類具有重要的戰(zhàn)略意義。脂肪酶(h)7a化，EC3丄1.3，甘油酯水解酶)是一種在自然界中普遍存在的酶類。按其來源可分為動(dòng)物、植物及微生物脂肪酶三大類。其中，微生物脂肪酶因其容易生產(chǎn)、易于擴(kuò)大等特點(diǎn)以及對(duì)脂肪類物質(zhì)專一性的分解特性，使其在洗滌、食品加工、皮革加工、有機(jī)合成化工產(chǎn)品、香料、藥物制備、油脂加工等方面得到廣泛應(yīng)用，成為世界主要工業(yè)用酶制劑之一。脂肪酶已從多種不同的微生物中分離如青霉(黃建忠等，工業(yè)微生物，25(3):1~5，1995)、白地霉(謝舜珍，微生物學(xué)報(bào)，26(3):260~264,1986)、根霉菌(金其榮等，工業(yè)微生物，25(1):17~20,1995)、類產(chǎn)堿假單胞菌(吳松剛等，微生物學(xué)報(bào)，37(1):32~39)、假單胞菌(《o&i^a等，美國專利USPate^5846801，1998年12月8日)、々支絲酵母等(『z.〃/a附等,Afz'cra6/a/五"2jwes1awt/S/ofec/z"o/ogv,應(yīng)用科學(xué)出版社出版，225~247,1983)。其中多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度在50°C左右，在低溫時(shí)酶活力很低。而低溫脂肪酶具有的最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點(diǎn)，在某些領(lǐng)域有著中溫脂肪酶所不可比擬的優(yōu)越性。低溫脂肪酶應(yīng)用于有關(guān)的工業(yè)生產(chǎn)可筒化生產(chǎn)工藝，節(jié)能降耗，保護(hù)環(huán)境，同時(shí)可降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。微生物產(chǎn)生的脂肪酶種類多，但是來源不同的脂肪酶具有多方面不同的性質(zhì)，從而導(dǎo)致微生物脂肪酶各具特色的應(yīng)用范圍，因此低溫酶的應(yīng)用前景廣闊，需要持續(xù)不斷地開發(fā)新特性脂肪酶以更好地滿足工業(yè)需要。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌主要以細(xì)菌為主，兼少量酵母。如低溫微球菌(ikfcracocc^朋tor"/c^)T2所產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為35。C、pH8.0(劉洪杣等，一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法，專利公開號(hào)CN1611600A);適冷性海洋酵母(！^rcw/fl/zjw/y"c力Bo/^/wa-9145產(chǎn)生的低溫脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為35。C,在0。C時(shí)保持20%的相對(duì)酶活力，最適pH8.5、pH4.0~9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性差(邵鐵娟等，微生物學(xué)報(bào)，6:789-792,2004);南大洋深海嗜冷菌22521021產(chǎn)生的酶最適酶解條件為35°C、pH7.5;深海適冷假單胞菌CP"z^owo"ossp.)KB700A所產(chǎn)的低溫脂肪酶的最適酶活溫度也為35°C;方金瑞從深海泥樣分離到的菌抹EQ223產(chǎn)生的低溫脂肪酶的最適作用溫度為10°C;適冷菌(P化^fomo"wsp.)B1121產(chǎn)生的冷適應(yīng)脂肪酶最適作用溫度為45。C(林學(xué)政等，海洋學(xué)報(bào)，5:154-158,2005);氣單孢菌屬菌抹(爿erawo"必sp.)LPB4產(chǎn)生的低溫酶最適酶解溫度為l(TC(丄ee等，/owrwa/o/A//croZ/o/ogy,22-27,Aforc/z2003);布支單孑包菌T^ewciowoMasyhag/產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為29°C、最適pH8.0(C/m^/a等，￡wJ5z》c/2e附，269:3321—3328,2002);耐冷假單胞菌屬(尸化z^omo"a;菌抹BTs10022產(chǎn)生的脂肪酶的最適酶解溫度為24°C、10。C仍可保持35。/。的相對(duì)酶活力，最適pH為8.0,在pH7~9范圍內(nèi)具有較高的酶學(xué)特性(俞勇等，高技術(shù)通訊，10:89-93，2003);嗜冷桿菌屬(P^c/zraZ^cfersp.)7195所分泌的脂肪酶最適作用溫度為30°C，最適pH值為9.0,對(duì)熱敏感，60。C熱處理10min，剩余酶活為30%,是典型的低溫酶(張金偉等，生物磁學(xué)，6(1):6-10，2006);發(fā)光桿菌屬(尸/wtok"en^m)D2菌林所產(chǎn)脂肪酶的最適作用溫度在35。C左右,證明其為低溫酶，最適pH值為8(林容霞等，北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，33(1)'.31-35,2006)。國內(nèi)外尚未見有關(guān)霉菌產(chǎn)生低溫脂肪酶的報(bào)道。關(guān)于脂肪酶產(chǎn)生菌-白地霉，國內(nèi)只有零星的菌種選育和發(fā)酵生產(chǎn)的研究報(bào)道(謝舜珍，微生物學(xué)報(bào)，26(3):260-264,1986),國外雖已克隆了多個(gè)白地霉脂肪酶基因，并進(jìn)行了酵母表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)測定(fiwto///^等，￡從腸c/2柳，219:119~125,1994;幼/腿d"等，B/oc/zew,106:383~388,1989;爿/tew/7/""等，VCH,16:237~241,1990),但報(bào)道的白地霉脂肪酶都不是低溫脂肪酶。從微生物發(fā)酵液中分離純化酶的常用方法有沉淀分離和層析分離。沉淀分離純化酶的收得率高，一般在80%以上，但純度較低。層析分離方法分離純化酶的收得率低，一般在15~40%之間，純度在60%以上。在目的產(chǎn)物(酶)分子量已知的情況下，選擇葡《糖凝膠過濾(S卬/2^fec)技術(shù)比常用的離子交換層析技術(shù)更簡便和更易于操作。因此，對(duì)于不同酶類的提取、分離，需要針對(duì)不同微生物及相應(yīng)的產(chǎn)物性質(zhì)來決定選擇不同的提取技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)目前國內(nèi)外尚未報(bào)道霉菌產(chǎn)生低溫脂肪酶的現(xiàn)狀，根據(jù)不同酶類的提本發(fā)明提供了從新疆寒冷地區(qū)含油凍土中篩選出的產(chǎn)生低溫中性脂肪酶的白地霉菌4朱ch-3及由此產(chǎn)生的新型低溫中性脂肪酶。同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造性地運(yùn)用雙水相萃取和5fep力scfexG-75凝膠過濾技術(shù)的有機(jī)結(jié)合提取、純化獲得低溫中性脂肪酶。本發(fā)明通過對(duì)新疆高寒地區(qū)的含油凍土樣本進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離，獲得一批低溫微生物，并從中分離篩選出一抹低溫脂肪酶產(chǎn)生菌，編號(hào)為ch-3，從而提供了一林具有生產(chǎn)低溫中性脂肪酶優(yōu)良特性的脂肪酶產(chǎn)生菌。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》和對(duì)ch-3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化纟企測及18SrRNA同源分析確定ch-3菌才朱為白i也霉菌才朱(Gec^/c/zMWcfifwc//<iMw)。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種低溫中性脂肪酶，通過利用本發(fā)明的菌抹經(jīng)過本發(fā)明確定的具體發(fā)酵工藝及相應(yīng)的提取技術(shù)而獲得。本發(fā)明具體提供了一種低溫中性脂肪酶菌林，命名為ch-3，其能夠產(chǎn)生低溫中性脂肪酶。該菌林已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)大屯路曱3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2007年3月12日，保藏號(hào)是CGMCCNo.1972。該菌抹最適生長溫度是20°C;優(yōu)先生長于麥芽汁培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PDA(去皮馬鈴薯水=1:5煮沸半小時(shí)，用紗布過濾，濾液加水稀釋至原來的體積，再加1%蔗糖和1.5。/。瓊脂粉，自然pH)。20。C下培養(yǎng)3d的菌落直徑為30-40mm,白色粉狀，菌落中心突起，有放射線。當(dāng)菌落表面被擾動(dòng)時(shí)，變成似酵母的粘稠狀。顯微鏡下觀察，具有真菌絲，有的有二叉分枝，橫隔或多或少。菌絲寬37um,繁殖方式為裂殖。形成的節(jié)孢子單個(gè)或連接成鏈，孢子呈長筒形、方形，也有橢圓或圓形，末端鈍圓。節(jié)孢子絕大多數(shù)為3~6x6~12um。根據(jù)以上的形態(tài)特征初步確定菌株ch-3屬于地霉屬。菌抹ch-3能水解蛋白、液化明膠、胨化牛奶，利用蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉為唯一碳源。通過BLAST同源比對(duì)，菌抹ch-3的18SrRNA序列與Geo^/c/mmca/^//^w2IF04599的18SrRNA序列的相似性最高，因而將菌才朱ch-3確定為地霉屬白；也霉(GeoWc/mwca"c/Wwm),該菌種簡稱為G.ca"cfe/Mmch-3。本發(fā)明通過G.ch-3發(fā)酵獲得的低溫中性脂肪酶具有優(yōu)良的低溫活性，最適反應(yīng)溫度是35。C,在2040。C酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度升高，酶活力迅速下降。20。C保溫30min可保持90。/。的酶活力，而5(TC保溫30min,僅有55%的酶活力。這一性質(zhì)在工業(yè)上具有很重要的開發(fā)潛能。該酶的最適pH是7.0,在pH6.5-8.0范圍內(nèi)溫育3h能保持原來酶活的93%以上。Fe2+、Cu2+、Mn2、t本發(fā)明的脂肪酶有較強(qiáng)的激活作用；Ca^有輕微的激活作用；Mg^和EDTA對(duì)酶有一定的抑制作用，表明本發(fā)明的脂肪酶是一種金屬酶。通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，選用廉價(jià)普通的營養(yǎng)成分，采用常規(guī)單批發(fā)酵方式，搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)18.9U/mL。本發(fā)明進(jìn)一步建立了菌種篩選、鑒定、保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。(一)菌種篩選從新疆油脂化工廠油污排放池采集含油凍土，每克土樣與9mL無菌水混合，加無菌小玻璃珠振蕩搖勻后靜置片刻，取5mL上清液加入到富集培養(yǎng)液(橄欖油2%,蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%,(NH4)2SO40.5%,MgS04*7H200.05%,K2HP040.4%,KH2PO40.1%,CaCl20.05%,pH7.5)中，20°C、150rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)4d后，取5mL培養(yǎng)液加入另一新鮮富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。如此重復(fù)5-6次后，取富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水梯度稀釋，涂布分離培養(yǎng)基平板(0.1%(NH4)2S04，0.1%K2HPO4,1%KC1,0.05%MgSO4*7H2O,0.001%FeSO4'7H2O，12%橄欖油和聚乙烯醇乳化液，2%瓊脂)，倒置于20。C溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d以上，將有黃色變色圈的菌落挑至LB斜面保藏，同時(shí)挑起一環(huán)至LB培養(yǎng)液中，2(TC搖瓶振蕩培養(yǎng)48h后，離心，取30uL上清液加入羅丹明B定性平板(將羅丹明B溶解于去離子水中，使其終濃度為lmg/mL,過濾除菌?；A(chǔ)培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60。C,加入3.125%橄欖油和1%的羅丹明B溶液，混合后靜置10min,以消除泡沫，倒平板，平板呈不透明粉紅色。)的孔中，于20。C培養(yǎng)48h再在350nm紫外光下觀察，產(chǎn)脂肪酶的微生物發(fā)酵液周圍有橘黃色熒光圈。挑選熒光圈大的菌落接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，22°C、150rpm下培養(yǎng)48h,取發(fā)酵上清液測定脂肪酶活性。(二)菌種鑒定根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌抹G.ca"c/Wwmch-3的形狀、大小、生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測，本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌G.cflwfe/wwch-3的生物學(xué)特性如表1所示。表1低溫脂肪酶產(chǎn)生菌白地霉ch-3的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>利用真菌18SrRNA的通用引物cal8spF2(5，-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3)cal8spR(5，匿TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3，)以菌抹ch-3的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94。C30s,50。C30s，72。C2min,32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Takara膠回收試劑盒純化后，與pG五Af-reo^載體連4妄，轉(zhuǎn)化Eco/ZJM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆，經(jīng)測序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺玫?8SrRNA序列與Ge"^wA數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Gc朋&Wwmch-3與白地霉Geo^c/mmc朋&甴wIF04599的18SrRNA序列相似性最高，為99%，表明二者的親緣關(guān)系最近。本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌G.ca"AWwmch-3的18SrRNA序列:^下1CTGCGAATGGACTTGGATAA101GTTTCCGGCTGGTGAATCAT201TCATTCAAATCATGGTTTTA301CCTGAGAAACCCAATCCTGA401TTAGGTCTCGAATAGAGGGC501GTATATATTAGTAGGGGCGG601TAAACTTTCTAATTAGAGTG701AATAGAATAGATGATTAATA801ATTCTTGGATGTTTTCATTA901CGTCGTAGTCTAATAACCTC1001GGGAGTATGGACCAGGAGTG1101CAGGTCCAGATGTGGGTGGT1201TTAATTGCGAAGATTATTGT1301TGGAAGTTTGCGCACGCGCG1401GTATGGGTAATTATTGCTCT1501GTTGATTACGTGAATGGCTT1601TCTGGTTGAACTCATTAAATCCGTGGTAATGGTATTTATTAATAACTTGTTTCTGCCCTAACGGGTAACGGGCTACCACACACAGGGAGGTAATTGGAATAAGTTCTGGGAAGTTTTGCATCTCTTTTAGATTTATTTAGTTCAAAAGCAGACGTATGGTGGGACGGTCGTTACTGAAGAATCAAGAACGTTAACCGTAATCCGGCACCTTTGCAAGGCTGAGCCTGCGGCACAATAAGGGGTGCATGGCTAACGAACGATTTGACAGCTAGGCAATAACCTACACTGACTCTTGTGAAATCAACGAGGATCCCTGCCCTAGTGAGGCTTCGAGAAGCTACAGTTATCGTTCTAGAGCTAAGATAAAAAACGAATCGCATTCAACTTTCGGGGAATCAGGTCCAAGGAAGTAGTGACAATGAGAACAATTCCAGCAGCCCGTAAAAAGCTAGTACTACCCGAAGTGTAAAGGCCTTTGCTTCTATTTTGTGGGGCATCAGCTAACTACTGAAAGTTAGGGACTATGCCGATACGAGAAATGAAACTTAAACTTAATTTGAATTGACAGATCGTTCTTAGTGACCTTAACCTCTTAGAGGGAGGTCTGTGAGGAGCCAGCGCTCCGTCGTGATTCCTAGTATTGTACACACCCGGATTGATGTCAAACTTGTTATTTGATAATACATGCTACCAATGCCTTGGCCTTGTGCATGGTAGGATGTTCGATTCCGCAGCAGGCGAAATAACGATTAAATACCTTCGGTAATTCCCGTAGTTGAATGAAACATCTCCAAACATTTCGAATATATTTGGTTTCTAGTATTCAGTTGCGAAAGCATTGATCGAAGACCTAGGGATCGCAAAGTTTTTGGAATTGACGCTCAACACGGTGAGAGCTCTTGGTGGAGTGTGCTAAATAGACTATCGATTTGCCCTTAGAAGTCTAACCTCTGGGGATAGAGCGCAAGTCCGCCCGTCGCTAACTGGAGAGTCATTTAGATTACATTACTAAACGGCCGGCGGGCTCTATTGGCGATGGTAGAGGCCTACGGAGAGGGAGCGCAAATTACACGGGGCCTAAACGAGGAACAGCTCTGATAACTTGGGTGCTTCTTTGGTGACTTTGAAAAAGCATGGAATGACCGTCGTATCAGAGGGAATGCCAAGGACGATCAGATACGAGGGCGTTAGGGTTCTGGGGAAGGGCACCGGAAACTCACTTCATGATTTATTTGTCTGCCTGTAACAATTTCAAGTCGACGTTCTGGGCGTGCCGAGAGAGCATTGCAAATCAGCTTGCTACTACCGATGGGCAACTTTGGAAGTA通過對(duì)菌抹G.caw&WMWch-3的18SrRNA同源序列進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)GeoWc/7Mmc朋A^附IF04599與其在同一分支，其進(jìn)化拓樸結(jié)構(gòu)參見附圖3所示。結(jié)合低溫脂肪酶產(chǎn)生菌ch-3的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，確定其為地霉屬的白i也霉菌才朱(G^ofn'c/zM附ca"(i/(iwm)。(三)菌種保藏真空冷凍干燥或石蠟油保存。無菌條件下將100%石蠟油加入試管斜面上，使石蠟油液面超出培養(yǎng)基斜面，完全隔絕空氣對(duì)菌種的影響，將菌種保存于-7(TC的超低溫冰箱中。(四)菌種活化從石蠟油中取一菌種移植塊，接種到PDA培養(yǎng)基上，在2025。C下培養(yǎng)1天左右，再轉(zhuǎn)接到一新鮮PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)活化數(shù)次，就可進(jìn)行菌抹其它實(shí)驗(yàn)的測定。(五)菌種復(fù)壯首先按步驟(四)活化菌林，然后在篩選培養(yǎng)基中接種活化好的菌抹并進(jìn)行培養(yǎng)，檢測菌抹周圍的變色圈和橘黃色焚光圈的大小，選取變色圈和橘黃色熒光圈大的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將此菌抹作為生產(chǎn)菌株使用。本發(fā)明還具體提供一種低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其包括(一)對(duì)G.ca"A^wch-3CGMCCNo.1972進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟；(二)利用如上步驟獲得的活化菌種進(jìn)行發(fā)酵步驟；(三)發(fā)酵后的純化、提取步驟。具體的，本發(fā)明提供了一套完整的脂肪酶產(chǎn)生菌篩選方案。我們從新疆昌吉市采集冰凍的含油土壤，采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的橄欖油-溴曱酚紫指示劑平板和羅丹明B平板從中篩選出12林脂肪酶產(chǎn)生菌。又通過滴定法復(fù)篩，測定所有產(chǎn)酶菌的脂肪酶活性，最終確定其中產(chǎn)生低溫脂肪酶且產(chǎn)酶性質(zhì)較穩(wěn)定的(7.ca"(i/<iMmch-3為生產(chǎn)菌才朱。本發(fā)明的低溫中性脂肪酶的產(chǎn)生菌，既可為本發(fā)明所保護(hù)的菌株，也可為自然篩選的原始菌抹，或?yàn)楸Ｗo(hù)菌抹通過自然變異或人工誘變產(chǎn)生的變異菌抹，通過本發(fā)明所述的方法，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所闡述的技術(shù)效果。作為上述變異菌株的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照等各種射線處理；化學(xué)誘變，如亞硝基胍、硫酸二乙酯等化學(xué)誘變劑處理，用常規(guī)脂肪酶產(chǎn)生菌分離篩選培養(yǎng)基及方法優(yōu)選出生產(chǎn)性能優(yōu)異的菌抹。另外，也可通過分子生物學(xué)技術(shù)，從原始菌或誘導(dǎo)變異菌中獲取低溫中性脂肪酶基因，以原核生物如大腸桿菌等作為基因受體菌，構(gòu)建基因工程生產(chǎn)菌抹，也可作為本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌種。白地霉Gcam^/wmch-3產(chǎn)酶培養(yǎng)基的培養(yǎng)源可廣泛使用通常用于培養(yǎng)的培養(yǎng)源包括碳源、氮源、無機(jī)鹽以及其它必要的營養(yǎng)物質(zhì)。在不同的碳源培養(yǎng)基中，本發(fā)明Gca"AWwwch-3的產(chǎn)酶能力有很大差異，以可溶性淀粉為碳源時(shí)最有利于產(chǎn)酶，酶活可達(dá)14.7U/mL;而以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液產(chǎn)生較低的酶活。本發(fā)明Gca"&血柳ch-3的氮源的選4奪和用量，可根據(jù)其它培養(yǎng)源的成分和用量的不同而不同，玉米漿為氮源最有利于產(chǎn)酶，此時(shí)酶活力達(dá)到20U/mL;其次是酵母粉；以乙酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)，幾乎不產(chǎn)酶。通過氮源濃度的研究可知，玉米漿濃度為2.0%時(shí)，酶活最高。不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明Gcam//^w7ch-3在24。C培養(yǎng)48h時(shí)酶活力最高。不同起始pH對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明不同的培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響很大，在起始pH8.0時(shí)Gc朋&V/wmch-3的酶活力最高。不同搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明最適裝液量為90niL。不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明最佳接種量為10%。不同接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，菌體在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入種齡48h的種子，有利于產(chǎn)酶。油脂在脂肪酶合成過程中起碳源的作用，同時(shí)也是誘導(dǎo)物，因此油脂是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的一個(gè)重要組分。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入10g/L的各種油脂，在特定條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測酶活，結(jié)果表明豆油是最好的誘導(dǎo)物，而甘油、豬油和菜籽油對(duì)該酶的形成有一定的抑制作用。無機(jī)鹽類對(duì)Gc朋&^mch-3產(chǎn)酶的影響不同。以不加鹽類的酶活力為100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10mmol/L的Fe2+、Cu"和Mn"對(duì)酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用；而Zn2+、Mg2+、Na+、K+及EDTA對(duì)酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最為明顯。G.ccfe^mch-3經(jīng)搖瓶培養(yǎng)48h,耳又發(fā)酵上清液分析酶的性質(zhì)。G.ca"J/JM附ch-3發(fā)酵上清液中的脂肪酶最適作用溫度為35°C,在0。C可保持66%的相對(duì)酶活力，對(duì)熱較敏感；最適pH為8。標(biāo)明G.c朋&^mch-3產(chǎn)生的脂肪酶為低溫脂肪酶。通過雙水相萃取和SephadexG-75凝膠過濾兩步純化，從Gca"^iMmch-3發(fā)酵液中分離、獲得了電泳均一的蛋白，用SDS-PAGE測得該蛋白的分子量約為38kDa。通過酶活性測定及凝膠電泳酶活性條帶印跡實(shí)驗(yàn)，證明以上純化的38kDa蛋白確為脂肪酶，我們將其命名為LIP3。搖并瓦發(fā)酵脂肪酶比活力為4.65U/mg,經(jīng)兩步法純化后提高到337.5U/mg,純化后酶活性得率為16.3%，純化倍數(shù)為72.6。通過雙水相萃取和反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移兩種酶提取方法的比較，可看到反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法造成G.ca"&^#wch-3的脂肪酶活力損失較大，而雙水相萃取法使酶活力損失較小。采用雙水相萃取法純化脂肪酶的最佳條件為PEG濃度為15%,硫酸銨濃度為22.5y。及pH8.0,此時(shí)脂肪酶的比活力提高到40.3U/mg，純度提高了8.6倍。在不同溫度下按常規(guī)法測定酶活力，獲得的LIP3最適作用溫度為35°C。在2040。C酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度的升高，酶活力迅速下降。5(TC保溫30min，僅有55%的酶活力。可見LIP3對(duì)熱敏感，是一種低溫脂肪酶。按常規(guī)法測定酶活力。由pH-酶活力曲線可以看到脂肪酶最適pH為7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH穩(wěn)定性曲線可以看出該酶在pH6.5-8.0范圍內(nèi)酶活力可保持在95%以上?？梢娭久窵IP3為低溫中性脂肪酶。實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用；而Mg21。EDTA對(duì)酶有一定的抑制作用。為了降低酶失活的速度，我們還研究了保藏條件和保護(hù)劑對(duì)脂肪酶活力的影響。本發(fā)明提供的G.c朋&甴wch-3是具有良好商業(yè)應(yīng)用前景的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌，產(chǎn)酶溫度穩(wěn)定，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低廉，有利于進(jìn)一步開拓低溫微生物資源的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明提供的LIP3為新型低溫中性脂肪酶，最適作用溫度為35。C,最適pH為7.0,可廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)學(xué)制品等領(lǐng)域中。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。1、定向篩選到低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌ch-3，經(jīng)鑒定為白地霉菌抹(GeoWc/wmca"J/^Mw，Gc"w^iMm)，經(jīng)搖并瓦發(fā)酵實(shí)'瞼i正明Gcw7d/dwwch-3發(fā)酵上清液中的脂肪酶是一種對(duì)熱較敏感的低溫脂肪酶。2、經(jīng)雙水相萃取和Sep/^^fecG-75凝膠過濾兩步法純化后Gc""^/wwch-3的脂肪酶比活力由原來的4.65U/mg，提高到337.5U/mg,酶純度提高了72.6倍，酶活性得率為16.3%。3、純化獲得的脂肪酶LIP3的最適作用溫度為35°C。在2040。C酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度的升高，酶活力迅速下降；50。C保溫30min，僅有55%的相對(duì)酶活力?？梢奓IP3對(duì)熱敏感，是一種低溫脂肪酶。4、純化獲得的脂肪酶LIP3最適pH為7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH穩(wěn)定性曲線可以看出該酶在pH6.5-8.0范圍內(nèi)可保持95%以上的酶活力?？梢娭久窵IP3為低溫中性脂肪酶。圖1A和B為定向篩選GcawA^mch-3時(shí)在羅丹明B和溴曱酚紫指示劑平板上產(chǎn)生熒光圈和黃色變色圈的情況。圖2A為Gc朋A^mch-3的發(fā)酵粗酶液的溫度-酶活力曲線；B示粗酶液的pH-酶活力曲線。圖3為Gch-3的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖4A為低溫中性脂肪酶LIP3的溫度-酶活力曲線；B示LIP3的熱穩(wěn)定性曲線。圖5A為低溫中性脂肪酶LIP3的pH-酶活力曲線；B示LIP3的pH穩(wěn)定性曲線。圖6為金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響。圖7A為保藏條件對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響；B示保護(hù)劑對(duì)LIP3活力的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的橄欖油-溴甲酚紫指示劑平板法從新疆昌吉市油脂化工廠含油凍土中篩選出12林脂肪酶產(chǎn)生菌，再轉(zhuǎn)接到羅丹明B平板上進(jìn)一步鑒定和檢測，最后接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行脂肪酶活性測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中白地霉(Geofn'c/wwc""A^m)ch-3在橄欖油-溴曱酚紫指示劑平板上形成的黃色變色圈與菌落直徑的比值較大，產(chǎn)生的脂肪酶活力較高。參見附圖1A可看到白地霉(Geo/n'c/7wmca"AV/wm)ch-3在羅丹明B平4反上形成橘黃色焚光圈；附圖1B顯示白地霉ch-3在油脂同化平板上形成黃色變色圏的情況。Gc朋A^mch-3經(jīng)搖瓶培養(yǎng)48h,取發(fā)酵液上清分析酶的性質(zhì)。參見附圖2A溫度-酶活力曲線和附圖2BpH-酶活力曲線可以看到白地霉發(fā)酵上清液中的脂肪酶最適作用溫度為35°C,在0。C可保持66%的相對(duì)酶活力，對(duì)熱較敏感；最適pH為8，表明Geo^'c/mmcaw&^mch-3產(chǎn)生的脂肪酶是低溫脂肪酶。實(shí)施例2:產(chǎn)酶菌林的鑒定菌抹Gca"A甴mch-3在PDA和麥芽汁培養(yǎng)基上20。C培養(yǎng)2-3d的菌落直徑為3040mm,白色粉狀，菌落中心突起，有放射線。當(dāng)菌落表面被擾動(dòng)時(shí)，變成似酵母的粘稠狀。顯微鏡下觀察，具有真菌絲，有的有二叉分枝，橫隔或多或少。菌絲寬37um,繁殖方式為裂殖。形成的節(jié)孢子單個(gè)或連接成鏈，孢子呈長筒形、方形，也有橢圓形或圓形，末端鈍圓。節(jié)孢子絕大多數(shù)為3~6x6~12um。才艮據(jù)以上的形態(tài)特征初步確定菌4朱ch-3屬于地霉屬。為了進(jìn)一步確定菌抹GcawA'^mch-3的分類學(xué)位置，我們測定了其18SrRNA基因序列。以菌抹Gc朋W^mch-3的基因組DNA為模板，cal8spF2和cal8spR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C30s,50°C30s,72。C2min,32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)T^ara膠回收試劑盒純化后，與pG￡M-7kw少載體連接，轉(zhuǎn)化co//JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆、測序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺玫?8SrRNA序列與NCBI中已公布的真菌18SrRNA序列進(jìn)行相似性比4交分片斤，結(jié)果表明菌4朱Gcaw^/wmch-3與G^o/n'c/mmca"&V/wwIF04599的相似性最高為99%,表明菌株ch-3與Geo^/c/mwc朋&^wIF04599的親緣關(guān)系最近，它們?cè)谙到y(tǒng)進(jìn)化樹的同一分支，參見附圖3所示，因而菌抹ch-3是地霉屬白地霉菌林(Geo/n'c/2畫caw&Vi謂)。引物選用cal8spF2(5'-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3，)和cal8spR(5'-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3，)。實(shí)施例3:低溫中性脂肪酶活性測定方法才艮據(jù)中華人民共和國輕工業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)GB/T1803-93(2002),工業(yè)酶制劑通用試-險(xiǎn)方法，在測試過程中溫度i殳定為35°C。A4.1定義lg固體酶粉(或lmL液體酶)，于一定溫度和pH的條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生lumoL的脂肪酸，即為一個(gè)脂肪酶國際單位，以U/g(或U/mL)表示。A4.2原理脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋》文的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)石威溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示液指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活力。反應(yīng)式為RCOOH+NaOH—RCOONa+H2016A4.3試劑和溶液A4.3.1聚乙烯醇(PVA)聚合度1750士50。A4.3.2橄欖油采用中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。A4.3.395%(r/F)乙醇(GB679)A4.3.4底物溶液的制備a.稱取聚乙烯醇(PVA)40g,加水800mL,在沸水浴中加熱、攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1000mL。以干凈的雙層紗布過濾，取濾液備用；b.量取4。/oPVA溶液(A4.3.4a)150mL，加橄欖油50mL，用高速組織搗碎機(jī)處理6min(分2次處理，每次3min,中間休息5min)，即成乳白色PVA乳化液。該溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配。該溶液如貯存在冰箱中，有效期為一周。A4.3.50.025mol/L磷酸緩沖液(pH=7.5)曱液稱取磷酸二氫鉀(KH2P04)17.Gig,加水溶解并定容至500mL。乙液稱耳又石粦酸氫二鈉(Na2HP04.12H20)44.77g,加水)容解并定容至500mL。使用液吸取曱液13mL,加乙液100mL,混勻，即成0.25mol/L磷酸緩沖液。使用時(shí)用水稀釋10倍，即成0.025mol/L磷酸緩沖液，用pH計(jì)校正。A4.3.6氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c(NaOH)-O.05mol/L3要GB601配制與標(biāo)定c(NaOH)=0.5mol/L氬氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4吏用時(shí)，準(zhǔn)確稀釋10倍。A4.3.710g/L酚酞指示液4安GB603配制。A4.4儀器和設(shè)備A4.4.1恒溫水浴35±0.2°C。A4.4.2高速組織搗碎機(jī)8000~12000r/min。A4.4.3pH計(jì)分度值為0.02pH單位或2mV。A4.4.4電磁攪拌器。A4.4.5微量滴定管10mL，分刻度^0.05mL。17A4.5分析步驟A4.5.1待測酶液的制備A4.5.2測定A4.5.2.2指示劑滴定法(第二法)a.取兩個(gè)lOOmL三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中，各加底物溶液(A4.3.4)4.00mL和磷酸緩沖液(A4.3.5)5.00mL,再于A瓶中加入95%乙醇(A4.3.3)15.0mL,于35士0.2。C水浴預(yù)熱5min，然后，在兩瓶中各加待測酶液1.00mL，立即混勻計(jì)時(shí)，在35士0.2。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，在B瓶中立即^卜力。95%乙醇15.OmL終止反應(yīng)，取出；b.于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至孩i紅色并保持30s不—逸為其終點(diǎn)，記錄消庫毛0.05mol/L氬氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。A4.6計(jì)算樣品的酶活力(U/mL)=10/3x(B-A)xn式中B—滴定樣品時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;A—滴定空白時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;n—稀釋倍數(shù)。實(shí)施例4:產(chǎn)酶條件的研究1.碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響以文獻(xiàn)報(bào)道的脂肪酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變碳源種類，24。C下?lián)u瓶發(fā)酵48h，發(fā)酵液離心去除菌體沉淀測酶活。以1%橄欖油為碳源時(shí)酶活力為100%,結(jié)果見表2。從表2可以看出，在不同的碳源培養(yǎng)基中，白地霉(GeoWc/2w附c朋&^w)ch-3的產(chǎn)酶能力有很大差異，以可溶性淀粉為碳源最有利于產(chǎn)酶，酶活可達(dá)14.7U/mL;而以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液產(chǎn)生較低的酶活，這與前人報(bào)道的葡萄糖對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪酶不利的結(jié)論相吻合。表2碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2.氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響以1%可溶性淀粉為碳源，加入2%不同氮源，24。C下?lián)u瓶發(fā)酵48h,發(fā)酵液離心去除菌體沉淀測酶活。以2%豆餅粉的酶活力為100%,結(jié)果見表3。從表3可以看出，玉米漿為氮源最有利于產(chǎn)酶，此時(shí)酶活力達(dá)到20U/mL;其次是酵母粉；以乙酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)，幾乎不產(chǎn)酶。通過氮源濃度的研究可知，玉米漿濃度為2.0%時(shí)，酶活最高。表3氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響以1%可溶性淀粉為碳源，2%玉米漿為氮源，培養(yǎng)基初始pH6.0,500mL三角瓶裝液量100mL，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，分別在20。C、22°C、24°C、26。C和28。C五個(gè)溫度下培養(yǎng)llh、25h、48h、72h、98h和120h后測定酶活，結(jié)果見表4。由表4可知，白地霉ch-3在24。C培養(yǎng)48h時(shí)產(chǎn)生的脂肪酶活力最高。表4培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>4.不同起始pH對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響將產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值用NaOH或HC1分別調(diào)至pH6.5~8.5,以0.5個(gè)pH為一個(gè)單位，24。C下?lián)u瓶發(fā)酵48h，離心取發(fā)酵液上清測酶活力，結(jié)果表明不同的起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響很大，在pH8.0時(shí)酶活力最高，如表5所示。表5培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>5.不同搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響控制搖床轉(zhuǎn)速在180r/min,在500mL三角瓶中分別裝入30mL、60mL、90mL、100mL、120mL和150mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，24。C下?lián)u瓶培養(yǎng)48h測酶活，如表6,結(jié)果表明最適搖瓶裝液量為90mL。表6搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>6.不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響將培養(yǎng)48h的種子培養(yǎng)液，分別以2%、5%、10%和20%(V/V)的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)條件同上，24。C搖瓶培養(yǎng)48h后測酶活，結(jié)果見表7，最佳接種量為10%。表7接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>7.最佳接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響白地霉ch-3接種于種子培養(yǎng)基中于20°C，180r/min分別培養(yǎng)14h、20h、38h、48h、63h和72h后，再以10%接種量接入起始pH8.0的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)48h后測酶活，見表8,結(jié)果表明產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入種齡48h的種子，有利于產(chǎn)表8接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>8.油脂對(duì)酶形成的影響油脂在脂肪酶合成過程中起碳源的作用，同時(shí)也是誘導(dǎo)物，因此油脂是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的一個(gè)重要組分。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入10g/L各種油脂，在特定條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測酶活，結(jié)果見表9。由表9可以看出，豆油是最好的誘導(dǎo)物，而甘油、豬油和菜籽油對(duì)該酶的形成有一定的抑制作用。表9不同油脂對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>9.無機(jī)鹽類對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)了8種無機(jī)鹽類對(duì)產(chǎn)酶的影響，以不加鹽類的酶活力為100%，結(jié)果見表10。由表10可知，10mmol/L的Fe2+、Cu"和Mn"對(duì)酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用；而Zn"、Na+、K+、Mg"及EDTA對(duì)酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最為明顯。此外，蔗糖可促進(jìn)該酶的產(chǎn)生，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。表10無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*各種金屬離子的終濃度為10mmoL/L。實(shí)施例5:低溫中性脂肪酶的分離、純化白地霉(GeoWc/wwc"^^/mw)ch-3接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基后，置于往復(fù)式搖床(180rpm)24。C發(fā)酵培養(yǎng)48h。取發(fā)酵液于4。C、6000rpm離心20min,收集發(fā)酵上清液即為脂肪酶粗酶液。將粗酶液進(jìn)行雙水相萃取。雙水相體系在22。C按重量配制。體系總質(zhì)量為10g,酶液量為3g。4要計(jì)算稱耳又一定量50%(m/m)PEG溶液和一定量成相的(NH4)2.S04固體鹽，不足部分以水補(bǔ)充。所配混合物定量轉(zhuǎn)到離心管，2000r/min離心5min,分相。讀出上、下相體積，用取樣器吸耳又一定量的上、下相溶液，測定酶活力和總蛋白含量。有關(guān)計(jì)算公式為相比R^上相體積/下相體積；分配系數(shù)K^上相萃取物濃度/下相萃取物濃度；萃取率C=RK/(1+RK)。為優(yōu)化雙水相萃取的條件，以脂肪酶比活力為指標(biāo)做三因素三水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明PEG濃度為15%，硫酸銨濃度為22.5%及pH8.0時(shí)脂肪酶的比活力達(dá)到最大，也是雙水相萃取的最佳條件。本步得到了純化倍數(shù)為8.6、酶活性收率為88%、比活力為40.3U/mg的脂肪酶。雙水相萃耳又后的酶樣品用PEG20000濃縮至l-2mL，上樣至預(yù)先用重蒸水平衡好的&//7^fecG-75凝膠過濾層析柱上(2x20cm)，用0.1mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.4mL/min,部分收集器分步收集洗脫液，自動(dòng)記錄儀記錄洗脫曲線，分別測定各管酶活力，合并酶活性峰各管的酶液，測定合并酶液的蛋白質(zhì)含量及酶活力，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和活性染色分析。經(jīng)Sep/z^fecG-75凝膠過濾后的脂肪酶比活力是雙水相萃取后的酶比活的7.4倍。經(jīng)過兩步法純化后脂肪酶被提純約73倍，酶活力回收率為16.3%,參見表11。表11低溫脂肪酶LIP3的純化結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>經(jīng)過雙水相萃取和Sep/wtfexG-75凝膠過濾兩步法純化獲得的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，呈現(xiàn)單一條帶，證明該蛋白已經(jīng)達(dá)到電泳純。用標(biāo)準(zhǔn)的不同蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)對(duì)Rf值作圖，求出該蛋白的分子量約為38kDa。將38kDa蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),電泳后的凝膠放在維多利亞藍(lán)指示劑平板(分別將2.5g瓊脂粉、6.25mL三丁酸甘油酯、18.75mL3g/dL聚乙烯醇、2.5mLlg/dL維多利亞藍(lán)和225mL磷酸緩沖液加入500mL三角瓶中，加熱溶解瓊脂粉，趁熱用高速組織搗碎機(jī)均質(zhì)，倒平i,靜置冷卻，制成含脂肪酶作用底物和指示劑的固體瓊脂平板)上，37。C反應(yīng)16h左右，可觀察到透明條帶出現(xiàn)。與SDS-PAGE凝膠電泳顯示的條帶進(jìn)行比較，它們的位置和數(shù)目相同，因此可以確定純化得到的38kDa蛋白是脂肪酶，將其命名為LIP3。實(shí)施例6:溫度對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3酶活力的影響1.LIP3最適作用溫度的測定及結(jié)果除了在pH7.0磷酸緩沖液中，分別置于20。C、25°C、30°C、35°C、40。C和50。C的溫度下反應(yīng)30min，其它條件都相同，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。測定、比較各溫度的酶活，35。C的條件下酶活最高，表明脂肪酶LIP3的最適作用溫度為35。C。結(jié)果參見附圖4A。2.LIP3熱穩(wěn)定性的測定及結(jié)果除了將酶液分別置于20。C、30°C、40°C、50。C和60。C下保溫30min后，迅速冷卻，再調(diào)至35°C，測定剩余酶活外，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。以同時(shí)置于35。C下測定的酶活力為100%對(duì)照，求出剩余酶活。由附圖4B可知，在204(TC的溫度范圍內(nèi)酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度升高，酶活力迅速下降。20。C下保溫30min后再在35。C測定，剩余酶活為90%，50。C保溫30min后測定的剩余酶活僅為55%。可見LIP3對(duì)熱敏感，在低溫下活力較高、較穩(wěn)定，因而是一種低溫脂肪酶。實(shí)施例7:pH對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3酶活力的影響配制不同pH值的緩沖液(1)0.1mol/L醋酸緩沖液的配制(pH5.0、pH5.5)溶液A:0.2mol/L醋酸(11.55mL冰醋酸溶于1L水)。溶液B:0.2mol/L醋酸鈉(16.4g醋酸鈉溶于1L水)。取14.8mL、0.2mol/L醋酸與35.2mL、0.2mol/L醋酸鈉溶液混合，最后稀釋成lOOmL，即配制成pH5.0醋酸緩沖液；取4.8mL、0.2mol/L醋酸與45.2mL、0.2mol/L醋酸鈉溶液混合，最后稀釋成lOOmL,即配制成pH5.5醋酸緩沖液。(2)0.lmol/L磷酸緩沖液的配制(pH6.0~8.0)溶液A:0.2mol/LNaH2P04(27.8g溶于1L水)。溶液B:0.2mol/LNa2HP04(53.65gNa2HP04.7H20溶于1L水)。取87.7mL、0.2mol/LNaH2P04與12.3mLNa2HP04混合后，用水稀釋至終體積為200mL,即配制成pH6.0磷酸緩沖液；取68.5mL、0.2mol/LNaH2P04與31.5mLNa2HP04混合后，用水稀釋至終體積為200mL,即配制成pH6.5磷酸緩沖液；取39.0mL、0.2mol/LNaH2P04與61.0mLNa2HP04混合后，用水稀釋至終體積為200mL,即配制成pH7.0磷酸緩沖液；取16.0mL、0.2mol/LNaH2P04與84.0mLNa2HP04混合后，用水稀釋至終體積為200mL,即配制成pH7.5磷酸緩沖液；取5.3mL、0.2mol/LNaH2P04與94.7mLNa2HP04混合后，用水稀釋至終體積為200mL,即配制成pH8.0磷酸緩沖液。(3)0.lmol/LTris-HCl緩沖液的配制(pH8.5、pH9.0)1.pH對(duì)LIP3酶活力的影響以上述不同pH值的緩沖液配制底物和稀釋酶液，分別在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的磷酸緩沖液中35。C下反應(yīng)30min,其它條件都相同，然后測定酶活，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。測定、比較各pH值的酶活大小，在pH7.0酶活最高，結(jié)果參見附圖5A。由附圖5A可知脂肪酶LIP3反應(yīng)最適pH為7.0。低于6.5酶活力急速下降。2.pH對(duì)LIP3穩(wěn)定性的影響(pH5.0~9.0),35。C保溫3h后，用pH7.0的磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋，測定剩余酶活，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。結(jié)果表明，脂肪酶LIP3在pH6.5-8.0范圍內(nèi)可保持93。/。以上的酶活力，參見附圖5B。表明LIP3是一種低溫中性脂肪酶。實(shí)施例8:金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)LIP3酶活力的影響除了1Ommol/L的各種金屬離子溶液分別與酶液混合后在35T下保溫30min,其它條件都相同，測定酶活力，以未加金屬離子的酶液為100%對(duì)照，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。結(jié)果表明Fe2+、Cu2+、Mi^+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用；Ca^對(duì)酶有輕微的激活作用；Mgh和EDTA則對(duì)酶有一定的抑制作用，參見附圖6。實(shí)施例9:保藏條件和保護(hù)劑對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響1.保藏條件對(duì)LIP3活力的影響將酶液在4。C、-20。C和-70。C下分別放置lh,2h，6h,15h,30h和60h后測定酶活力隨時(shí)間的變化值，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。由附圖7A可知，低溫中性脂肪酶LIP3在4。C下貯存活力喪失較快，-20°C和-70。C下貯存酶活力均較為穩(wěn)定，其中-70。C適于短期^存，-20"適于長期|&存。2.保護(hù)劑對(duì)LIP3穩(wěn)定性的影響由于酶在使用過程中本身會(huì)發(fā)生降解，會(huì)失去部分活性，所以有必要尋找合適的保護(hù)劑，保持酶的穩(wěn)定性，降低酶失活的速度。在酶液中分別加入單糖、雙糖、多糖及多元醇至飽和，在不同溫度下》文置ld、2d、2.5d、4d、4.5d和6d,測定酶活力隨時(shí)間的變化值，以未加入保護(hù)劑的酶活力為100%，其它條件都相同，酶活測定方法具體參照實(shí)施例3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分別加入麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油和山梨醇后在25°C貯存4d，仍有70-85%的酶活力；從附圖7B可以看出20。C下酶活較高，酶活力變化曲線比較平緩；隨著溫度的升高，脂肪酶LIP3變得不穩(wěn)定，溫度越高，酶活力下降得越快。權(quán)利要求1、一種低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其包括，A，對(duì)白地霉(Geotrichumcandidum)CGMCC.No.1972進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟；B，利用步驟A獲得的活化菌種進(jìn)行發(fā)酵步驟；C，發(fā)酵后的純化提取步驟。2、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在菌種活化培養(yǎng)后該菌產(chǎn)酶的條件為起始pH8.0,培養(yǎng)溫度24。C,180rpm振蕩培養(yǎng)48h,其培養(yǎng)基含有重量百分比的1%可溶性淀粉、1%豆油、2%玉米漿、0.1%(NH4)2SO4、0.5%K2HPO4、0.1%MgS04'7H20和0.1%FeS04*7H20。3、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以玉米漿或酵母粉之一為氮源。4、如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，菌株最適生長溫度是20。C,按體積比計(jì)，最適裝液量為12-20%，最佳接種量為10%，最適發(fā)酵溫度24。C,攪拌速度為180rpm,發(fā)酵周期48小時(shí)。5、如權(quán)利要求1低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的發(fā)酵后的純化提取步驟，白地霉(GeoWctowcfl"&^w)CGMCC.No.1972的發(fā)酵液經(jīng)雙水相萃取和5^/za^fecG-75凝膠過濾純化，并用SDS-PAGE測得單一蛋白條帶，獲得純化的低溫中性脂肪酶。6、如權(quán)利要求5低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的雙水相萃取，雙水相體系在22。C按重量配制，體系總質(zhì)量為10g，酶液量為3g,在PEG濃度為15%，硫酸銨濃度為22.5%及pH8.0時(shí)獲得脂肪酶比活力最大。7、如權(quán)利要求5低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的&p/2^fecG-75凝膠過濾，雙水相萃取后的酶樣品用PEG20000濃縮至l-2mL,上樣至預(yù)先用重蒸水平衡好的2.0x20cm的6^A"&xG-75凝膠層析柱上，用0.1mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.4mL/min。全文摘要本發(fā)明公開了一種白地霉(Geotrichumcandidum)CGMCC.No.1972制備低溫中性脂肪酶的方法，通過采用雙水相萃取和SephadexG-75凝膠過濾的方法對(duì)白地霉發(fā)酵液進(jìn)行了分離純化。本發(fā)明通過提供的菌種是具有良好商業(yè)應(yīng)用前景的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌，產(chǎn)酶溫度穩(wěn)定，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低廉。其表達(dá)產(chǎn)物是一種新型低溫中性脂肪酶，最適作用溫度為35℃，最適pH為7.0，可廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)學(xué)制品等領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12N9/18GK101638644SQ20091020357公開日2010年2月3日申請(qǐng)日期2007年4月13日優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日發(fā)明者付建紅,古麗尼莎,斌姚,昆孟,歐陽平凱,石玉瑚,袁鐵錚申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所