專利名稱：一對擴增鐵原體屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測鐵原體屬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對擴增鐵原體菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測鐵 原體菌屬(Ferroplasma)的方法
背景技術(shù)：
生物冶金技術(shù)是利用微生物、空氣和水等天然物質(zhì)從礦石中直接提取有價金屬， 而無需選礦及火法煉制的短流程清潔生產(chǎn)工藝，通過微生物氧化礦石產(chǎn)生硫酸高鐵和硫酸 等浸出劑，浸出過程基本不消耗除礦石、水、空氣以外的其它資源，沒有二氧化硫排放，資源 消耗低，對環(huán)境友好。生物冶金新技術(shù)使浮選-火法冶煉工藝不能利用的低品位及偏遠地 區(qū)銅資源得以大規(guī)模開發(fā)，并使過去長年堆存的表外礦即使含銅0. 1 %以下亦有經(jīng)濟利用 價值。生物冶金技術(shù)被認為是二十一世紀礦產(chǎn)資源加工的戰(zhàn)略性技術(shù)。 生物冶金過程是一個化學(xué)過程，微生物的作用主要是氧化鐵和還原態(tài)硫，以及提 供溶解反應(yīng)發(fā)生的空間(胞外聚合層)，但是細菌的作用是不能忽視的。浸礦環(huán)境中的細 菌可以分為兩種一種就是可以氧化鐵或(和)硫的細菌，如At. ferrooxidans，氧化Fe" 的速度是溶解氧氧化速度的5X 105 1 X 106倍，產(chǎn)生的Fe3+通過化學(xué)作用氧化硫化礦，氧 化硫產(chǎn)生的硫酸也可溶解一部分硫化礦；還有一種菌就是異養(yǎng)菌，它們通過代謝自養(yǎng)菌產(chǎn) 生的有機物獲得能量，一方面可以消除有機物對自養(yǎng)菌的毒害作用，另一方面可以在低氧 壓條件下異養(yǎng)生長，以Fe3+為電子受體，可以產(chǎn)生Fe2+供鐵氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。 生物浸礦過程是一個復(fù)雜的過程，其中涉及多種因素(生物、化學(xué)、物理)的相互 作用，微生物群落會隨著浸礦環(huán)境中溫度、pH、溶解氧濃度、C02濃度、Fe37Fe2+、硫酸鹽濃度 和金屬離子濃度等的變化而變化，而微生物群落的變化就會影響到浸礦的效率?，F(xiàn)有的浸 礦微生物檢測的方法多是基于PCR擴增后，再對所擴增的PCR產(chǎn)物進行檢測，這種終點法的 檢測往往不能真實的反應(yīng)浸礦環(huán)境中的微生物組成。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的real-time PCR技術(shù)，實現(xiàn)了環(huán)境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳檢測的時間，使得檢測的時間 大大縮短，同時提高了檢測的準確性，并能夠檢測低至幾個拷貝的分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一對擴增鐵原體屬(Ferroplasma) 16S rRNA基因的引物以及實時PCR 定量檢測鐵原體屬的方法，該方法實現(xiàn)了環(huán)境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳檢測 的時間，使得檢測的時間大大縮短，同時提高了檢測的準確性，并能夠檢測低至幾個拷貝的 分子。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案 本發(fā)明的real-time PCR包括用于特異性擴增環(huán)境中鐵原體屬(Ferroplasma)的 弓I物對以及檢測這些微生物的方法。
本發(fā)明提供的用于檢測鐵原體屬(Ferroplasma)的引物對包括正向引物(F) (5， -AGCCATGCGAGTCAAGGTAT-3')和反向引物(R) (5， -CCCGTCTTACCCAGCACTTA-3')(引物 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。 這種利用權(quán)利要求1所述引物對的實時PCR的快速定量鐵原體屬的方法，其特征 在于它包括以下步驟 (1)、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR 擴增，切膠純化，以純化后的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產(chǎn)物的吸光 度值，并將吸光度值轉(zhuǎn)化成DNA濃度，再將DNA產(chǎn)物的質(zhì)量轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)；純化的PCR產(chǎn)物 定量后，進行梯度稀釋，并以PCR產(chǎn)物為模板，數(shù)據(jù)構(gòu)建標準曲線。 (2)、在實時定量PCR儀中擴增環(huán)境中鐵原體屬屬的16S rDNA基因，通過儀器檢測 擴增過程中相應(yīng)的熒光信號，然后利用(1)中已建好的標準曲線將熒光信號轉(zhuǎn)換到起始反 應(yīng)的核酸分子拷貝數(shù)。 由于細菌在進化過程中基因存在一定的突變，因此在引物設(shè)計時在Genbank中選 取某種細菌及相似細菌的16S rDNA序列進行比對，挑取該種細菌不同于別的細菌的序列作 為設(shè)計引物的基礎(chǔ)(用Promega 3)。 本發(fā)明提供的用于檢測鐵原體屬(Ferroplasma)的方法為以上面提供的引物對 在實時定量PCR儀中擴增環(huán)境中鐵原體屬(Ferroplasma)的16S rDNA基因。通過儀器檢 測擴增過程中相應(yīng)的熒光信號，然后利用已建好的標準曲線將熒光信號轉(zhuǎn)換到起始反應(yīng)的 核酸分子拷貝數(shù)，從而達到定量檢測環(huán)境樣品中鐵原體屬(Ferroplasma)的數(shù)量。


圖1為鐵原體屬(Ferroplasma)的標準曲線
圖2為3種樣品的熒光變化曲線圖
具體實施方式

實施例1 挑取本實驗室保存的與Ferroplasma sp.(該標準菌株Ferroplasma sp.可從 中國典型培氧物保藏中心購買(武漢))具有99%相似性的陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，采用A卯lied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因擴增儀。50 ii 1的反應(yīng)體系組成為:5 Xbuffer 10 ii l，25mM Mg2+3 ii 1， 10mM dNTP lyl，正向引物(F)O. 5iU，反向引物(R) 0. 5 yl，模板1 yl， GoTaq DNA聚合酶 0. 25iU，無菌去離子水33. 75iU，每個樣品做3個重復(fù)。反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2min，然 后為30個循環(huán)的95。C變性45s，54。C退火45s，72。C延伸lmin，最后72。C延伸10min。反應(yīng) 結(jié)束后將所得PCR產(chǎn)物按照Promega的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System操作說 明進行切膠純化。純化后的PCR產(chǎn)物采用0ptizen 2120紫外分光光度計(Mecasys Co.， Ltd.)在260nm測定產(chǎn)物的吸光度值。然后根據(jù)公式(濃度=0D260 X 50 y g/ml X稀釋倍 數(shù))將吸光度值轉(zhuǎn)化成DNA濃度。再根據(jù)下面的公式將DNA產(chǎn)物的質(zhì)量轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)
質(zhì)量(g)疆口德羅常數(shù)；幽考貝數(shù)
單個鵬的平均摩爾質(zhì)量x模板長度
對于雙鏈DNA，采用660g/摩爾/堿基。10—9g的400bp的PCR產(chǎn)物相當(dāng)于2. 51X109
個拷貝。 純化的PCR產(chǎn)物定量后，進行梯度稀釋，使得PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)為1C)7-101。以此 PCR產(chǎn)物為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀進行擴增。 25iU的反應(yīng)體系組成為12. 5iU的含有SYBRGreen I染色劑、AmpliTaq Gold DNA聚 合酶、dNTPs和緩沖溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物 (F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，無菌去離子水6. 5 yl，每個樣品做3個重 復(fù)。反應(yīng)條件為95t:預(yù)變性5min，然后為45個循環(huán)的95。C變性15s，6(TC延伸lmin。反 應(yīng)結(jié)束后，將溫度由65t:緩慢升至95t:進行溶解曲線分析，檢測反應(yīng)的特異性。
反應(yīng)結(jié)束后，將溫度緩慢升高，此時雙鏈DNA解鏈成為單鏈，內(nèi)參的熒光染料會被 釋放出來，熒光信號逐漸減弱?；诋a(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度 點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微 分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應(yīng)中擴增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線就可以對反 應(yīng)的特異性進行監(jiān)督了。如果溶解曲線只有一個峰，說明反應(yīng)的特異性很好，如果出現(xiàn)多個 峰，說明有非特異性產(chǎn)物生成，結(jié)果就不可信。 反應(yīng)結(jié)束后，利用軟件(軟件為Rotor-Gene 6000 series software versionl. 7(Build 3))將反應(yīng)中的數(shù)據(jù)構(gòu)建標準曲線(如圖1) 。 R表示所構(gòu)建標準曲線的 相關(guān)系數(shù)，R'2表示標準曲線相關(guān)系數(shù)的平方，M表示標準曲線的斜率，B表示標準曲線的截 距，Efficiency表示反應(yīng)的擴增效率。通常好的標準曲線R > 0. 99， R'2 > 0. 97。
實施例2 分別提取3種環(huán)境樣品(搖瓶浸出、柱浸和生物堆浸)中的微生物基因組DNA，用 Promega的基因組DNA純化試劑盒(Promega， USA)，按照操作說明將DNA粗提液純化。以 純化后的基因組DNA作為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR 儀，采用特異性擴增鐵原體屬(Ferroplasma)、引物對進行擴增。25iU的反應(yīng)體系組成 為12. 5 ill的含有SYBR Green I染色劑、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTPs和緩沖溶液 的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物 (R)6. 25pmol，模板liil，無菌去離子水6.5ia，每個樣品做3個重復(fù)。反應(yīng)條件為95"預(yù) 變性5min，然后為45個循環(huán)的95。C變性15s，6(TC延伸lmin。反應(yīng)結(jié)束后，將溫度由65°C 緩慢升值95t:進行溶解曲線分析，檢測反應(yīng)的特異性。然后導(dǎo)入已建立的標準曲線利用熒 光定量PCR儀自帶的軟件計算Ct值，之后將Ct值轉(zhuǎn)化為核酸分子的拷貝數(shù)。然后根據(jù)轉(zhuǎn) 化系數(shù)(Ferroplasma sp.為6)將拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為細胞數(shù)。(由于細菌通常存在多個拷貝的 16S rRNA基因，因此需要一個轉(zhuǎn)化系數(shù)將拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為細菌數(shù)，這個轉(zhuǎn)化系數(shù)在Zammit， C. M. ， Mutch， L A. ， Watling， H. R. andWatkin， E. L J. ， 2008. Evaluation of quantitative real—time polymerase chain reaction for enumeration ofbiomining microorganisms in culture Hydrometallurgy 94(1-4) :185-189.中可以查閱。) 經(jīng)計算鐵原體屬(Ferroplasma)在3種樣品中的數(shù)量分別為11. 04/mL、29. 5/mL、 1. 7X104/g。
申請人:采用本方法檢測過多種其他菌種(包括大腸桿菌、假單胞菌，以及四種待 檢測細菌互相進行引物驗證)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)特異性很好，非待測菌株曲線不起飛，沒有信號。 本發(fā)明的檢測限為10個拷貝，檢測在10-10'7(10-107)個拷貝間。 序列表 〈110〉北京有色金屬研究總院 〈120〉一對擴增鐵原體屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測鐵原體屬的 方法 〈130> 〈160>2 〈170〉Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA <213>人工合成 〈400〉 1 agccatgcga gtcaaggtat 20 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA <213>人工合成 〈400〉2 cccgtcttac ccagcactta 20
權(quán)利要求
一對擴增鐵原體屬16S rRNA基因的引物，其特征在于所述的引物對包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-AGCCATGCGAGTCAAGGTAT-3’，反向引物的序列是5’-CCCGTCTTACCCAGCACTTA-3’.
2. —種利用權(quán)利要求1所述引物對的實時PCR的快速定量鐵原體屬的方法，其特征在于它包括以下步驟(1) 、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，切膠純化，以純化后的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產(chǎn)物的吸光度值，并將吸光度值轉(zhuǎn)化成DNA濃度，再將DNA產(chǎn)物的質(zhì)量轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)；純化的PCR產(chǎn)物定量后，進行梯度稀釋，并以PCR產(chǎn)物為模板，數(shù)據(jù)構(gòu)建標準曲線。(2) 、在實時定量PCR儀中擴增環(huán)境中鐵原體屬屬的16S rDNA基因，通過儀器檢測擴增過程中相應(yīng)的熒光信號，然后利用(1)中已建好的標準曲線將熒光信號轉(zhuǎn)換到起始反應(yīng)的核酸分子拷貝數(shù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所用的反應(yīng)體系組成為12. 5iU的含有SYBRGreen I染色劑、AmpliTaqGold⑧DNA聚合酶、dNTPs和緩沖溶液的SYBR Green PCR MasterMix，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，無菌去離子水6. 5 yl，每個樣品做3個重復(fù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所用的反應(yīng)條件為95t:預(yù)變性5min，然后為45個循環(huán)的95。C變性15s，60。C延伸lmin。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于不僅包括浸礦環(huán)境如生物浸出液或酸性礦坑水。
全文摘要
本發(fā)明提供一對擴增鐵原體屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量鐵原體屬(Ferroplasma)的方法。所述的引物對包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5′-AGCCATGCGAGTCAAGGTAT-3′，反向引物的序列是5′-CCCGTCTTACCCAGCACTTA-3′。與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有時間短、通量大、工作量小、可靠性高的優(yōu)點，從樣品的處理到定量檢測環(huán)境中鐵原體屬(Ferroplasma)的時間縮短至4小時，而且由于是一種起始檢測法，檢測結(jié)果更加準確。
文檔編號C12N15/11GK101724694SQ20091020458
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者劉興宇, 溫建康, 陳勃偉, 黃松濤 申請人:北京有色金屬研究總院