專利名稱：在易感哺乳動物中引起呼吸道疾病的病毒的制作方法
在易感哺乳動物中引起呼吸道疾病的病毒本申請為分案申請，原申請的申請日為2002年1月18日，申請?zhí)枮?02806763. 0(PCT/NL02/00040)，發(fā)明名稱為“在易感哺乳動物中引起呼吸道疾病的病毒”。本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。在過去數(shù)十年中，已經(jīng)鑒定了幾種哺乳動物疾病的病原，尤其是呼吸道疾病(RTI) 的病原，特別是人類疾病的病原7。哺乳動物RTI的經(jīng)典病原是在人類(hRSV)和反芻動 物如牛或綿羊(bRSV和/或oRSV)中發(fā)現(xiàn)的屬于肺病毒屬(Pneumovirus)的呼吸道合胞 病毒。在人RSV中，利用正反交中和測定中的差異、免疫測定中G蛋白的反應(yīng)性和G基因 的核苷酸序列，確定了兩個hRSV抗原性亞組。在所述亞組內(nèi)，氨基酸序列顯示出94% (A 亞組)或98% (B亞組)同一性，而在亞組之間僅發(fā)現(xiàn)53%的氨基酸序列同一性?；?單克隆抗體、RT-PCR測定和RNA酶保護測定，在亞組內(nèi)觀察到額外的變異性。來自兩個亞 組的病毒都有世界范圍的分布，可以在一個季節(jié)中發(fā)生。在現(xiàn)有免疫存在下可能發(fā)生感 染，并且對于再感染，并不嚴格需要抗原性變異。參見例如Sullender，W. Μ.，Respiratory Syncytial Virus Genetic andAntigenie Diversity. Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1) :p. 1-15 ；Collins, P. L. ，Milntosh, K.禾口 Chanock， R. Μ. ， Respiratory syncytial virus. Fields virology, B. N. Knipe, Howley, P. M.編著，1996, Philadelphia : 1 ippencott-raven. 1313-1351 ；Johnson, P. R.等，The G glycoprotein ofhuman respiratory syncytial viruses of subgroups A and B :extensivesequence divergence between antigenically related proteins. Proc NatlAcad Sci U S A,1987,84(16) p. 5625-9 ；Collins, P. L. , The moIecularBiοlogy of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) of the GenusPneumovirus,載于 The Paramyxoviruses, D. W. Kingsbury 編著， 1991，Plenum Press :New York,p.103-153。另一經(jīng)典的肺病毒是小鼠肺炎病毒(PVM)，一般僅在實驗室小鼠中發(fā)現(xiàn)。然而，在 哺乳動物中觀察到的一定比率的疾病仍不能歸因于已知的病原體。本發(fā)明提供一種分離的屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒亞科 (Pneumovirinae)、可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus的基本上為哺乳動物 的負義(negative-sense)單鏈RNA病毒(MPV)。通過測定所述病毒的核酸序列并且在系 統(tǒng)發(fā)育分析中對其進行測試，例如其中采用100個引導(dǎo)程序和3個jumble生成最大似然進 化樹，并且發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上與對應(yīng)于也稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)(禽鼻氣管炎的病 原)的禽肺病毒(APV)的基本禽病毒分離株相比，它更密切地對應(yīng)于以1-2614保藏于巴黎 CNCM的病毒分離株，所述病毒可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus。對于所述 系統(tǒng)發(fā)育分析，最有用的是獲得非MPV的核酸序列作為外類群(outgroup)，以便進行比較， 一種非常有用的外類群分離株可以得自禽肺病毒血清型C (APV-C)，這例如在此中的圖5中 得到證實。雖然系統(tǒng)發(fā)育分析提供了一種鑒定病毒為MPV的便捷方法，但是此中也提供幾種 其它可能更為直接但過程略多的、用于鑒定所述病毒或得自所述病毒病毒蛋白或核酸的方 法。根據(jù)經(jīng)驗，在用序列或保藏物與此中鑒定的分離株、病毒蛋白或核酸的比較中待鑒定病毒蛋白質(zhì)或核酸的百分同源性，可以鑒定MPV。眾所周知，病毒種、尤其是RNA病毒種通常構(gòu) 成一個準種，其中所述病毒分類群(cluster)在其成員之間顯示出異質(zhì)性。因此，預(yù)期每個 分離株與此中提供的各種分離株之一的關(guān)系百分率可能略有差異。當(dāng)人們希望與保藏的病毒1-2614進行比較時，本發(fā)明提供一種分離的屬于副粘 病毒科肺病毒亞科的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒(MPV)，通過測定所述病毒的 氨基酸序列，并且確定在L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白方面，所述氨基酸序列與 以1-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分離株的氨基酸同源性的百分率基本上高于此中提供的 與APV-C相比的百分率，所述病毒可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus ；或者， 同樣，提供一種分離的屬于副粘病毒科肺病毒亞科的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病 毒(MPV)，所述病毒通過以下步驟可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus 測定所 述病毒的核酸序列，并且確定在編碼L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的核酸方面，所 述核酸序列與以1-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分離株的核酸同一性的百分率基本上高于 此中鑒定的與APV-C相比的百分率。再根據(jù)經(jīng)驗，當(dāng)需要鑒定的分離株或者所述分離株的病毒蛋白或核酸的同源性百 分率落入本文鑒定的兩個組(以分離株00-1或99-1作為相應(yīng)的比較分離株)各自的所述 同源性百分率范圍內(nèi)，人們可以認為所述MPV屬于本文鑒定的MPV兩個血清學(xué)組之一。然 而，當(dāng)所述同源性百分率較小，或者更需要區(qū)別所述病毒分離株與例如APV-C時，則建議優(yōu) 選采用本文鑒定的系統(tǒng)發(fā)育分析。再者，當(dāng)在測定同源性百分率時選擇其它分離株時，人們應(yīng)該記住，所述百分率可 能略有變化。由于提供了這種MPV，本發(fā)明提供用于診斷和/或治療疾病、特別是呼吸道疾病、 特別是哺乳動物疾病、更特別是人類疾病的診斷工具和方法以及治療工具和方法。然而， 由于基本上為哺乳動物的MPV與基本上為禽類的APV、特別是與APV-C的關(guān)系雖然遠，但有 基因關(guān)聯(lián)，本發(fā)明也提供用于診斷和治療禽類疾病的工具和方法。在病毒學(xué)中，最好的忠 告是用對引起所述感染的所述特定病毒最具特異性的試劑，進行特定病毒感染的診斷和 /或治療。在這種情況下，這意味著，優(yōu)選用對MPV最具特異性的試劑，進行所述MPV感染 的診斷和/或治療。然而，這決不排除使用特異性較低卻有足夠交叉反應(yīng)性的試劑來替代 的可能性，例如因為它們更容易獲得，并且足以完成眼前的任務(wù)。在此，例如提供用來源于 APV的試劑、特別是來源于APV-C的試劑來進行哺乳動物MPV感染的病毒學(xué)和/或血清學(xué) 診斷，在本文的詳細描述中，例如表明，通過運用專門設(shè)計用于檢測鳥類APV抗體的ELISA， 可以達到足夠值得信賴的哺乳動物MPV感染的血清學(xué)診斷。用于此目的的一個特別有用 的試驗是設(shè)計用于檢測APV抗體(例如血清或卵黃中)的ELISA，這是一種市售形式，名為 APV-Ab SVANOVIR ，由 SVANOVA Biotech AB (Uppsal Science Park GluntenSE-751 83 Uppsala Sweden)生產(chǎn)。相反的情形也是如此，在此例如提供用來源于MPV的試劑來進行哺 乳動物APV感染的病毒學(xué)和/或血清學(xué)診斷，在本文的詳細描述中，例如表明，通過運用設(shè) 計用于檢測MPV抗體的ELISA，可以達到足夠值得信賴的鳥類APV感染的血清學(xué)診斷。考慮 到抗原和抗體有鎖和鑰匙的關(guān)系，通過選擇具有足夠交叉反應(yīng)性的合適抗體，可以達到對 各種抗原的檢測。當(dāng)然，由于依賴于這種交叉反應(yīng)性，所以最好在各種病毒的各種(糖)蛋 白之間存在氨基酸同源性的指導(dǎo)下，選擇所述試劑(諸如抗原或抗體)，從而與最為同源的蛋白相關(guān)的試劑對于在依賴于這種交叉反應(yīng)性的試驗中使用將是最有用的。對于核酸檢測，甚至更為簡單的，不用根據(jù)各種病毒的異源核酸序列設(shè)計引物或 探針、并且因此不需要檢測所述基本上為哺乳動物或禽類的Metapneumoviruses之間的差 異，只要根據(jù)病毒特異性核酸序列中顯示出高同源性的那些序列段設(shè)計或選擇引物或探針 即可。一般而言，對于核酸序列，90%或90%以上的同源性百分率可保證在運用嚴謹雜交條 件的診斷性試驗中所依靠的足夠的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明例如提供一種病毒學(xué)診斷動物、特別是哺乳動物、更尤其是人類MPV感染 的方法，所述方法包括通過使所述動物的樣品與本發(fā)明的MPV特異性核酸或抗體反應(yīng)，測 定所述樣品中病毒分離株或其組分的存在情況；本發(fā)明還提供一種血清學(xué)診斷哺乳動物 MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述哺乳動物的樣品與本發(fā)明的MPV特異性蛋白性 分子或其片段或抗原反應(yīng)，測定所述樣品中特異性針對MPV或其組分的抗體的存在情況。 本發(fā)明還提供一種用于診斷MPV感染的診斷試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的MPV、MPV特 異性核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗體，優(yōu)選包含用于檢測所述MPV、MPV特異性 核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗體的工具，所述工具例如包含本領(lǐng)域使用可激發(fā) 的基團，例如熒光團或酶檢測系統(tǒng)(合適的診斷試劑盒形式的實例包括IF、ELISA、中和測 定、RT-PCR測定)。為了確定一種尚未鑒定的病毒組分或其合成類似物例如核酸、蛋白性 分子或其片段是否可以鑒定為MPV特異性的，只要運用例如本文提供的系統(tǒng)發(fā)育分析，通 過與已知MPV序列和與已知的非MPV序列APV-C的序列同源性比較，分析(分別)所述組 分的核酸序列或氨基酸序列，例如分析所述核酸或氨基酸的優(yōu)選至少10個、更優(yōu)選至少25 個、更優(yōu)選至少40個核苷酸或氨基酸的序列段即可。根據(jù)與所述MPV或非MPV序列的關(guān)系 程度，可以鑒定所述組分或合成類似物。本發(fā)明也提供病毒學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述哺 乳動物的樣品與來源于APV (優(yōu)選血清型C)的交叉反應(yīng)性核酸或與所述APV反應(yīng)的交叉反 應(yīng)性抗體反應(yīng)，測定所述樣品中病毒分離株或其組分的存在情況；本發(fā)明還提供一種血清 學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述哺乳動物的樣品與來源于APV 的蛋白性分子或其片段或抗原反應(yīng)，測定所述樣品中也針對APV或其組分的交叉反應(yīng)性抗 體的存在情況。此外，本發(fā)明提供最初設(shè)計用于APV或APV抗體檢測的診斷試劑盒在診斷 MPV感染、特別是在檢測人類中所述MPV感染方面的應(yīng)用。本發(fā)明也提供病毒學(xué)診斷鳥類APV感染的方法，所述方法包括通過使所述鳥類的 樣品與來源于MPV的交叉反應(yīng)性核酸或與所述MPV反應(yīng)的交叉反應(yīng)性抗體反應(yīng)，測定所述 樣品中病毒分離株或其組分的存在情況；本發(fā)明還提供一種血清學(xué)診斷鳥類APV感染的 方法，所述方法包括通過使所述鳥類的樣品與來源于MPV的蛋白性分子或其片段或抗原反 應(yīng)，測定所述樣品中也針對MPV或其組分的交叉反應(yīng)性抗體的存在情況。此外，本發(fā)明提供 最初設(shè)計用于MPV或MPV抗體檢測的診斷試劑盒在診斷APV感染、特別是在檢測家禽例如 雞、鴨或火雞中所述APV感染方面的應(yīng)用。正如人們所述，對于治療，可以類似地應(yīng)用所發(fā)現(xiàn)的交叉反應(yīng)性，特別是在現(xiàn)有的 情況下，利用不太直接的更高同源性的途徑。例如，當(dāng)不能得到更為同源的MPV疫苗時，可 以用來源于APV (優(yōu)選C型)分離株的疫苗制劑，進行不能等待的疫苗接種，例如針對MPV 感染的緊急疫苗接種；反之，可以考慮用來源于MPV的疫苗制劑，進行針對APV感染的疫苗
7接種。此外，反向基因技術(shù)使得有可能產(chǎn)生可用作疫苗、與待減毒至所需水平的每種相應(yīng)毒 株的現(xiàn)場分離株足夠不同的嵌合APV-MPV病毒構(gòu)建體。相似的反向基因技術(shù)將使得也有可 能產(chǎn)生供疫苗制劑用的嵌合副粘病毒-metapneumovirus構(gòu)建體，例如RSV-MPV或PI3-MPV 構(gòu)建體。這類構(gòu)建體尤其可用作抵抗呼吸道疾病的聯(lián)合疫苗。因此，本發(fā)明提供一種新型的病原_ 一種分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈 RNA病毒(在此也稱為MPV)及其MPV特異性組分或合成類似物，所述病毒屬于副粘病毒科 的肺病毒亞科，但不能鑒定為典型的肺病毒，而是屬于Metapneumovirus。迄今尚未發(fā)現(xiàn)類 似metapneumovirus的哺乳動物病毒，即可從哺乳動物中分離的、基本上以哺乳動物作為 所述病毒的天然寄主或者在所述哺乳動物中致病的metapneumovirus。被普遍認為基本上 限于以家禽作為天然寄主或者是家禽疾病的病原的metapneumovirus，也被稱為禽肺病毒。 最近，描述了鴨的APV分離株(FR 2801607)，進一步證明APV感染基本上限于作為天然寄主 的鳥類。本發(fā)明提供分離的哺乳動物肺病毒(在此也稱為MPV)，所述MPV包含與肺病毒屬 不同的基因順序和氨基酸序列，并且是密切相關(guān)的，認為其系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性可能屬于副粘 病毒科肺病毒亞科中的Metapneumovirus。雖然至今尚未從鳥類分離出metapneumovirus, 但現(xiàn)在表明，可以在其它動物種例如哺乳動物中，鑒定出雖然顯著不同、但卻相關(guān)的病毒。 在此，我們表明，從人類重復(fù)地分離出MPV，而沒有關(guān)于APV的這類報告。此外，與APV不同， MPV在雞和火雞中基本上不復(fù)制，或者僅很少復(fù)制，而在恒河猴中容易復(fù)制。沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于 APV在哺乳動物中復(fù)制的報道。另外，雖然針對MPV產(chǎn)生的特異性抗血清中和MPV，但針對 APV A、B或C產(chǎn)生的抗血清并不以相同的程度中和MPV，這種全交叉反應(yīng)性(full cross reactivity)的缺乏提供了另一個關(guān)于MPV是一種不同的metapneumovirus的證明。此外， 雖然APV和MPV有相似的基因順序，但MPV的G蛋白和SH蛋白與已知的APV的所述蛋白有 明顯的差異，因為它們在氨基酸水平或核酸水平上都沒有顯示出顯著的序列同源性。根據(jù) 這些蛋白中的一種或兩種，可以有利地開發(fā)用于鑒別APV分離株和MPV分離株或針對這些 不同病毒的抗體的診斷性測定(例如IF、ELISA、中和測定、RT-PCR測定)。然而，此外，得 自MPV的更相關(guān)的N、P、M、F和L蛋白的序列信息和/或抗原性信息和與APV的相應(yīng)蛋白 的序列同源性分析，也可以用來鑒別APV和MPV。例如，得自MPV的序列信息的系統(tǒng)發(fā)育分 析表明，MPV和APV是兩類不同的病毒。特別是，系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，APV和MPV是兩個 不同的病毒譜系。我們也表明，MPV在人群中循環(huán)了至少50年，因此種間傳播可能至少在 50年前發(fā)生，而不是每天的事件。由于MPV CPE實際上不能與由hRSV或hPIV-Ι在tMK或 其它細胞培養(yǎng)物中引起的CPE區(qū)別，所以可能至今所述MPV仍被忽視。tMK(第三代猴腎細 胞，即細胞培養(yǎng)物中第三次傳代的MK細胞)由于其與原代或第二代培養(yǎng)物相比成本較低而 優(yōu)選使用。所述CPE以及由典型副粘病毒科的某些病毒引起的CPE的特征為合胞體形成， 此后細胞表現(xiàn)出快速內(nèi)部破壞，然后所述細胞與所述單層分離。所述細胞通常(但不總是) 在病毒從原始物質(zhì)傳代三次后，在接種后第10-14天時表現(xiàn)出CPE，比由其它病毒例如hRSV 或hPIV-Ι引起的CPE略晚。通常，作為疾病的破壞性因子，副粘病毒每年在全世界引起許多動物和人死亡。副 粘病毒科構(gòu)成單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)(負義單鏈RNA病毒)的一個 科，由副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)和肺病毒亞科(Pneumovirinae)組成。后一亞科目前在分類學(xué)上分為肺病毒屬(Pneumovirus)和Metapneumovirus1。人呼吸道合胞病毒 (hRSV)-肺病毒屬的典型種，是全世界嬰兒和幼兒下呼吸道感染的最重要的單一病因2。肺 病毒屬的其它成員包括牛和羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒(PVM)。禽肺病毒(APV)也稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，是火雞上呼吸道感染禽類鼻氣 管炎的病原3，APV是最近指定的Metapneumovirus的唯一成員，正如已描述的，至今APV尚 未與感染相關(guān)、或者更具體地講與哺乳動物疾病相關(guān)。APV血清學(xué)亞組可以根據(jù)G糖蛋白 的核苷酸序列或氨基酸序列以及運用也識別G糖蛋白的單克隆抗體的中和試驗來鑒別。在 A、B和D亞組內(nèi)，G蛋白在亞組內(nèi)顯示出98. 5-99. 7%的氨基酸序列同一性，而在亞組間僅 觀察到 31. 2-38% 的氨基酸同一性。參見例如 Collins，M.S.，Gough, R. Ε.和 Alexander， D. J.，Antigenicdifferentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera andmouse monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22 :p.469-479 ； Cook, J. K. A. , Jones, B. V. , Ellis, Μ. Μ. , Antigenic differentiation of strainsof turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies.AvianPathology, 1993. 22 :p. 257-273 ；Bayon-Auboyer, Μ. H.等，Nucleotidesequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avianpneumoviruses(APV)reveal a novel APV subgroup. J Gen Virol,2000. 81(Pt 11) :p.2723-33 ；Seal, B. S. , Matrix Protein gene nucleotide andpredicted amino acid sequence demonstrate that the first US avianpneumovirus isolate is distinct from European strains. Virus Res, 1998.58(1-2) :p. 45-52 ；Bayon-Auboyer, M. H.等，Comparison of F-, G-and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for thedetection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch Virol,1999,144(6) :p.1091-109; Juhasz,K.禾口A.J. Easton,Extensive sequencevariation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus :evidence of two distinct subgroups. J Gen Virol, 1994.75(Ptll) :p.2873-80。在W000/20600 中提供了另一種 APV 血清型，W000/20600 描述了 APV Colorado 分 離株，并且用體外血清中和試驗將其與已知的APV或TRT毒株進行了比較。首先，針對識 別TRT分離株的單特異性多克隆抗血清，測試了所述Colorado分離株。所述Colorado分 離株不被針對任何所述TRT毒株的單特異性抗血清中和。然而，它被針對A亞組毒株產(chǎn)生 的超免疫抗血清所中和。這種抗血清在1 400的滴度下中和所述同源病毒，而在1 80 的滴度下中和所述Colorado分離株。然后運用上述方法，針對TRT單克隆抗體測試了所述 Colorado分離株。在所有情況下，交互中和效價都小于10。針對所述Colorado分離株產(chǎn) 生的單特異性抗血清也針對兩個亞組的TRT毒株進行了測試。所測試的TRT毒株中沒有一 個被抗所述Colorado分離株的抗血清中和。APV Colorado毒株不保護SPF雞抵抗TRT病毒的A亞組或B亞組毒株的攻 擊。這些結(jié)果提示，所述Colorado分離株可能是禽肺病毒的另一種血清型的首個例子， Bayon-Auboyer 等也提示了這一點(J. Gen. Vir. 81 :2723_2733 (2000))。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種在分類學(xué)上對應(yīng)于(迄今未知的哺乳 動物)metapneumovirus的分離的MPV，所述MPV包含與副粘病毒科肺病毒亞科中的肺 病毒不同的基因順序。這兩個屬的分類主要基于其基因構(gòu)象(gene constellation)；metapneumovirus 一般缺乏非結(jié)構(gòu)蛋白諸如NSl或NS2(也參見Randhawa等，J. Vir. 71 9849-9854(1997)，并且基因順序不同于肺病毒的基因順序(RSV ，3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G -F-M2-L-5，，APV ，3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5，)4’5’6。本發(fā)明提供的 MPV 或者在分類學(xué)上 與其對應(yīng)的病毒分離株基于EM分析，揭示為副粘病毒樣顆粒。與分類一致，MPV或在系統(tǒng) 發(fā)育上或分類學(xué)上與其對應(yīng)的病毒分離株對氯仿處理敏感；最適于在tMK細胞或與其功能 等同的細胞上培養(yǎng)，并且在大多數(shù)細胞培養(yǎng)物中基本上是酪氨酸依賴性的。此外，典型的 CPE以及對于最經(jīng)典使用的紅細胞缺乏血細胞凝集活性，提示本文提供的病毒雖然僅與經(jīng) 典肺病毒如RSV是遠緣，但卻是相關(guān)的。雖然大多數(shù)副粘病毒具有血細胞凝集活性，但大 多數(shù)肺病毒沒有所述活性13。依照本發(fā)明的MPV在編碼M2蛋白的核酸片段中也含有第二 個重疊ORF (M2-2)，與一般大多數(shù)其它肺病毒一樣，諸如也在Ahmadian等，J. Gen. Vir. 80 2011-2016(1999)中所證明的。為了發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的其它病毒分離株，只要測試任選得自患病動物或人的樣品 中肺病毒亞科病毒的存在情況，并且測試如此得到的病毒中編碼(功能性)NSl或NS2的基 因的存在情況，或者如上所述基本上證明不同于肺病毒如RSV的基因順序即可。此外，通 過用得自本文提供的MPV分離株的核酸的交叉雜交實驗，或者在運用特異性針對MPV分離 株的單克隆抗體和/或具體來源于MPV分離株的抗原和/或免疫原的經(jīng)典交叉血清學(xué)實驗 中，可以發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上并且因此在分類上與MPV相對應(yīng)的病毒分離株。當(dāng)新分離的病毒包含與我們的原型MPV分離株足夠相似的基因順序和/或氨基酸 序列，或者在結(jié)構(gòu)上與其對應(yīng)，并且顯示出與肺病毒亞科的Metapneumovirus密切相關(guān)時， 所述病毒在系統(tǒng)發(fā)育上并且因此在分類學(xué)上對應(yīng)于MPV。MPV和同一科的任何迄今已知的 其它病毒(APV C亞型)之間有最高氨基酸序列同源性，并且在各個蛋白質(zhì)水平上確定結(jié) 構(gòu)相關(guān)性，對于基質(zhì)蛋白為87%，對于核蛋白為88%，對于磷蛋白為68%，對于融合蛋白為 81%，而對于聚合酶蛋白的部分為56-64%，這可以在將圖6中給出的序列與其它病毒、特 別是APV-C的序列比較時得出。分別相對于這些上述最大值有較高同源性的各個蛋白質(zhì)或 完整的病毒分離株，被認為在系統(tǒng)發(fā)育上并且因此在分類學(xué)上對應(yīng)于MPV，并且包含在結(jié)構(gòu) 上與圖6所示序列對應(yīng)的核酸序列。在此，本發(fā)明提供一種在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于所保藏的 病毒的病毒。應(yīng)該注意到，與其它病毒相似，在本文提供的不同分離的基本上為哺乳動物的 負義單鏈RNA病毒分離株之間，發(fā)現(xiàn)一定程度的變異。在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，根據(jù)L、M、N和 F基因的部分的比較性序列分析，我們鑒定出病毒分離株的至少2個遺傳分類群(genetic cluster)?；谒霾《竞怂嵝蛄谢虬被嵝蛄?病毒序列)的核苷酸和氨基酸差異，以 及與其它肺病毒如RSV相似，這些MPV基因型代表MPV亞型。在MPV分離株的每個遺傳 分類群內(nèi)，發(fā)現(xiàn)核苷酸水平的同一性百分率對于L為94-100，對于M為91-100，對于N為 90-100，而對于F為93-100，并且在氨基酸水平上，發(fā)現(xiàn)同一性百分率對于L為91-100，對 于M為98-100，對于N為96-100，而對于F為98-100。在

圖18-28中，可以發(fā)現(xiàn)另一種比 較。對于此中提供的、迄今已鑒定的分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒(MPV分 離株)的整個組而言，核苷酸水平的最低同一性百分率，對于L和M為81，對于N為83，而對 于F為82。在氨基酸水平上，該百分率對于L和N為91，對于M為94，對于F為95。此中提 供的MPV分離株的病毒序列或分離的MPV F基因例如表現(xiàn)出與例如Seal等，Vir. Res. 66 139147(2000)提供的APV-C融合(F)基因的相應(yīng)核苷酸序列或氨基酸序列有低于81 %的核苷酸序列同一性或低于82 %的氨基酸序列同一性。此外，此中提供的MPV分離株的病毒序列或分離的MPV L基因例如表現(xiàn)出與例如 Ranhawa等，J. Gen. Vir. 77 =3047-3051 (1996)提供的APV-A聚合酶基因的相應(yīng)核苷酸序列 或氨基酸序列有低于61%的核苷酸序列同一性或低于63%的氨基酸序列同一性。全世界MPV毒株的序列差異百分比與其它病毒類似，可能略高。因此，通過分析 9種病毒分離株的N、M、F和L ORF中的部分核苷酸序列，鑒定了兩個潛在的遺傳分類群。 在一個分類群內(nèi)觀察到90-100%核苷酸同一性，在分類群間觀察到81-88%的同一性。用 更多病毒分離株獲得的序列信息證實存在兩種基因型。作為A分類群原型的病毒分離株 ned/00/01和作為B分類群原型的病毒分離株ned/99/Ol已經(jīng)用于交叉中和測定，以測試 所述基因型是否與不同的血清型或亞組相關(guān)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們總結(jié)出，表現(xiàn)出與分離株 1-2614的氨基酸同源性百分率對于L高于64、對于M高于87、對于N高于88、對于P高于 68、對于F高于81、對于M2-1高于84或?qū)τ贛2-2高于58的基本上為哺乳動物的病毒分離 株，可以分類為此中提供的分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒。特別是，一般在 核苷酸序列水平與此中提供的一種原型MPV分離株的最低同一性百分率對于L和M為81、 對于N為83和/或?qū)τ贔為82的那些病毒分離株，是此中提供的MPV分離株組的成員。在 氨基酸水平上，這些百分率對于L和N為91、對于M為94、和/或?qū)τ贔為95。當(dāng)給定病 毒分離株的氨基酸序列同源性百分率對于L和N高于90、對于M高于93、或?qū)τ贔高于94 時，所述病毒分離株與圖5所示的MPV分離株組相似。當(dāng)給定病毒分離株的氨基酸序列同 源性百分率對于L高于94、對于N高于95或?qū)τ贛和F高于97時，所述病毒分離株可以被 鑒定為屬于圖5所示的基因型分類群之一。應(yīng)該注意到，借以確定遺傳分類群的這些同源 性百分率與在RSV的相應(yīng)基因的遺傳分類群中發(fā)現(xiàn)的同源性程度相似。簡而言之，本發(fā)明提供分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒(MPV)，所述 MPV屬于副粘病毒科肺病毒亞科，并且通過測定所述病毒基因組中合適片段的核酸序列并 且在系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析中對其進行測試，其中采用100個引導(dǎo)程序和3個jumble生成最 大似然進化樹，并且發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上與對應(yīng)于也稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)(禽鼻氣 管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分離株相比，它更密切地對應(yīng)于以1-2614保藏于巴 黎CNCM的病毒分離株，所述病毒可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus。每種可用于這樣的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析的合適的核酸基因組片段，例如為此中在 詳細描述中公開的、生成此中圖4或圖5中公開的各種系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析的RAP-PCR片 段1-10中的任一種。MPV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)和融合蛋白(F)基因的 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析揭示與主要在在美國鳥類中發(fā)現(xiàn)的禽肺病毒-APV C血清型有最高程 度的序列同源性。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈 RNA病毒PV)，所述MPV屬于副粘病毒科肺病毒亞科，并且通過測定所述病毒基因組中合適 片段的核酸序列并且在系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析中對其進行測試，其中采用100個引導(dǎo)程序 和3個jumble生成最大似然進化樹，并且發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上與對應(yīng)于也稱為火雞鼻氣管 炎病毒(TRTV)(禽鼻氣管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分離株相比，它更密切地對 應(yīng)于以1-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分離株，所述病毒可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于 Metapneumovirus，其中所述合適片段包含編碼所述病毒的病毒蛋白的可讀框。
合適的可讀框(ORF)包括編碼N蛋白的0RF。當(dāng)發(fā)現(xiàn)所分析的N蛋白與分離株 1-2614的N蛋白的總體氨基酸同一性至少為91%、優(yōu)選至少95%時，則所分析的病毒分離 株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。正如所表明的，MPV基因組圖譜中的第一個基因編 碼一種394個氨基酸(aa)的蛋白質(zhì)，并且表現(xiàn)出與其它肺病毒的N蛋白有廣泛的同源性。 所述N ORF的長度與APV-C的N ORF的長度相同(表5)，而小于其它副粘病毒的N ORF的 長度(Barr等，1991)。氨基酸序列的分析揭示，與APV-C的同源性最高(88%)，與其它副 粘病毒僅有7-11 %的同源性(表6)。Barr等(1991)鑒定出在屬于單分子負鏈RNA病毒目的病毒之間有相似性的3個 區(qū)A、B和C(圖8)。雖然在病毒科內(nèi)的相似性最高，但這些區(qū)在病毒科之間是高度保守的。 在所有三個區(qū)中，MPV顯示出與APV-C的氨基酸序列同一性為97%，與APV-B的氨基酸序列 同一性為89%，與APV-A的氨基酸序列同一性為92%，而與RSV和PVM的氨基酸序列同一 性為為66-73%。在aa殘基160和340之間的區(qū)看來在metapneumovirus中是高度保守 的，在肺病毒亞科中其保守程度略低(Miyahara等，1992 ；Li等，1996 ；Barr等，1991)。這與 MPV是一種metapneumovirus是一致的，這一特定區(qū)顯示出與APV C的相似性為99%?？捎糜谙到y(tǒng)發(fā)育分析的另一合適的可讀框(ORF)包括編碼P蛋白的0RF。當(dāng)發(fā)現(xiàn) 所分析的P蛋白與分離株1-2614的P蛋白的總體氨基酸同一性至少為70%、優(yōu)選至少85% 時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。MPV基因組圖譜中的第二 個ORF編碼一種294個aa的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與APV-C的P蛋白有68%的氨基酸序列 同源性，與RSV的P蛋白僅有22-26%的氨基酸序列同源性(表6)。MPV的P基因含有一 個實質(zhì)上的0RF，并且在該方面與得自許多其它副粘病毒的P相似(有關(guān)綜述參見Lamb和 Kolakofsky, 1996 ；Sedlmeier 等，1998)。與 APV A 和 B 以及 PVM 相反，而與 RSV 禾Π APV-C 相 似，MPV P ORF缺乏半胱氨酸殘基。Ling(1995)提出，在所有肺病毒中有高度相似性的一個 區(qū)(aa 185-241)在RNA合成過程或者在維持核衣殼復(fù)合體結(jié)構(gòu)完整性方面起作用。這一 高相似性的區(qū)也存在于MPV中(圖9)，尤其是當(dāng)考慮到保守取代時，顯示出與APV-C的相 似性為100%，與APV-A和B的相似性為93%,% RSV的相似性大約為81 %。MPVP蛋白的 C末端富含谷氨酸殘基，正如關(guān)于APV已描述的(Ling等，1995)?？捎糜谙到y(tǒng)發(fā)育分析的另一合適的可讀框(ORF)包括編碼M蛋白的0RF。當(dāng)發(fā) 現(xiàn)所分析的M蛋白與分離株1-2614的M蛋白的總體氨基酸同一性至少為94%、優(yōu)選至少 97%時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。MPV基因組中的第 三個ORF編碼一種254個aa的蛋白質(zhì)，所述ORF類似其它肺病毒的M ORF。MPVM ORF的大 小與其它metapneumovirus的M ORF的大小完全相同(表5)，并且顯示出與APV基質(zhì)蛋白 的氨基酸序列同源性高(76-87 % )，與RSV和PVM的氨基酸序列同源性較低(37-38 % )，而 與其它副粘病毒的同源性為10%或更低(表6)。EaSton(1997)比較了所有肺病毒的基質(zhì) 蛋白的序列，發(fā)現(xiàn)殘基14-19有一個保守的六肽，所述六肽在MPV中也是保守的(圖10)。 對于RSV、PVM和APV而言，已經(jīng)鑒定出M主要ORF內(nèi)或者與M主要ORF重疊的小的第二個 ORF (bRSV中的52個aa和51個aa, RSV中的75個aa, PVM中的46個aa和APV中的5Iaa) (Yu 等，1992 ;Easton 等，1997 ;Samal 等，1991 ;Satake 等，1984)。我們注意到 MPV M ORF 中有兩個小0RF。在M主要ORF內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個始于核苷酸2281的54個aa殘基的小0RF，發(fā) 現(xiàn)一個始于核苷酸2893的與M主要ORF重疊的33個aa殘基的小ORF (數(shù)據(jù)未顯示)。與RSV和APV的第二 ORF相似，在這些第二 ORF和其它肺病毒的第二 ORF之間沒有顯著的同源 性，并且缺乏表觀的起始信號或終止信號。另外，有關(guān)對應(yīng)于APV和RSV的這些第二 ORF的 蛋白質(zhì)的合成的證據(jù)尚未有報道。可用于系統(tǒng)發(fā)育分析的另一合適的可讀框(ORF)包括編碼F蛋白的0RF。當(dāng)發(fā) 現(xiàn)所分析的F蛋白與分離株1-2614的F蛋白的總體氨基酸同一性至少為95%、優(yōu)選至少 97%時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。MPV的F ORF鄰近 M ORF定位，這是Metapneumovirus成員的特征。MPV F基因編碼一種539個aa的蛋白質(zhì)， 該蛋白比APV-C的F長2個aa殘基(表5)。氨基酸序列分析表明，與APV-C的同源性為 81%，與APV-A和B的同源性為67%，與肺病毒F蛋白的同源性為33-39%，而與其它副粘 病毒的同源性僅有10-18% (表6)。在副粘病毒F蛋白中并且也在MPV中觀察到的保守特 征之一是半胱氨酸殘基的分布(Morrison, 1988 ；Yu等，1991)。metapneumovirus在Fl中 共享12個半胱氨酸殘基(7個在所有副粘病毒中是保守的)，在F2中共享2個半胱氨酸殘 基(1個在所有副粘病毒中是保守的)。在MPV F ORF中存在的3個潛在的N-聯(lián)糖基化位 點中，沒有一個是與RSV共享的，與APV共享2個所述位點(位置66和389)。MPV的第三 個特有的潛在N-聯(lián)糖基化位點位于位置206 (圖11)。雖然與其它副粘病毒的序列同源性 低，但MPV的F蛋白表現(xiàn)出與關(guān)于其它副粘病毒科成員的F蛋白所描述的相一致的典型融 合蛋白的特征(Morrison，1988)。副粘病毒科成員的F蛋白作為無活性前體(FO)合成，被 宿主細胞的蛋白酶切割，產(chǎn)生氨基末端F2亞基和大的羧基末端Fl亞基。已提出的切割位 點(Collins等，1996)在副粘病毒科的所有成員中都是保守的。MPV的所述切割位點含有殘 基RQSR。兩個精氨酸(R)殘基與APV和RSV共享，但谷氨酰胺(Q)和絲氨酸(S)殘基與其 它副粘病毒如人副流感病毒1型、仙臺病毒和麻疹病毒共享(數(shù)據(jù)未顯示)。Fl氨基末端 的疏水性區(qū)據(jù)認為作為膜融合結(jié)構(gòu)域起作用，并且在副粘病毒和麻疹病毒中顯示出高序列 相似性，而在肺病毒中顯示出的序列相似性程度較低(Morrison，1988)。這26個殘基(位 置137-163，圖11)在MPV和APV-C之間是保守的，這與該區(qū)在metapneumovirus中高度保 守相一致(Naylor 等，1998 ；Seal 等，2000)。正如對于APV和其它副粘病毒的F2亞基所觀察到的，與RSV相比，MPV顯示出缺 失22個aa殘基(位置107-128，圖11)。此外，對于RSV和APV，發(fā)現(xiàn)信號肽和錨定結(jié)構(gòu)域 在亞型內(nèi)保守，而在亞型間顯示出高變異性(Plows等，1995 ；Naylor等，1998)。MPV的位于 F2氨基末端的信號肽(aa 10_35，圖11)顯示出與APV-C有一定的序列相似性(26個aa殘 基中的18個是相似的)，與其它APV或RSV有較低的保守性。在Fl羧基末端的膜錨定結(jié)構(gòu) 域中觀察到大得多的變異性，雖然仍觀察到與APV-C有一定的同源性。可用于系統(tǒng)發(fā)育分析的另一合適的可讀框(ORF)包括編碼M2蛋白的0RF。當(dāng)發(fā)現(xiàn) 所分析的M2蛋白與分離株1-2614的M2蛋白的總體氨基酸同一性至少為85%、優(yōu)選至少 90%時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。M2基因是肺病毒亞 科特有的，在所有肺病毒中觀察到兩個重疊的0RF。第一個主要ORF代表M2-1蛋白，該蛋白 增強病毒聚合酶的持續(xù)合成能力(Collins等，1995 ;CollinS，1996)和其基因間區(qū)的通讀 性(Hardy等，1998 ；Fearns等，1999)。MPV的M2-1基因鄰近F基因定位，編碼一種187個aa 的蛋白質(zhì)(表5)，并且顯示出與APV-C的M2-1的同源性最高(84%)(表6)。所有肺病毒 M2-1蛋白的比較表明，在所述蛋白氨基端一半中的保守性最高(Collins等，1990 ；Zamora等，1992 ；Ahmadian等，1999)，這與MPV顯示出在該蛋白的前80個aa殘基中與APV-C的相 似性為100%的保守性的觀察相一致(圖12A)。MPV M2-1蛋白含有3個位于前30個aa殘 基內(nèi)、在所有肺病毒中保守的半胱氨酸殘基。這種半胱氨酸的集中在鋅結(jié)合蛋白中是常見 的(Ahmadian 等，1991 ；Cuesta 等，2000)。與肺病毒M2-10RF重疊的第二 0RF(M2_2)的位置是保守的，但在序列上不保守，所 述ORF被認為參與病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄間轉(zhuǎn)換的控制(Collins等，1985 ；Elango等，1985 ； Baybutt 等，1987 ；Collins 等，1990 ；Ling 等，1992 ；Zamora 等，1992 ；Alansari 等，1994 ； Ahmadian 等，1999 ；Bermingham 等，1999)。對于 MPV 而言，M2-20RF 始于 M2-10RF 中的核苷 酸512 (圖7)，這正是APV-C中的相同起始位置。APV-C和MPV的M2-20RF的長度相同，有 71個aa殘基(表5)。MPV和APV-C之間M2-20RF的序列比較(圖12B)表明有56 %的氨 基酸序列同源性，而在MPV與APV-A和B之間僅有26-27 %的氨基酸序列同源性(表6)。可用于系統(tǒng)發(fā)育分析的另一合適的可讀框(ORF)包括編碼L蛋白的0RF。當(dāng)發(fā)現(xiàn) 所分析的L蛋白與分離株1-2614的L蛋白的總體氨基酸同一性至少為91%、優(yōu)選至少95% 時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分離株。與其它負鏈病毒類似， MPV基因組的最后一個ORF是復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的依賴RNA的RNA聚合酶組分。MPV的L基因 編碼一種2005個aa的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)比APV-A的所述蛋白長1個殘基(表5)。MPV的 L蛋白與APV-A有64 %的同源性，與RSV有42-44 %的同源性，而與其它副粘病毒有約13 % 的同源性(表6)。Poch等(1989;1990)鑒定出非分段負鏈RNA病毒的L蛋白內(nèi)的6個保 守結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域III含有被認為對于聚合酶功能所必需的4個核心聚合酶基序。這些 基序(A、B、C和D)在MPV L蛋白中的保守性很好在基序A、B和C中MPV與所有肺病毒有 100%的相似性，在基序D中，MPV與APV有100%相似性，與RSV有92%的相似性。對于完 整的結(jié)構(gòu)域III (L ORF中的aa 625-847)，MPV與APV有83%的同一性，與RSV有67-68% 的同一性，與其它副粘病毒有26-30%的同一性(圖15)。除所述聚合酶基序之外，肺病毒 的L蛋白含有一個符合共有ATP結(jié)合基序K (X)21GEGAGN⑴；的序列(Stec，1991)。MPV L ORF含有一個與APV類似的基序，其中中間殘基的距離少一個殘基K (χ) 22GEGAGN(X) 19K?？捎糜谙到y(tǒng)發(fā)育分析的更為優(yōu)選的合適的可讀框(ORF)包括編碼SH蛋白的0RF。 當(dāng)發(fā)現(xiàn)所分析的SH蛋白與分離株1-2614的SH蛋白的總體氨基酸同一性至少為30%、優(yōu) 選至少50%、更優(yōu)選至少75%時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV分 離株。所述基因鄰近MPV的M2定位，編碼一種183個aa的蛋白質(zhì)(圖7)。所述核苷酸序 列及其導(dǎo)出的氨基酸序列的分析表明，沒有與其它RNA病毒基因或基因產(chǎn)物可辨別的同源 性。MPV的SH ORF是迄今已知的最長的SH ORF (表5)。所述SH ORF的aa殘基的組成與 APV、RSV和PVM的相當(dāng)相似，具有高百分比的蘇氨酸和絲氨酸(MPV、APV、RSV A,RSV B、bRSV 和PVM的絲氨酸/蘇氨酸含量分別為22%、18%、19%、20. 0%、21%和28% )。MPV的SH ORF含有10個半胱氨酸殘基，而APV SH含有16個半胱氨酸殘基。所有肺病毒都有類似數(shù) 目的潛在的N-糖基化位點(MPV2、APV1、RSV2、bRSV3、PVM4)。MPV SH蛋白以及APV和RSV的SH的疏水性分布型揭示出相似的結(jié)構(gòu)特征(圖 13B)。APV和MPV的SHORF有一個親水性N末端(aal-30)、一個可以充當(dāng)潛在的跨膜結(jié)構(gòu) 域的中心疏水性結(jié)構(gòu)域(aa 30-53)、殘基160周圍的一個第二疏水性結(jié)構(gòu)域和一個親水性 C末端。相反，RSV的SH看來缺乏APV和MPV ORF的C端一半。在所有肺病毒的SH蛋白中，所述疏水性結(jié)構(gòu)域都鄰接多個堿性氨基酸，該堿性氨基酸在MPV的SH ORF中也存在(aa 29 和 54)?？捎糜谙到y(tǒng)發(fā)育分析的另一個更為優(yōu)選的合適的可讀框(ORF)包括編碼G蛋白的 ORF0當(dāng)發(fā)現(xiàn)所分析的G蛋白與分離株1-2614的G蛋白的總體氨基酸同一性至少為30%、優(yōu) 選至少50%、更優(yōu)選為至少75%時，則所分析的病毒分離株包含依照本發(fā)明的優(yōu)選的MPV 分離株。MPV的G ORF鄰近SH基因定位，編碼一種236個氨基酸的蛋白質(zhì)。緊接該ORF之 后，發(fā)現(xiàn)第二個小0RF，可能編碼68個aa殘基(位置6973-7179，)，但缺乏起始密碼子。在 一個不同讀框中的194個aa殘基的第三個主要ORF(片段4，圖7)與這兩個ORF重疊，但 也缺乏起始密碼子(核苷酸6416-7000)。這一主要ORF在同一讀框內(nèi)后接第四個ORF (nt 7001-7198)，可能編碼65個aa殘基，但又是缺乏起始密碼子。最后，在所述第三個讀框中發(fā) 現(xiàn)一個可能的97個aa殘基的ORF (但缺乏起始密碼子)(nt 6444-6737，圖1)。與第一個 ORF不同，所述其它ORF沒有表觀的基因起始序列或基因終止序列(參見下文)。雖然236 個aa殘基的G ORF可能代表MPV吸附蛋白的至少一部分，但不能排除的是所述額外的編 碼序列通過某些RNA編輯事件而作為單獨的蛋白或作為所述吸附蛋白的部分表達。應(yīng)該注 意到，對于APV和RSV而言，在所述主要G ORF之后沒有鑒定出第二個0RF，但APV和RSV在 G的主要ORF內(nèi)都有第二個0RF。然而，缺乏有關(guān)這些ORF表達的證據(jù)，并且在不同病毒的 預(yù)測氨基酸序列之間沒有同源性(Ling等，1992)。MPV G中的第二個ORF沒有顯示出其它 G蛋白的特征，所述額外ORF是否表達有待進一步研究。對于所有4個ORF的BLAST分析表 明，在核苷酸序列或氨基酸序列水平上與其它已知病毒基因或基因產(chǎn)物沒有可辨別的同源 性。這與發(fā)現(xiàn)其它G蛋白例如hRSV A和B的G蛋白(53% ) (Johnson等，1987)以及與APV A和B的G蛋白(38% ) (Juhasz等，1994)的序列同源性低相一致。而大多數(shù)所述MPVORF 在長度和序列上與APV的所述ORF相似，MPV的G ORF比APV的G ORF小得多(表5)。氨基 酸序列表明，絲氨酸和蘇氨酸的含量為34%，這甚至高于RSV的32 %和APV的24%。所述G ORF也含有8. 5 %的脯氨酸殘基，這高于RSV的8 %和APV的7 %。APV、RSV和MPV的G蛋白 中脯氨酸殘基的不尋常的豐度在粘蛋白起源的糖蛋白中也觀察到，在粘蛋白起源的糖蛋白 中這是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的一個主要考慮因素(Collins等，1983 ；Wertz等，1985 Jentoft, 1990)。MPV G中的潛在N-聯(lián)糖基化位點的數(shù)目與其它肺病毒的相似MPV有5個，而hRSV 有7個，bRSV有5個，APV有3-5個。MPV G的預(yù)測疏水性分布型揭示了與其它肺病毒相似的特征。氨基末端含有一個 親水性區(qū)，后接一個短的疏水性區(qū)(aa 33-53)和一個主要為親水性的羧基末端(圖14B)。 這種總體組構(gòu)與錨定II型跨膜蛋白的相一致，與APV和RSV的G蛋白中的這些區(qū)很好地對 應(yīng)。MPV的G ORF僅含有1個半胱氨酸殘基，這與RSV和APV形成對比(分別有5個和20 個)。依照經(jīng)典的血清學(xué)分析，例如得自以下文獻的分析=Francki, R. I. B.，F(xiàn)auquet, C. M. , Knudson, D. L 禾口 Brown, F. , Classification andnomenclature of viruses. Fifth report of the international Committee onTaxonomy of viruses. Arch Virol,1991. Supplement 2 :p. 140-144，根據(jù)通過用動物抗血清(在詳細描述中提供的得自例如白鼬或 豚鼠的抗血清)定量中和測定的免疫學(xué)區(qū)別(immunological distinctiveness)，MPV分 離株也可被鑒定為屬于本文提供的血清型。這樣一種血清型或者與其它血清型沒有交叉反應(yīng)，或者在兩個方向上都顯示出同種與異種效價之比大于16。如果中和表明兩種病毒在任 一個或兩個方向上有一定程度的交叉反應(yīng)(同種與異種效價之比為8或16)，則若存在DNA 的顯著生物物理/生物化學(xué)差異，就推定有血清型區(qū)別(distinctiveness)。如果中和表示 兩種病毒在任一個或兩個方向上有不同程度的交叉反應(yīng)(同種與異種效價之比小于8)，則 推定所研究的分離株的血清型相同。正如所述的，在此提供一種有用的原型分離株例如分 離株1-2614，在本文也稱為MPV分離株00-1。根據(jù)G和/或SH蛋白的同源性，可以進一步將病毒分類為此中提供的分離的基 本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒。在一般APV(從鳥類分離的)和MPV(從人類分離 的)的N、P、M、F、M2和L ORF之間存在64-88%的總體氨基酸序列同一性，并且在APV和 MPV基因組的非編碼區(qū)之間也發(fā)現(xiàn)有核苷酸序列同源性的情況下，發(fā)現(xiàn)在所述人類分離株 (MPV)的所述ORF中的兩個和其它副粘病毒的所述ORF中任一個之間基本上沒有可辨別的 氨基酸序列同源性。在所述病毒基因組中這些ORF的氨基酸含量、疏水性分布型和位置表 明，它們代表G和SH蛋白類似物。在APV和MPV之間的序列同源性、其相似的基因組組構(gòu) (3' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')以及系統(tǒng)發(fā)育分析，提供了有關(guān)所提出的MPV分類為第一 種哺乳動物metapneumovirus的進一步證據(jù)。因此，新的MPV分離株可以例如如此通過以 下方法來鑒定通過病毒分離和用tMK或其它細胞進行特征鑒定、通過RT-PCR和/或序列 分析，后接系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析、通過血清學(xué)技術(shù)例如病毒中和測定、間接免疫熒光測定、 直接免疫熒光測定、FACs分析或其它免疫學(xué)技術(shù)。優(yōu)選這些技術(shù)針對SH和/或G蛋白類 似物。例如，本發(fā)明在此提供一種鑒定此中提供的MPV的其它分離株的方法，所述方法 包括接種基本上為MPV不感染或無特定病原體的豚鼠或自鼬(在詳細描述中，所述動物經(jīng) 鼻內(nèi)接種，但其它接種方式諸如肌內(nèi)或皮內(nèi)接種以及使用其它實驗動物也是可行的)與原 型分離株1-2614或相關(guān)分離株。在第0天、接種后2周和3周，從所述動物收集血清。在 所述其它分離株的免疫學(xué)檢測中，使用用病毒中和(VN)測定和針對相應(yīng)的分離株1-2614 的間接IFA測定為特異性血清轉(zhuǎn)變的動物和得自所述血清轉(zhuǎn)變的動物的血清。作為一個例子，本發(fā)明提供副粘病毒科的一個新成員-在人類中可能引起重癥 RTI的人metapneumovirus或metapneumovirus樣病毒(由于其最終的分類學(xué)有待病毒分 類委員會的討論，所以所述MPV在此例如描述為在分類學(xué)上對應(yīng)于APV) (MPV)的表征。由 MPV引起的疾病的臨床體征基本上與hRSV引起的體征相似，例如咳嗽、肌痛、嘔吐、發(fā)熱、支 氣管炎或肺炎、可能的結(jié)膜炎或它們的并發(fā)癥。正如在hRSV感染的兒童、尤其是非常小的 兒童中所觀察到的，可能需要住院。作為一個例子，提供于2001年1月19日以1-2614保 藏于巴黎巴斯德研究所(Institute Pasteur，Paris) CNCM 的 MPV(MPV-isolate 00-1)或者 在系統(tǒng)發(fā)育上與其對應(yīng)的病毒分離株。此外，本發(fā)明提供一種包含在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于圖 6a.6b.6c中所示的核酸序列或在結(jié)構(gòu)上與其對應(yīng)的核酸或功能片段的病毒。特別是，本發(fā) 明提供一種病毒，所述病毒的特征在于在其中用100個引導(dǎo)程序和3個jumble生成最大似 然進化樹的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析中測試后，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上與對應(yīng)于也稱為火雞鼻氣管 炎病毒(TRTV)(禽鼻氣管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分離株相比，它更密切地對 應(yīng)于以1-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分離株。尤其有用的是，在所述系統(tǒng)發(fā)育進化樹分 析中用APV-C病毒分離株作為外類群，所述APV-C病毒分離株雖然基本上是非哺乳動物病毒，但卻是最相關(guān)的。根據(jù)幾個觀察結(jié)果，我們提議新型人類病毒被命名為人metapneumovirus或 metapneumovirus樣病毒(MPV)。EM分析揭示出副粘病毒樣顆粒。與所述分類一致的是， MPV看來對氯仿處理敏感。MPV最適于在tMK細胞上培養(yǎng)，并且是酪氨酸依賴性的。由MPV 引起的臨床癥狀以及典型的CPE和缺乏血細胞凝集活性提示，這種病毒與hRSV最為相關(guān)。 雖然大多數(shù)副粘病毒有血細胞凝集活性，但大多數(shù)肺病毒沒有所述活性13。作為一個例子，本發(fā)明提供先前尚未鑒定的、得自取自28位患有重癥RTI的兒童 的鼻咽吸出物樣品的副粘病毒。這些兒童的臨床癥狀主要與hRSV所致的癥狀相似。所述 患者中的27位是5歲以下的兒童，其中一半為1-12個月。另一位患者為18歲。所有個體 都患有上呼吸道疾病，癥狀從咳嗽、肌痛、嘔吐和發(fā)熱至支氣管炎和重癥肺炎。這些患者中 的大多數(shù)住院1-2周。得自這些患者的病毒分離株在負對比電子顯微鏡下具有副粘病毒的形態(tài)，但不與 針對已知的人類和動物副粘病毒的特異性抗血清反應(yīng)。通過使用針對所述分離株中的2株 產(chǎn)生的血清的間接免疫熒光測定(IFA)測定，它們之間都密切相關(guān)。這些分離株中的9個的 序列分析表明，所述病毒與APV略微相關(guān)?；诓《緦W(xué)數(shù)據(jù)、序列同源性以及基因組組構(gòu)， 我們提出，所述病毒是Metapneumovirus的成員。血清學(xué)調(diào)查表明，這種病毒是相對常見的 病原體，因為在荷蘭的血清陽性率接近5歲人群的100%。此外，在1958年從人類收集的 血清中，發(fā)現(xiàn)血清陽性率同樣高，表明這種病毒在人群中已經(jīng)循環(huán)超過40年。這種建議的 Metapneumovirus新成員的鑒定，也為開發(fā)供診斷分析或試劑盒和疫苗用的工具和方法、或 者針對病毒呼吸道感染的血清或抗體組合物、以及測試或篩選可用于MPV感染治療的抗病 毒藥的方法創(chuàng)造了條件。在這方面，本發(fā)明其中提供可得自本發(fā)明病毒的分離或重組的核酸或其病毒特異 性功能片段。特別是，本發(fā)明提供適用于鑒定MPV核酸的引物和/或探針。此外，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明核酸的載體。首先，提供載體，例如含有MPV基 因組(的部分)的質(zhì)粒載體、含有MPV基因組(的部分)的病毒載體(例如但不限于其它 副粘病毒、痘苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒)、或含有其它病毒或其它病原體的基因組(的 部分)的MPV。此外，描述了關(guān)于基于兩個臨床參數(shù)產(chǎn)生重組負鏈病毒的多種反向遺傳學(xué) 技術(shù)。首先，這種病毒的產(chǎn)生依賴于所述負義病毒RNA(vRNA)基因組的部分或全長拷貝或 其互補拷貝(cRNA)的復(fù)制?？梢詮耐ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生的或者在用核酸轉(zhuǎn)染時在細胞中 產(chǎn)生的感染性病毒中，分離這種vRNA或cRNA。其次，重組負鏈病毒的產(chǎn)生依賴于功能性聚 合酶復(fù)合體。通常，肺病毒的聚合酶復(fù)合物由N、P、L和可能的M2蛋白組成，但不一定限于 此。聚合酶復(fù)合物或其組分可以從病毒顆粒、表達一種或多種所述組分的細胞中分離，或者 通過用特定表達載體轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。當(dāng)上述vRNA、cRNA或者表達這些RNA的載體由上述聚合酶復(fù)合體復(fù)制16’17’18’19’ 2°’21’22時，可以獲得MPV的感染性拷貝。為了產(chǎn)生小復(fù)制子(minir印licons)或者用于產(chǎn) 生包含大多數(shù)或者完整的MPV基因組的全長拷貝的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，只要運用可得自例如 APV(Randhawa等，1997)或MPV本身的3，端和/或5，端核酸序列即可。另外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。在原核細胞中產(chǎn)生含有 MPV聚合酶組分(推測為N、P、L和M2，但不一定限于此)的質(zhì)?；虿《据d體，以供在相關(guān)細胞類型(細菌、昆蟲細胞、真核細胞)中表達所述組分。將在原核細胞中產(chǎn)生含有MPV基因 組的全長拷貝或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體，以便在體外或體內(nèi)表達病毒核酸。后一類載 體可能含有供產(chǎn)生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白用的其它病毒序列，可以缺乏病毒基因組的多 個部分，以便產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒，并且可以含有某些突變、缺失或插入，以便產(chǎn)生減毒病可以通過依照上述的現(xiàn)有技術(shù)共表達所述聚合酶組分，產(chǎn)生MPV的感染性拷貝 (野生型、減毒型、復(fù)制缺陷型或嵌合型)。另外，可以使用瞬時或穩(wěn)定表達一種或多種全長或部分MPV蛋白的真核細胞。這 類細胞可以通過轉(zhuǎn)染(蛋白質(zhì)或核酸載體)、感染(病毒載體)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒載體)來制 備，并且可用于上述野生型、減毒型、復(fù)制缺陷型或嵌合型病毒的互補。對于產(chǎn)生抗兩種或兩種以上病毒的重組疫苗而言，嵌合病毒可能特別有用23’24’26。 例如，可以設(shè)想，表達RSV的一種或多種蛋白的MPV病毒載體或者表達MPV的一種或多種蛋 白的RSV載體，將保護接種了這類載體的個體抵抗兩種病毒的感染。對于PI3或者其它副 粘病毒，可以設(shè)想相似的方法。對于用活疫苗接種的目的，減毒型和復(fù)制缺陷型病毒可能是 有用的，正如對于其它病毒所建議的25’26。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明的核酸編碼的蛋白性分子或 metapneumovirus特異性病毒蛋白或其功能片段。有用的蛋白性分子例如來源于可得自本 發(fā)明的病毒的任何基因或基因組片段。此中提供的這類分子或其抗原性片段，例如可用于 診斷方法或試劑盒中以及用于藥用組合物中，例如亞單位疫苗中。特別有用的是供作為抗 原或亞單位免疫原來包括的F、SH和/或G蛋白或其抗原性片段，但也可以使用滅活的全病 毒。特別有用的也有由供系統(tǒng)發(fā)育分析用的所鑒定的重組核酸片段所編碼的蛋白性物質(zhì)， 當(dāng)然優(yōu)選可用于系統(tǒng)發(fā)育分析的0RF、尤其是用于無論是體內(nèi)(例如用于保護目的或者用 于提供診斷性抗體)或體外(例如通過噬菌體展示技術(shù)或可用于產(chǎn)生合成抗體的另一種技 術(shù))誘發(fā)MPV特異性抗體的優(yōu)選ORF范圍內(nèi)的那些蛋白性物質(zhì)。在此也提供與包含本發(fā)明的蛋白性分子或其MPV特異性功能片段的抗原特異性 反應(yīng)的抗體，所述抗體為天然的多克隆抗體或單克隆抗體或者為合成的(例如(噬菌體) 文庫衍生的結(jié)合分子)抗體。這類抗體可用于鑒定病毒分離株為MPV的方法中，所述方法包 括使所述病毒分離株或其組分與此中提供的抗體反應(yīng)。這例如可以通過運用純化或非純化 MPV或其部分(蛋白質(zhì)、肽)，采用ELISA、RIA、FACS或相似形式的抗原檢測測定(Current Protocols in Immunology)來實現(xiàn)。另一方面，可以用受感染的細胞或細胞培養(yǎng)物，運用經(jīng) 典的免疫熒光或免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定病毒抗原。用于鑒定病毒分離株為MPV的其它方法包括使所述病毒分離株或其組分與本發(fā) 明的病毒特異性核酸反應(yīng)，特別是在所述哺乳動物病毒包括人類病毒的情況下。這樣，本發(fā)明提供一種病毒分離株，所述病毒分離株可用本發(fā)明的方法鑒定在分 類學(xué)上對應(yīng)于可鑒定為可能屬于副粘病毒科肺病毒亞科中Metapneumovirus的負義單鏈 RNA病毒的哺乳動物病毒。所述方法可用于病毒學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法中，所述方法例如包括通過 使所述哺乳動物的樣品與本發(fā)明的核酸或抗體反應(yīng)，測定所述樣品中病毒分離株或其組分 的存在情況。在詳細描述中進一步給出了實例，例如運用PCR(或本領(lǐng)域眾所周知的其它擴增或雜交技術(shù))或者運用免疫熒光檢測(或者本領(lǐng)域已知的其它免疫學(xué)技術(shù))。本發(fā)明也提供一種血清學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所 述哺乳動物的樣品與本發(fā)明的蛋白性分子或其片段或抗原反應(yīng)，測定所述樣品中特異性針 對MPV或其組分的抗體的存在情況。在此提供的方法和工具，尤其可用于供通過病毒學(xué)診斷或血清學(xué)診斷來診斷MPV 感染用的診斷試劑盒。這類試劑盒或者測定可以例如包含本發(fā)明的病毒、核酸、蛋白性分子 或其片段、抗原和/或抗體。也提供本發(fā)明的病毒、核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或 抗體在生產(chǎn)藥用組合物、例如用于治療或預(yù)防MPV感染和/或用于治療或預(yù)防呼吸道疾病、 特別是人類疾病的藥用組合物中的應(yīng)用。所述病毒的減毒可以通過開發(fā)用于此目的的已建 立的方法來實現(xiàn)，所述方法包括但不限于運用其它物種的相關(guān)病毒、通過實驗動物連續(xù)傳 代和/或組織/細胞培養(yǎng)物、分子克隆的定點誘變和相關(guān)病毒之間基因或基因片段的交換。包含本發(fā)明的病毒、核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗體的藥用組合物， 可以例如用于治療或預(yù)防MPV感染和/或呼吸道疾病的方法中，所述方法包括給個體提供 本發(fā)明的藥用組合物。這在所述個體包括人類時，尤其是當(dāng)所述人群不足5歲時最為有用， 因為這樣的嬰兒和幼兒最可能受在此提供的人MPV感染。一般而言，在急性期，患者將患有 其它呼吸道疾病和其它疾病素因性上呼吸道癥狀。也可能發(fā)生多種其它嚴重疾病素因性的 下呼吸道疾病。本發(fā)明也提供獲得可用于治療呼吸道疾病的抗病毒藥的方法，所述方法包括建立 包含本發(fā)明病毒的細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游?，用候選抗病毒藥處理所述培養(yǎng)物或治療所述動 物，并且測定所述因子對所述病毒或其對所述培養(yǎng)物或動物的感染的影響。這樣的抗病毒 藥的一個例子包括在此提供的MPV中和抗體或其功能組分，但也可獲得其它性質(zhì)的抗病毒 藥。本發(fā)明也提供本發(fā)明的抗病毒藥在藥用組合物制備中、特別是用于治療呼吸道疾病、尤 其是當(dāng)由MPV感染引起的呼吸道疾病的藥用組合物制備中的應(yīng)用；以及提供包含本發(fā)明抗 病毒藥的、可用于治療或預(yù)防MPV感染或呼吸道疾病的方法中的藥用組合物，所述方法包 括為個體提供這樣一種藥用組合物。在詳細描述中進一步解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。圖面說明圖IA為表1 在分離株00-1和肺病毒亞科其它成員的氨基酸序列之間所發(fā)現(xiàn)的 同源性百分率。給出了 N、P、M、F和L中兩個RAP-PCR片段(8和9/10)的氨基酸序列的百 分率(X100)。在材料和方法一節(jié)中描述了所述分析所使用的登記號。圖IB為表2 在根據(jù)年齡組分類的人群中運用免疫熒光測定和病毒中和測定所測 定的MPV的血清陽性率。圖2 =APV基因組中用RAP-PCR和RT-PCR在病毒分離株00_1上獲得的片段的位 置和大小的圖示。片段1-10運用RAP-PCR獲得。片段A用RAP-PCR片段1和2中的一種 引物和基于APV和RSV前導(dǎo)序列和尾隨序列6的比對設(shè)計的一種引物而獲得。片段B用在 RAP-PCR片段1和2中以及RAP-PCR片段3中設(shè)計的引物獲得。片段C用在RAP-PCR片段 3中和RAP-PCR片段4、5、6和7中設(shè)計的引物獲得。對于所有的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，(圖3-5) DNA序列運用ClustalW軟件包進行序列 比對，并且用使用100個引導(dǎo)程序和3個jumble的Phylip3. 5程序的DNA-ML軟件包生成最大似然進化樹15。先前已發(fā)表的用于生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹的序列可得自Genbank，登記 號為對于所有 ORF :hRSV :NC00178I ；bRSV :NC001989 ；對于 F ORF :PVM, Dl 1128 ；APV-A, D00850 ；APV-B, Υ14292 ；APV-C, AF187152 ；對于 N ORF :PVM，D10331 ；APV-A, U39295 ；APV-B, U39296 ；APV-C,AF176590 ；對于 M ORF :PMV, U66893 ；APV-A, X58639 ；APV-B, U37586 ；APV-C, AF262571;對于 P ORF :PVM，09649 ;APV_A，U22110，APV-C，AF176591。用 APV C 毒株作為外 類群，對于9個不同的MPV病毒分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。圖中所用的縮寫:hRSV 人RSV ；bRSV 牛RSV ；PVM 小鼠肺炎病毒；APV-A、B和C 禽肺病毒A、B和C型。圖3 肺病毒亞科成員和病毒分離株00-1的N、P、M和F ORF的比較。所述序列比 對顯示出病毒分離株00-1的完整N、P、M和F蛋白和部分L蛋白的氨基酸序列。顯示了分 離株00-1和其它病毒之間不同的氨基酸，相同的氨基酸用句點表示，空位用破折號表示。 編號對應(yīng)于所述蛋白質(zhì)中的氨基酸位置。所述分析所用的登記號在材料和方法一節(jié)中有描 述。APV-A、B或C :A、B或C型禽肺病毒，bRSV或hRSV ?；蛉撕粑篮习《?，PVM 小鼠 肺炎病毒。L8 用RAP-PCR獲得的位于L中的片段8，L9/10 用RAP-PCR獲得的位于L中的 片段9和10的共有序列。對于P序列比對，從Genebank不能得到APV-B序列。對于L序 列比對，僅可得到bRSV、hRSV和APV-A的序列。圖4 肺病毒亞科(Pneumovirinae)屬成員和病毒分離株00-1的N、P、M禾Π F ORF 的系統(tǒng)發(fā)育分析。用得自以下基因的病毒序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析F (圖面Α)、Ν(圖面B)、 Μ(圖面C)和Ρ(圖面D)。系統(tǒng)發(fā)育進化樹基于使用100個引導(dǎo)程序和3個jumble的最大 似然分析。顯示了每個進化樹的代表核苷酸改變數(shù)目的刻度。圖5 9個原代MPV分離株和與其遺傳上最為相關(guān)的APV-C的F(圖面A)、N(圖 面B)、M(圖面C)和L(圖面D)0RF的部分的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育進化樹基于最大似 然分析。顯示了每個進化樹的代表核苷酸改變數(shù)目的刻度。對于APV-C的登記號圖面A D00850 ；圖面 B :U39295 ；圖面 C :X58639 ；以及圖面 D :U65312。圖6A 得自MPV分離株00_1基因組3’末端的核苷酸序列和氨基酸序列信息。給 出以下ORF =N 核蛋白的ORF ；P 磷蛋白的ORF ；M 基質(zhì)蛋白的ORF ；F 融合蛋白的ORF ；GE 基因結(jié)束；GS 基因起始。圖6B和C:得自MPV分離株00-1所得的聚合酶基因(L)中片段的核苷酸序列和氨 基酸序列信息。所述L中片段的定位基于與APV-C的蛋白質(zhì)同源性(登記號TO5312)。已 翻譯的片段8 (圖6B)位于氨基酸號8-243，片段9和10的共有序列(圖6C)位于APV-C L ORF的氨基酸號1358-1464。圖 7MPV分離株00-1的基因組圖譜。在每個ORF之下，指示了起始密碼子和終止密碼 子的核苷酸位置。橫過的L ORF的雙線指示縮短表示L基因。圖譜下的三個讀框指明第一 G ORF (nt 6262-6972)和重疊的可能的第二 0RF。圖 8 MPV的核蛋白與其它肺病毒的所述蛋白的預(yù)測氨基酸序列的序列比對。由 Barr (1991)鑒定的保守區(qū)以方框表示，并且標注A、B和C。肺病毒中的保守區(qū)(Li，1996) 以灰色陰影顯示?？瘴灰云普厶柋硎?，句點表示與MPV相比相同氨基酸殘基的位置。
圖 9 MPV的磷蛋白與其它肺病毒的所述蛋白的氨基酸序列比較?？蜃⒘烁呦嗨菩缘膮^(qū) (Ling, 1995)，富含谷氨酸的區(qū)以灰色陰影表示?？瘴灰云普厶柋硎?，句點表示與MPV相比 相同氨基酸殘基的位置。圖 10 MPV的基質(zhì)蛋白與其它肺病毒的所述蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列的比較。保守的六 肽序列(Easton，1997)以灰色陰影表示。空位以破折號表示，句點表示與MPV相比相同氨 基酸殘基的位置。圖 11 MPV的融合蛋白與其它肺病毒的所述蛋白的預(yù)測氨基酸序列的比對?？蜃⒘吮Ｊ?的半胱氨酸殘基，N-聯(lián)糖基化位點以下劃線表示，F(xiàn)O的切割位點以雙下劃線表示，融合肽、 信號肽和膜錨定結(jié)構(gòu)域以灰色陰影表示?？瘴灰云普厶柋硎?，句點表示與MPV相比相同氨 基酸的位置。圖 12MPV的M20RF與其它肺病毒的所述ORF的氨基酸序列的比較。M2-10RF的序列比 對示于圖面A中，保守的氨基末端(Collins，1990 ;Zam0ra，1999)以灰色陰影表示。三個保 守的半胱氨酸殘基以粗體印刷并且用#指示。M2-20RF的序列比對示于圖面B中?？瘴灰?破折號表示，句點表示與MPV相比相同氨基酸的位置。圖 13MPV SH ORF的氨基酸序列分析。(A) MPV的SH ORF的氨基酸序列，絲氨酸和蘇氨 酸殘基以灰色陰影表示，半胱氨酸殘基以粗體表示，而疏水性區(qū)以雙下劃線表示。潛在的 N-聯(lián)糖基化位點以單下劃線表示。數(shù)字表示鄰接疏水性結(jié)構(gòu)域的堿性氨基酸的位置。(B) MPV、APV-A和hRSV-B的SH蛋白的疏水性曲線圖的比對。使用Kyte和Doolittle (1982)的 方法和一個17個氨基酸的窗。箭頭表示強疏水性結(jié)構(gòu)域。所述ORF內(nèi)的位置在X軸上給 出ο圖 14MPV G ORF的氨基酸序列分析。(A)MPV的G ORF的氨基酸序列，絲氨酸、蘇氨酸和 脯氨酸殘基以灰色陰影表示，半胱氨酸殘基以粗體表示，而疏水性區(qū)以雙下劃線表示。潛在 的N-聯(lián)糖基化位點以單下劃線表示。(B)MPV、APV-A和hRSV_B的G蛋白的疏水性曲線圖 的比對。使用Kyte和Doolittle (1982)的方法和一個17個氨基酸的窗。箭頭表示所述疏 水性區(qū)。所述ORF內(nèi)的位置在X軸上給出。圖 15MPV和其它副粘病毒的聚合酶基因中保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比較。顯示了結(jié) 構(gòu)域III，框注了結(jié)構(gòu)域III中的4個保守的聚合酶基序(A，B，C，D) (Poch 1998,1999)?？?位以破折號表示，句點表示與MPV相比相同氨基酸殘基的位置。hPIV3 :3型人副流感病毒； SV 仙臺病毒；hPIV-2 2型人副流感病毒；NDV 新城疫病毒；MV 麻疹病毒；nipah =Nipah病毒。圖 16 MPV和所選副粘病毒的M2-1和L ORF的系統(tǒng)發(fā)育分析。所述M2-10RF與肺病毒亞科(Pneumovirinae)屬其它成員的M2-10RF進行序列比對(A)，而所述L ORF與肺病毒亞 科(Pneumovirinae)屬成員以及圖15圖面說明中的所選其它副粘病毒的L ORF進行序列 比對⑶。采用運用100個引導(dǎo)程序和3個jumble的最大似然分析生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。 顯示了每個進化樹的代表核苷酸改變數(shù)目的刻度。進化樹中的數(shù)字代表基于所述共有序列 進化樹的引導(dǎo)程序的數(shù)值。圖 17 hMPV分離株00-1的非編碼序列。㈧所述ORF之間和基因組末端的非編碼序列 以正義方向表示。從左至右，顯示出所示ORF的終止密碼子、后接非編碼序列、所示后續(xù)ORF 的基因起始信號和起始密碼子。數(shù)字表示hMPV圖譜中第一個起始密碼子和終止密碼子的 位置。顯示出與已發(fā)表的基因終止信號有相似性的序列以下劃線表示，顯示出與UAAAAAU/ A/C有相似性的序列以所述序列上的線表示。(B)hMPV基因組末端的核苷酸序列。hMPV基 因組末端相互之間以及與APV的基因組末端進行序列比對。下劃線的區(qū)表示RT-PCR測定 中所使用的、基于APV和RSV的3，端和5，端序列(Randhawa等，1997 ；Mink等，1991)的引 物序列。以粗斜體表示的核苷酸為N基因基因起始信號的部分。Le:前導(dǎo)序列，Tr:尾隨序 列。圖 18 兩種原型hMPV分離株與APV-A和APV-C的比較；編碼各種病毒蛋白的核酸的DNA 相似性矩陣。圖 19 兩種原型hMPV分離株與APV-A和APV-C的比較；各種病毒蛋白的蛋白質(zhì)相似性矩陣。圖 20 兩種原型hMPV分離株核蛋白的氨基酸序列比對圖 21 兩種原型hMPV分離株磷蛋白的氨基酸序列比對圖 22 兩種原型hMPV分離株基質(zhì)蛋白的氨基酸序列比對圖 23 兩種原型hMPV分離株融合蛋白的氨基酸序列比對圖24:兩種原型hMPV分離株M2-1蛋白的氨基酸序列比對圖25:兩種原型hMPV分離株M2-2蛋白的氨基酸序列比對圖26:兩種原型hMPV分離株短疏水性蛋白的氨基酸序列比對圖27:兩種原型hMPV分離株吸附糖蛋白的氨基酸序列比對圖 28 兩種原型hMPV分離株聚合酶蛋白N末端的氨基酸序列比對
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圖29 對接種了 ned/00/01和/或ned/99/Ol的12只豚鼠的咽喉和鼻拭抹物的 RT-PCR分析結(jié)果。圖 30A 用感染 ned/00/01 并且用 ned/00/01 (GP 4、5 和 6)或 ned/99/01 (GP 1 和 3)再感染的豚鼠針對ned/00/01和ned/99/Ol的IgG應(yīng)答。圖 30B:用感染 ned/99/Ol 并且用 ned/00/01 (GP 8 和 9)或 ned/99/01 (GP 10、11、 12)再感染的豚鼠針對ned/00/01和ned/99/Ol的IgG應(yīng)答。圖 31 :ned/00/01 和 ned/99/01 ELISA 對取自用 ned/00/01 或 ned/99/Ol 感染的 豚鼠的血清的特異性。圖 32 針對 3 只同種(00-1/00-1)、2 只同種(99-1/99-1)、2 只異種(99-1/00-1) 和2只異種(00-1/99-1)感染豚鼠的ned/00/01和ned/99/01ELISA的平均IgG應(yīng)答。圖33 :hMPV感染豚鼠的對APV抑制的平均百分率。圖 34 :ned/00/01 和 ned/99/Ol 感染豚鼠針對 ned/00/01、ned/99/Ol 和 APV-C 的 病毒中和效價。圖35 對接種了 ned/00/01 (兩次)的恒河猴的喉拭抹物的RT-PCR測定結(jié)果。圖36A(上面兩幅圖)2只用ned/00/01 (再)感染的恒河猴針對ned/00/01的IgA、IgM和IgG應(yīng)答。圖 36B(下圖)2只用ned/00/01感染的恒河猴針對APV的IgG應(yīng)答。圖37 應(yīng)用hMPV ELISA和APV抑制ELISA檢測人血清中IgG抗體的比較。詳細描述病毒的分離和表征從1980年至2000年，我們發(fā)現(xiàn)了 28種從重癥呼吸道疾病患者中分離的尚未鑒定 的病毒分離株。這28種尚未鑒定的病毒分離株在tMK細胞中生長緩慢，在VERO細胞和A549 細胞中生長差，并且在MDCK或雞胚成纖維細胞中不能繁殖或很少繁殖。這些病毒分離株中 的大多數(shù)在tMK細胞上經(jīng)3次傳代后在第10天和第14天之間誘導(dǎo)CPE。所述CPE實際上 不能區(qū)別于由hRSV或hPIV在tMK或其它細胞培養(yǎng)物中引起的CPE，特征為合胞體形成，此 后細胞表現(xiàn)出快速的內(nèi)部破壞，然后所述細胞與單層分離。所述細胞通常(有時隨后)在 病毒從原始材料傳代3次后，在接種后第10-14天，顯示出CPE，比由其它病毒例如hRSV或 hPIV引起的CPE略晚。我們使用受感染的tMK細胞的上清液進行EM分析，EM分析表明存在帶有13_17 納米短包膜突起的150-600納米的副粘病毒樣病毒顆粒。與有包膜病毒例如副粘病毒科 的生物化學(xué)特性一致的是，標準氯仿處理或乙醚處理8導(dǎo)致對tMK細胞的感染性降低超過 104TCID50。病毒感染的tMK細胞培養(yǎng)上清液對火雞、雞和豚鼠的紅細胞不表現(xiàn)出血細胞凝 集活性。在培養(yǎng)期間，病毒在所測試的細胞上的復(fù)制看來是酪氨酸依賴性的。這些綜合病 毒學(xué)數(shù)據(jù)表明，新鑒定的病毒在分類學(xué)上分類為副粘病毒科的成員。我們從用所述尚未鑒定的病毒分離株中的15株感染的tMK細胞中分離出RNA，以 便用對副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)9、hPIV_4、仙臺病毒、猴病毒5型、新城疫病毒、麻 疹病毒、hRSV腮腺炎病毒、Nipah病毒、Hendra病毒、Tupaia病毒和Mapuera病毒特異性的 引物組，進行逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)分析。RT-PCR分析在低嚴謹性下進行，以便檢測可能相關(guān)的病毒，并且用從同種病毒原液分離的RNA作為對照。所述可利用的對照 與相應(yīng)的病毒特異性引物反應(yīng)陽性，新鑒定的分離株不與任何引物組反應(yīng)，表明該病毒與 所測試的病毒不密切相關(guān)。我們使用所述病毒感染的tMK細胞培養(yǎng)上清液中的兩種，經(jīng)鼻腔接種豚鼠和白 鼬。第0天、接種后2周和3周，從這些動物收集血清。所述動物沒有表現(xiàn)出臨床癥狀，但 用病毒中和(VN)測定和針對所述同源病毒的間接IFA測定，所有動物都發(fā)生血清轉(zhuǎn)變。所 述血清在間接IFA中與上述任何已知的副粘病毒以及與PVM不反應(yīng)。接著，我們用豚鼠和 白鼬感染前和感染后血清篩選了迄今尚未鑒定的病毒分離株，通過用感染后血清進行間接 IFA測定，其中28株明顯為陽性，提示它們在血清學(xué)上密切相關(guān)或相同。RAP PCR為了獲得有關(guān)所述未知病毒分離株的序列信息，我們運用稱為RAP-PCRki的隨機 PCR擴增策略。為此，用其中一種病毒分離株(分離株00-1)以及用作對照的hPIV-Ι感染 tMK細胞。在兩種培養(yǎng)物都顯示出相似水平的CPE之后，在連續(xù)20-60%蔗糖梯度上純化培 養(yǎng)上清液中的病毒。用EM檢查各梯度級分中的病毒樣顆粒，從含有約50%蔗糖的級分中 分離出RNA，其中觀察到核衣殼。用從兩個病毒級分中分離出的等量RNA進行RAP-PCR，此 后將樣品在3% NuSieve瓊脂糖凝膠上并排電泳。隨后從凝膠中純化出20個對所述尚未 鑒定的病毒特異性的差別顯示的條帶，在質(zhì)粒PCR2. I(Invitrogen)中克隆，并且用載體特 異性引物測序。當(dāng)我們使用這些序列來用BLAST軟件(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)對 Genbank數(shù)據(jù)庫中序列進行同源性搜索時，20個片段中的10個顯示出與APV/TRTV序列相 似。這10個片段位于編碼核蛋白(N ；片段1和2)、基質(zhì)蛋白(M;片段3)、融合蛋白 (F;片段4、5、6、7)和聚合醇蛋白(L;片段8、9、10)的基因中(圖2)。我們接著基于我們 的RAP PCR片段以及已發(fā)表的肺病毒亞科的前導(dǎo)序列和尾隨序列6設(shè)計了 PCR引物，以便 完成所述病毒基因組3’端的序列信息。擴增出三個片段，其中片段A跨越N可讀框(ORF) 的最3’端，片段B跨越磷蛋白(P)ORF，而片段C緊靠M ORF和F ORF之間的間隙(圖2)。 這三個片段的序列分析揭示，缺乏在病毒基因組最3’端的NSl和NS20RF，并且F ORF緊鄰 M ORF定位。這種基因組組構(gòu)類似metapneumovirus APV的基因組組構(gòu)，這也與序列同源性 一致。N、P、M和F ORF的總體翻譯序列顯示出與肺病毒屬成員平均有30-33%同源性，與 Metapneumovirus成員有66-68%同源性。對于SH和G 0RF，未發(fā)現(xiàn)與任一上述屬成員有 可辨別的同源性。所發(fā)現(xiàn)的N的氨基酸同源性表明，與hRSV有約40%的同源性，與APV-C 有88%的同源性，與APV-C在遺傳上最密切相關(guān)，這例如可以通過對圖3的氨基酸序列與其 它病毒的相應(yīng)N蛋白的氨基酸序列進行比較而得出。P的氨基酸序列顯示出與hRSV有約 25 %的同源性，與APV-C有約66-68 %的同源性，M顯示出與hRSV有約36-39 %的同源性，與 APV-C有約87-88%的同源性，F(xiàn)顯示出與hRSV有約40%的同源性，與APV-C有約81 %的 同源性，M2-1顯示出與肺病毒有約34-36%的同源性，與APV-C有84-86%的同源性，M2-2 顯示出與肺病毒有15-17%的同源性，與APV-C有56%的同源性，而L中獲得的片段顯示出 與肺病毒平均有44%的同源性，與APV-C有64%的同源性。系統(tǒng)發(fā)育雖然用得自所述尚未鑒定的病毒分離株的核苷酸序列進行BLAST搜索表明，主要與肺病毒亞科成員有同源性，但基于蛋白質(zhì)序列的同源性表明，與其它副粘病毒也有一定 的相似性(數(shù)據(jù)未顯示)。作為所述新鑒定的病毒分離株和肺病毒亞科成員之間相關(guān)的指 示，基于這些病毒的N、P、M和F 0RF，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。在所有4個系統(tǒng)發(fā)育進化樹 中，所述新鑒定的病毒分離株與APV最密切相關(guān)(圖4)。根據(jù)已經(jīng)描述的APV的4種血清 型“，APV C血清型-主要在美國鳥類中發(fā)現(xiàn)的metapneumovirus，顯示出與所述新鑒定的 病毒最為相似。然而，應(yīng)該注意到，僅可得到APV D血清型的部分序列信息。為了確定我們的各種新鑒定的病毒分離株的關(guān)系，我們基于得自8-9個分離株 (對于F為8個，對于N、M和L為9個)的序列信息，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。為此，我們 采用RT-PCR和設(shè)計用于擴增N、M、F和L ORF中短片段的引物，隨后對所述片段直接測序。 也發(fā)現(xiàn)先前發(fā)現(xiàn)在血清學(xué)方面相關(guān)(參見上文)的9個病毒分離株在遺傳上密切相關(guān)。事 實上，所有9個分離株相互之間比與APV之間更為密切相關(guān)。雖然供這些系統(tǒng)發(fā)育進化樹 用的序列信息是有限的，但是看來所述9個分離株可以分為兩組，分離株94-1、99-1和99-2 分為一組，而其它6個分離株(94-2 ；93-1 ；93-2 ；93-3 ；93-4 ；00-1)分為另一組(圖5)。血清陽件率為了研究這種病毒在人群中的血清陽性率，我們通過用以所述尚未鑒定的病毒分 離株之一感染的tMK細胞進行的間接IFA，檢驗得自不同年齡段人群的血清。這種分析揭 示，6-12個月兒童中的25%有針對該病毒的抗體，到5歲為止，接近100%的兒童的血清為 陽性。在通過間接IFA檢驗的總共56份血清樣品中，用VN測定進行檢驗。對于所述樣品 中的51份樣品(91%)，VN測定的結(jié)果(滴度>8)與用間接IFA獲得的結(jié)果(滴度>32) 一致。在IFA中發(fā)現(xiàn)為陽性的4份樣品，通過VN檢驗為陰性(滴度< 8)，而一份血清在IFA 中反應(yīng)為陰性(滴度< 32)，但在VN檢驗中為陽性(滴度為16)(表2)。用1958年取自人類(年齡為8-99歲)的72份血清12’27進行的IFA揭示出100% 的血清陽性率，表明所述病毒在人群中已經(jīng)循環(huán)超過40年。另外，在VN測定中使用這些血 清中的多份血清，以證實IFA數(shù)據(jù)(表2)。N、M、P和F基因的基因分析揭示，MPV與最近建議的屬Metapneumovirinae的序列 同源性(平均63% )高于與屬肺病毒亞科(Pneumovirinae)(平均30% )的序列同源性， 因此證明與APV/TRTV相似和類似的基因組組構(gòu)。與RSVs (‘ 3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2 -L-5')的基因組組構(gòu)相對比，metapneumoviruses缺乏NSl和NS2基因，并且在M和L之 間的基因的定位不同(‘3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')。在我們的病毒分離株中缺乏M和 F基因之間的ORF以及缺乏鄰近N的NSl和NS2以及所發(fā)現(xiàn)的與APV有高氨基酸序列同源 性，是提議從人類中分離的MPV應(yīng)分類為Metapneumovirus的第一個哺乳動物(尤其是人 類來源的)成員。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示，從中獲得序列信息的9個MPV分離株密切相關(guān)。雖然序列信息 有限，但它們實際上相互之間的相關(guān)性比與任何禽metapneumovirus的相關(guān)性更為密切。 在已經(jīng)描述的APV的4種血清型中，基于N、P、M和F基因，C血清型與MPV最密切相關(guān)。然 而，應(yīng)該注意到，從Genbank中僅可得到D血清型F基因的部分序列，對于B血清型，僅可得 到M、N和F序列。我們的MPV分離株在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中形成2個分類群。對于hRSV和 APV,已經(jīng)描述了不同的基因亞型和血清學(xué)亞型。目前仍不了解MPV分離株的所述兩個遺傳 分類群是否代表在功能上也不同的血清學(xué)亞組。我們的血清學(xué)調(diào)查表明，MPV是一種常見的人類病原體。從得自重癥RTI兒童的臨床樣品中重復(fù)分離出這種病毒，表明MPV的臨床 和經(jīng)濟影響可能高。基于病毒檢測和血清學(xué)的新診斷測定，將提供一種這種病毒病原體發(fā) 病率的更為詳細的分析以及這種病毒病原體的臨床和經(jīng)濟影響。IFA結(jié)果和VN結(jié)果(5份樣品)之間略有差異，可能是由于在所述IFA中僅檢測 IgG血清抗體，而VN測定既檢測各抗體類別，也檢測各抗體亞類所致，或者差異可能是由于 兩種測定之間靈敏度的差異所致。對于IFA，使用16的截止值，而VN使用8的截止值。另一方面，IFA與VN測定之間的差異也可能表明這種新鑒定的病毒的不同血清型 之間的可能差異。由于MPV似乎與APV最密切相關(guān)，因此我們推測，所述人類病毒可能起源 于鳥類。對1958年取自人類血清樣品的分析顯示，MPV在人群中已經(jīng)廣泛流傳超過40年， 表明在1958年之前很久，必定發(fā)生了假定的動物傳染病事件。材料和方法樣本采集在過去數(shù)十年間，我們的實驗室從患有RTI的兒童收集了鼻咽吸出物，對其常規(guī) 檢驗了病毒的存在情況。所有鼻咽吸出物都通過采用針對流感病毒A和B型、hRSV和人副 流感病毒(hPIV) 1-3型的熒光標記抗體的直接免疫熒光測定(DIF)進行了檢驗。也對所述 鼻咽吸出物進行了處理，以便用快速shell vial技術(shù)14，對包括VERO細胞、第三代恒河猴腎 (tMK)細胞、人肺內(nèi)皮(HEL)細胞和marbin dock腎(MDCK)細胞在內(nèi)的各種細胞系進行病 毒分離。在傳代2-3次后顯示出細胞病變效應(yīng)(CPE)并且在DIF中為陰性的樣品，通過采 用針對以下病毒的病毒特異性抗體的間接免疫熒光測定(IFA)進行測試流感病毒A、B和 C型、hRSV A和B型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒(hPIV) 1-4型、仙臺病毒、猴病毒 5型和新城疫病毒。雖然對于許多病例而言，可以鑒定出病原，但某些樣本對于所測所有這 些病毒都是陰性的。肓接免疫熒光測定(DIF)依照已描述的方法14’15，用得自RTI患者的鼻咽吸出物樣品來進行DIF和病毒 分離。樣品貯存于-70°C。簡而言之，鼻咽吸出物用5mlDulbecco MEM(Bioffhittaker, ffalkersville,MD)稀釋，在渦旋混合器上充分混合1分鐘。將懸浮液以840Xg離心10分 鐘。將沉淀涂在多點(multispot)玻片(Nutacon，Leimuiden，The Netherlands)上，用上 清液進行病毒分離。干燥后，將細胞在丙酮中于室溫固定1分鐘。洗滌后，玻片于37°C用市 售的FITC標記的病毒特異性抗血清例如抗流感病毒A和B、hRSV和hPIV 1-3的病毒特異 性抗血清(Dako，Glostrup, Denmark)保溫15分鐘。用PBS洗滌3次并且在自來水中洗滌 1次之后，使玻片包含在甘油/PBS溶液(Citifluor，UKC, Canterbury, UK)并使其被覆蓋。 用 Axioscop 熒光顯微鏡(Carl Zeiss B. V, ffeesp, the Netherlands)分析玻片。病毒分離為了分離病毒，將 tMK 細胞(RIVM，Bilthoven，The Netherlands)在帶有玻片 的 24 孔板(Costar, Cambridge, UK)中，用補充 10%胎牛血清(BioWhittaker，Vervier, Belgium)的下述培養(yǎng)基培養(yǎng)。在接種之前，所述板用PBS洗滌，然后加入含有Hank氏鹽 的 Eagle 氏 MEM(ICN，Costamesa, CA)，在所述培養(yǎng)基中，半升補充 0. 26 克 NaHC03、0. 025M Hepes(Biowhittaker)、2mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)、100 單位青霉素、100 μ g 鏈霉素 (Biowhittaker)、0· 5 克乳清蛋白(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht, The Netherlands)、1· O克 D-葡萄糖(Merck, Amsterdam, TheNetherlands)、5· 0 克蛋白胨(Oxoid, Haarlem, The Netherlands)和 0.02%酪氨酸(Life Technologies, Bethesda, MD)。在所述板中一式三 份接種所述鼻咽吸出物樣品的上清液，每孔0. 2ml，然后以840Xg離心1小時。接種后，讓 所述板于37°C最多孵育14天，一周更換一次培養(yǎng)基，每日檢查培養(yǎng)物的CPE。14天后，從第 二次傳代培養(yǎng)物中刮出細胞，然后再孵育14天。對于第三次傳代，重復(fù)該步驟。用所述玻 片如下所述通過間接IFA證實所述病毒的存在。動物免疫通過實驗性鼻內(nèi)感染在單獨的加壓手套箱中關(guān)養(yǎng)的兩只無特定病原體的白鼬和 兩只豚鼠，產(chǎn)生針對所述新發(fā)現(xiàn)的病毒的白鼬和豚鼠特異性抗血清。2-3周后，通過心臟穿 刺，給所有動物放血，用其血清作為參比血清。如下所述，用間接IFA檢驗所述血清中所有 先前描述的病毒。通過間接IFA檢測抗原我們在含有受感染tMK細胞的玻片上進行間接IFA。用PBS洗滌后，將玻片于37°C 與病毒特異性抗血清一起孵育30分鐘。我們在DIF中使用如上所述的針對流感病毒A、B 和C型、hPIV 1-3型和hRSV的單克隆抗體。對于hPIV4型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺 病毒、猴病毒5型、新城疫病毒，使用多克隆抗體(RIVM)以及白鼬和豚鼠參比血清。用PBS 洗滌3次和用自來水洗滌1次后，玻片用針對第一次孵育中所用血清的第二抗體染色。對 于所述多克隆抗血清的第二抗體是山羊抗白鼬(KPL，Guilford, UK，稀釋40倍)、小鼠抗兔 (Dako，Glostrup，Denmark，稀釋20倍)、兔抗雞(KPL，稀釋20倍)和小鼠抗豚鼠(Dako，稀 釋20倍)。按照關(guān)于DIF所述的方法處理玻片。通過間接IFA檢測人抗體為了檢測病毒特異性抗體，用冷丙酮將受感染的tMK細胞固定在蓋玻片上，用PBS 洗滌，然后用1-16稀釋度的血清樣品染色。隨后，樣品用在PBS中稀釋80倍的FITC標記 的兔抗人抗體(Dako)染色。如上所述處理玻片。MPV的病毒培養(yǎng)物在上述培養(yǎng)基中的tMK細胞亞融合單層中，接種在24孔板中傳代2-3次后顯示出 CPE的樣品的上清液。每日檢查培養(yǎng)物的CPE，一周更換一次培養(yǎng)基。由于CPE隨每種分離 株而不同，在第12-14天，使用針對所述新病毒分離株的白鼬抗體，運用間接IFA檢驗所有 培養(yǎng)物。將陽性培養(yǎng)物凍融3次，此后通過低速離心澄清所述上清液，分成等分樣品并凍 存于-70°C。按照已描述的方法16，測定培養(yǎng)上清液中病毒的50%組織培養(yǎng)物感染性劑量 (TCID50)。病毒中和測定用人血清和動物血清以8倍稀釋度開始的2倍連續(xù)稀釋液，進行VN測定。經(jīng)稀釋 的血清與100TCID50的病毒一起溫育1小時，然后接種到在96孔板中生長的tMK細胞中， 此后，將板以840X g離心。在3天和6天后更換培養(yǎng)基，在接種后8天，用針對MPV的白鼬 抗體進行IFA。VN滴度被定義為導(dǎo)致陰性IFA和抑制細胞培養(yǎng)物中CPE的血清樣品的最低 稀釋度。病毒表征按照已描述的方法8’14，進行血細胞凝集測定和氯仿敏感性試驗。對于EM分析，在微量離心機中于4°C以17000Xg，從受感染細胞培養(yǎng)上清液中濃縮病毒，此后，將沉淀 重懸于PBS，用負對比EM檢查。對于RAP-PCR，通過在60%蔗糖墊層(cussion)上超離心 (150000Xg 2小時，4°C )，從受感染的tMK細胞上清液濃縮病毒。60%蔗糖中間相隨后用 PBS稀釋，然后鋪在20-60%連續(xù)蔗糖梯度頂部，以275000Xg于4°C離心16小時。用EM和 聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用銀染，檢查蔗糖梯度各級分中病毒樣顆粒的存在情況?？磥砗?有核衣殼的約50%蔗糖的級分，用于RNA分離和RAP-PCR。RNA 分離用High Pure RNA Isolation kit (高純度RNA分離試劑盒)，依照生產(chǎn)商的說明 (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands)，從受感染細胞培養(yǎng)物的上清液或蔗糖梯 度級分中分離RNA。RT-PCR在附錄1中描述了用于對已知副粘病毒進行RT-PCR的病毒特異性寡核苷酸序列。 在含有 50mM Tris. HCl ρΗ 8. 5、50mM NaCl、4mMMgCl2、2mM 二硫蘇糖醇、dNTP 各 200 μ Μ、10
RNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands) > 10 Jp.^ AMV RT (Promega, Leiden, The Netherlands)、5 單位 Amplitaq Gold DNA 聚合酶(ΡΕ Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands)和 5μ 1 RNA 的 50 μ 1 反應(yīng)物中，進行一步 RT-PCR。循環(huán) 條件為 42°C 45min 和 95°C 7min 一次，95°C lmin、42°C 2min 和 72°C 3min 重復(fù) 40 次，以及 72 °C IOmin 一次。RAP-PCRRAP-PCR基本上按照已描述的方法1(1進行。在附錄2中描述了所述寡核苷酸序列。 對于RT反應(yīng)，在含有IOng/μ 1寡核苷酸、IOmM 二硫蘇糖醇、dNTP各500 μ m、25mM Tris-HCl ρΗ 8. 3、75mM KCl和3mM MgCl2的10 μ 1反應(yīng)物中含有2 μ 1 RNA。將反應(yīng)混合物于70°C保 溫5分鐘，于37°C保溫5分鐘，然后加入200單位Superscript RT酶(LifeTechnologies)。 繼續(xù)于37°C保溫55分鐘，通過于72°C保溫5分鐘終止反應(yīng)。將RT混合物稀釋，得到含 有 8ng/y 1 寡核苷酸、dNTP 各 300ym、15mM Tris-HCL ρΗ 8. 3、65mM KC1、3. OmM MgCL2 和 5單位Taq DNA聚合酶(ΡΕ Biosystems)的50 μ 1 PCR反應(yīng)物。循環(huán)條件為94°C 5min、 40 °C 5min 和 72C Imin 一次，然后于 94°C lmin、56°C 2min 和 72°C Imin 重復(fù) 40 次，然后 于72 °C 5min 一次。在RAP-PCR之后，用RT-PCR產(chǎn)物各15 μ 1在3 % NuSieve瓊脂糖凝 月交(FMC BioProducts, Heerhugowaard, The Netherlands)ffi Qiaquick Gel ExtractionKit (凝膠提取試劑盒)(Qiagen，Leusden，The Netherlands)，從凝膠中純化差 別顯示出對MPV特異性的片段，依照生產(chǎn)商的說明，將其克隆到pCR2. 1載體(Invitrogen， Groningen, The Netherlands)中。序列分析在載體pCR2. 1 (Invitrogen)中克隆的RAP-PCR產(chǎn)物用M13特異性寡核苷酸 測序。用 Qiaquick Gel Extraction Kit (凝膠提取試劑盒)(Qiagen，Leusden, The Netherlands)，從瓊脂糖凝膠中純化通過RT-PCR獲得的DNA片段，用供PCR用的相同的寡 TOSIiftiiJji。 ffl Dyenamic ETterminator sequencing kit(Dyenamic ET
齊Ll盒)(AmershamPharmacia Biotech,Roosendaal,The Netherlands)禾口 ABI 373 自云力 DNA 測序儀(ΡΕ Biosystem)進行序列分析。所有技術(shù)都依照生產(chǎn)商的說明進行。
通過RT-PCR產(chǎn)牛MPV的基因組片段為了產(chǎn)生跨越RAP-PCR片段之間的間隙A、B和C(圖2)的PCR片段，我們對從病 毒分離株00-1分離的RNA運用如上所述的RT-PCR測定。使用以下引物對于片段A設(shè)計位于前導(dǎo)序列中的 TRl (5 ‘ -AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3 ‘) 和設(shè)計位于所獲得的N中RAP-PCR片段3，端的附(5 ‘ -CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3 ‘)。對于片段B :設(shè)計位于所獲得的N中RAP-PCR片段5’端的N2 (5 ‘ -CATGCAAGCTTATGGGGC-3 ‘)和設(shè)計位于所獲得的M中RAP-PCR片段3，端的Ml (5 ‘ -CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3‘)。對于片段C :設(shè)計位于所獲得的M中RAP-PCR片段5’端的M2 (5 ‘ -GTAGAACTAGGAGCATATG-3 ‘)和設(shè)計位于所獲得的F中RAP-PCR片段3 ’端的F1 (5 ‘ -TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3 ‘)。如上所述，從凝膠中純化所述片段、將其克隆并測序。用于診斷MPV的RT-PCR為了對所述MPV分離株中9株的N、M、F和L ORF的部分進行擴增和測序，我 們使用引物 N3 (5 ‘ -GCACTCAAGAGATACCCTAG-3 ‘)和 N4 (5 ‘ -AGACTTTCTGCTTTGCTGCCT G-3')，來擴增一個 151 個核苷酸的片段，使用 M3 (5 ‘ -CCCTGACAATAACCACTCTG-3 ‘) 和 M4 (5 ‘ -GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3 ‘)擴增一個 252 個核苷酸的片段，使用 F7 ( 5 ‘ -TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3 ‘)和 F8(5 ‘ -TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3 ‘) 擴增一個221個核苷酸的片段，使用L6 (5 ‘ -CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3 ‘)和 L7 (5 ‘ -CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3 ‘)擴增一個173個核苷酸的片段。如上所述進行 RT-PCR、凝膠純化和直接測序。此外，所用的探針是用于M 的探針5' -TGC TTG TAC TTC CCA AAG-3'用于N 的探針5' -TAT TTG AAC AAA AAG TGT-3‘用于L 的探針5 ‘ -TGGTGTGGGATATTAACAG-3 ‘系統(tǒng)發(fā)育分析對于所有系統(tǒng)發(fā)育進化樹，用ClustalW軟件包進行DNA序列的比對，用使用100 個引導(dǎo)程序和3個jumble的Phylip 3. 5程序的DNA-ML軟件包15，生成最大似然進化 樹。用于生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹的先前已發(fā)表的序列可從Genbank獲得，登記號為對于所 有 ORF :hRSV :NC001781 ；bRSV :NC001989 ；對于 F ORF :PVM, Dl 1128 ；APV-A, D00850 ；APV-B, Υ14292 ；APV-C,AF187152 ；對于 N ORF :PVM，D10331 ；APV-A, U39295 ；APV-B, U39296 ；APV-C, AF176590 ；對于 M ORF :PMV，U66893 ；APV-A, X58639 ；APV-B, U37586 ；APV-C，AF262571 ；對于 P ORF :PVM, 09649 ；APV-A, U22110, APV-C, AF176591。用 APV C 毒株作為外類群，對所述 9 個不同的MPV病毒分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。圖中所用的縮寫:hRSV 人RSV ；bRSV 牛RSV ；PVM 小鼠肺炎病毒；APV-A、B和C 禽肺病毒A、B和C型。鑒定MPV的方法的實施例樣本采集為了發(fā)現(xiàn)病毒分離株，應(yīng)該檢查優(yōu)選得自哺乳動物例如人、食肉動物(狗、貓、 mustellits、海豹等)、馬、反芻動物(牛、綿羊、山羊等)、豬、兔、鳥類(家禽、鴕鳥等)的鼻咽吸出物、喉和鼻拭抹物、支氣管肺泡灌洗液。從鳥類，也可以檢查泄殖腔拭抹物和糞便。應(yīng) 該收集血清，以進行免疫學(xué)測定，例如ELISA和病毒中和測定。所采集的病毒樣本用5ml Dulbecco MEM 培養(yǎng)基(Bio ffhittaker, Walkersville, MD)稀釋，并且在渦旋混合器上充分混合1分鐘。將懸浮液以840Xg離心10分鐘。對于免 疫熒光技術(shù)，將沉淀涂在多點(multispot)玻片(Nutacon，Leimuiden, The Netherlands) 上，而用上清液進行病毒分離。病毒分離為了分離病毒，將 tMK 細胞(RIVM，Bilthoven，The Netherlands)在帶有玻片 的 24 孔板(Costar, Cambridge, UK)中，用補充 10%胎牛血清(BioWhittaker，Vervier, Belgium)的下述培養(yǎng)基培養(yǎng)。在接種之前，所述板用PBS洗滌，然后加入含有Hank氏 鹽的 Eagle 氏 MEM (ICN，Costamesa, CA)，所述培養(yǎng)基補充 0. 52 克 / 升 NaHC03、0. 025M Hepes(Biowhittaker)、2mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)、200 單位 / 升青霉素、200 μ g/ 升鏈霉素(Biowhittaker)U 克 / 升乳清蛋白(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht, The Netherlands)、2· O 克 / 升 D-葡萄糖(Merck, Amsterdam, The Netherlands)、10 克 / 升蛋白 胨(Oxoid, Haarlem, The Netherlands)禾口 0.02%酪氨酸(Life Technologies, Bethesda, MD)。在所述板中一式三份接種所述鼻咽吸出物樣品的上清液，每孔0. 2ml，然后以840Xg 離心1小時。接種后，讓所述板于37°C最多孵育14天，一周更換一次培養(yǎng)基，每日檢查培養(yǎng) 物的CPE。14天后，從第二次傳代培養(yǎng)物中刮出細胞，然后再孵育14天。對于第三次傳代， 重復(fù)該步驟。用所述玻片如下所述通過間接IFA證實所述病毒的存在。一般在第三次傳代后，在第8-14天觀察到CPE，這取決于分離株。所述CPE實際 上不能區(qū)別于由hRSV或hPIV在tMK或其它細胞培養(yǎng)物中引起的CPE。然而，hRSV從大約 第4天開始誘導(dǎo)CPE。CPE的特征為合胞體形成，此后細胞表現(xiàn)出快速的內(nèi)部破壞，然后所 述細胞與單層分離。對于某些分離株，難以觀察到CPE，而用IFA證實這些培養(yǎng)物中所述病 毒的存在。MPV的病毒培養(yǎng)物在上述培養(yǎng)基中的tMK細胞亞融合單層中，接種在24孔板中傳代2-3次后顯示出 CPE的樣品的上清液。每日檢查培養(yǎng)物的CPE，一周更換一次培養(yǎng)基。由于CPE隨每種分離 株而不同，在第12-14天，使用針對所述新病毒分離株的白鼬抗體，運用間接IFA檢驗所有 培養(yǎng)物。將陽性培養(yǎng)物凍融3次，此后通過低速離心澄清所述上清液，分成等分樣品并凍存 于-70°C。按照本領(lǐng)域中所使用的、已建立的技術(shù)16，測定培養(yǎng)上清液中病毒的50%組織培 養(yǎng)物感染性劑量(TCID50)。病毒表征按照已經(jīng)很好建立并且在本領(lǐng)域使用的已描述的技術(shù)14，進行血細胞凝集測定和 氯仿敏感性試驗。對于EM分析，在微量離心機中于4°C以17000Xg，從受感染細胞培養(yǎng)上 清液中濃縮病毒，此后，將沉淀重懸于PBS，用負對比EM檢查。通過間接IFA檢測抗原如上所述處理所采集的樣本，將樣品沉淀涂在多點(multispot)玻片上。干燥后， 將細胞在丙酮中于室溫固定1分鐘?；蛘?，在帶有玻片的24孔載玻片(24 well slide)中的tMK細胞上培養(yǎng)病毒。這些玻片用PBS洗滌，并于室溫在丙酮中固定1分鐘。用PBS洗滌后，將玻片于37°C與在PBS中以1 50_1 100稀釋的多克隆抗體一 起孵育30分鐘。我們用經(jīng)免疫的白鼬和豚鼠獲得了多克隆抗體，但這些抗體可以在各種動 物中產(chǎn)生，對于每種免疫，所述多克隆抗體的工作稀釋度可以改變。用PBS洗滌3次和用自 來水洗滌1次后，玻片與FITC標記的山羊抗白鼬抗體(KPL，Guilford, M，稀釋40倍)一 起于37°C孵育30分鐘。用PBS洗滌3次和用自來水洗滌1次后，使玻片包含在甘油/PBS 溶液(Citifluor，UKC, Canterbury, UK)中并使其被覆蓋。用Axioscop熒光顯微鏡(Carl Zeiss B. V. , ffeesp, the Netherlands)分析玻片。通過間接IFA檢測人類,哺乳動物，反芻動物或其它動物的抗體。為了檢測病毒特異性抗體，用丙酮將用MPV感染的tMK細胞固定在蓋玻片上(如 上所述)，用PBS洗滌，然后與1-16稀釋度的血清樣品一起于37°C孵育30分鐘。用PBS洗 滌2次和用自來水洗滌1次后，玻片與FITC標記的針對所用物種的第二抗體(Dako) —起 于37°C孵育30分鐘。如上所述處理玻片?？贵w可以用熒光染料直接標記，這將產(chǎn)生直接免疫熒光測定。FITC可以用任何熒 光染料替代。動物免疫通過實驗性鼻內(nèi)感染在單獨的加壓手套箱中關(guān)養(yǎng)的兩只無特定病原體的白鼬和 兩只豚鼠，產(chǎn)生針對所述新發(fā)現(xiàn)的病毒的白鼬和豚鼠特異性抗血清。2-3周后，通過心臟穿 刺，給所述動物放血，用其血清作為參比血清。如下所述用間接IFA，對所述血清檢驗所有先 前描述的病毒。其它動物種也適合用于產(chǎn)生特異性抗體制備物，可以使用其它抗原制備物。病毒中和測定(VN測定)用人血清和動物血清以8倍稀釋度開始的2倍連續(xù)稀釋液，進行VN測定。經(jīng)稀釋 的血清與100TCID50的病毒一起孵育1小時，然后接種到在96孔板中生長的tMK細胞中， 此后，將板以840Xg離心。使用如上所述的相同培養(yǎng)基。在3天和6天后更換培養(yǎng)基，8天 后，進行IFA (參見上文)。VN滴度被定義為導(dǎo)致陰性IFA和抑制細胞培養(yǎng)物中CPE的血清 樣品的最低稀釋度。RNA 分離用High Pure RNA Isolation kit (高純度RNA分離試劑盒)，依照生產(chǎn)商的說明 (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands)，從受感染細胞培養(yǎng)物的上清液或蔗糖梯 度級分中分離RNA。也可以依照本領(lǐng)域已知的其它方法分離RNA(Current Protocols in Molecular Biology)。RT-PCR在含有50mM Tris. HCl pH 8. 5、50mM NaCl、4mM MgCl2、2mM 二 硫蘇糖醇、 dNTP 各 200 μ MUO 單位重組 RNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands)、10 單位 AMV RT (Promega, Leiden, The Netherlands) >5 ^ Amplitaq Gold DNA ^ ^ g| (PE Biosystems,Nieuwerkerk aan deIjssel,The Netherlands)禾口 5 μ 1 RNA 的 50 μ 1 反應(yīng)物 中，進行一步 RT-PCR。循環(huán)條件為 42°C 45min 和 95°C 7min 一次，95°C lmin、42°C 2min 和 72°C 3min 重復(fù) 40 次，以及 72°C IOmin 一次。用于診斷性PCR的引物
在核蛋白中N3(5'-GCACTCAAGAGATACCGTAG-3 ‘)禾PN4(5' -AGACTTTCTGCTTTG CTGCCTG-3')，用以擴增一個151個核苷酸的片段。在基質(zhì)蛋白中M3(5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3 ‘)和 M4(5' -GCCAACTGATTTG GCTGAGCTC-3')，用以擴增一個252個核苷酸的片段。在聚合酶蛋白中L6(5 ‘ -CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3 ‘)和 L7 (5 ‘ -CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3 ‘)，用以擴增一個173個核苷酸的片段?？梢曰贛PV的序列設(shè)計其它引物，對于特定的目的，可以使用不同的緩沖液和 測定條件。序列分析用 Dyenamic ET terminator sequencing kit (Dyenamic ET 終止測序試劑盒) (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands)禾口 ABI 373 自動 DNA 測序 儀(ΡΕ Biosystem)進行序列分析。所有技術(shù)都依照生產(chǎn)商的說明進行。PCR片段用供PCR 用的相同寡核苷酸直接測序，或者用Qiaquick Gel Extraction Kit(凝膠提取試劑盒) (Qiagen, Leusden, The Netherlands)，從凝膠中純化所述片段，并且依照生產(chǎn)商的說明，將 其克隆到 PCR2. 1 載體(Invitrogen，Groningen, The Netherlands)中，隨后用 M13 特異性 寡核苷酸測序。m^mm^mm (缺乏 NSI/NS2)3’ mmmMm^m.基于Randhawa (1997)發(fā)表的hRSV和APV的尾隨序列和前導(dǎo)序列，設(shè)計引物TRl ( 5' -AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3‘)，基于所獲得的N蛋白中的序列，設(shè)計引物附(5‘ -C TGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3 ‘ )。RT-PCR測定和測序如上所述來進行。所述RT-PCR得到一種約500個堿基對的產(chǎn)物，該產(chǎn)物太小，以致于不能含有兩個 ORF的信息，這些序列的翻譯并未揭示出0RF。通過ELISA檢測人類、哺乳動物、反芻動物或其它動物的抗體在副粘病毒科中，N蛋白是豐度最高的蛋白質(zhì)，針對這種蛋白的免疫應(yīng)答在感染 早期發(fā)生。由于這些原因，優(yōu)選使用重組來源的所述N蛋白來開發(fā)用于檢測抗MPV抗體的 ELISA測定。適用于抗體檢測的抗原包括與接觸過或被MPV病毒感染的患者的任何MPV特 異性抗體結(jié)合的任何MPV蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選抗原包括主要在接觸了 MPV的患者中引發(fā)免 疫應(yīng)答并因此通常最容易為患者的抗體所識別的那些抗原。特別優(yōu)選的抗原包括MPV的N、 F和G蛋白。供免疫學(xué)技術(shù)用的抗原可以是天然抗原，或者可以是其經(jīng)修飾的形式。可以運 用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)，來改變MPV抗原的氨基酸序列，以產(chǎn)生可以用于免疫學(xué)技 術(shù)的經(jīng)修飾形式的所述抗原。用于克隆基因、操作所述基因以加入到表達載體和從表達載體中取出、以及在 異源宿主中表達由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的方法是眾所周知的，這些技術(shù)可以用來提 供所述表達載體、宿主細胞以及用于在宿主中表達所克隆的編碼抗原的基因，以產(chǎn)生供 診斷測定使用的重組抗原。參見例如Molecular cloning, A laboratory manual and CurrentProtocols in Molecular Biology?？梢杂酶鞣N各樣的表達系統(tǒng)來產(chǎn)生MPV抗原。 例如，適合于在大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(B. subtilis)、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細 胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的各種各樣的表達載體已有描述，可以用其中任一種，來產(chǎn)生適用于檢測 接觸過MPV病毒的患者體內(nèi)的抗MPV抗體的MPV抗原。
桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)點是提供蛋白的必需加工，因此優(yōu)選桿狀病毒表達系 統(tǒng)。該系統(tǒng)利用多角體蛋白啟動子來指導(dǎo)MPV抗原的表達(Matsuura等，1987，J. Gen. Virol. 68 1233-1250)。由重組桿狀病毒產(chǎn)生的抗原可以用于各種各樣的免疫學(xué)測定中，以檢測患者體內(nèi) 的抗MPV抗體。已經(jīng)很好確立的是，重組抗原可以用來在實際上任何的免疫測定中替代天 然病毒，來檢測病毒特異性抗體。這些測定包括直接測定和間接測定、夾心測定、固相測定 其中例如使用板或微珠的那些固相測定、和液相測定。合適的測定包括用第一抗體和第二 抗體的那些測定、以及使用抗體結(jié)合試劑例如A蛋白的那些測定。此外，在本發(fā)明中可以使 用各種各樣的檢測方法，包括比色、熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、發(fā)光和放射性方法。實施例1 采用重組N蛋白的間接抗MPV IgG EIA可以進行采用重組N蛋白(用重組桿狀病毒在昆蟲(Sf9)細胞中產(chǎn)生的)作為抗 原的間接IgG EIA0對于抗原制備，用所述重組桿狀病毒感染Sf9細胞，在感染后3-7天收 獲。細胞懸浮液在PBS，pH 7.2中洗滌2次，調(diào)至5. OX IO6細胞/ml的細胞密度，然后凍融 3次。通過低速離心(500Xg，15min.)沉淀大的細胞碎片，收集上清液，將其貯存于-70°C待 用。對于陰性對照抗原，類似地處理未經(jīng)感染的細胞。用100 μ 1凍融裂解液來包被微量滴定板，其稀釋度范圍為1 50至1 1000。 在兩個復(fù)份孔中加入未經(jīng)感染的細胞裂解液，用作陰性對照。在保溫過夜后，用PBS/0. 05% Tween洗板2次。試驗血清在ELISA緩沖液(PBS，補充正常山羊血清至2%，并且補充0. 5% 牛血清白蛋白和0. 奶粉)稀釋1 50至1 200，然后將各孔于37°C保溫1小時。用PBS/0. 05% Tween洗板2次。向各孔中加入在ELISA緩沖液中以1 3000至 1 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗人(或針對其它物種)IgG,于37°C保溫1小 時。然后用PBS/0. 05% Tween洗板2次，用自來水洗板1次，于室溫與酶底物TMB-例如得 自Sigma的3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺一起保溫15分鐘，并且用100 μ 1 2M磷酸終止反 應(yīng)。用自動微量滴定板讀出儀，測量450nm的比色讀數(shù)。實施例2 采用重組核蛋白的捕獲抗MPV IgM EIA可以采用先前Erdman等(1990) J. Clin. Microb. 29 :1466_1471描述的測定的改進 測定，進行用重組核蛋白或任何其它重組蛋白作為抗原的捕獲IgM EIA0向微量滴定板的各孔中，加入親和純化的抗人IgM捕獲抗體(或針對其它物種的 抗體)，例如得自Dako的所述抗體，濃度為每孔0. IM碳酸鹽緩沖液pH 9. 6中的250ng。于 室溫過夜保溫后，用PBS/0. 05% Tween洗板2次。以三個重復(fù)孔加入100 μ 1在ELISA緩 沖液中以1 200至1 1000稀釋的試驗血清，于37°C保溫1小時。然后用PBS/0.05% Tween洗板2次。所述凍融(經(jīng)重組病毒感染的)Sf21細胞裂解液在ELISA緩沖液中以1 100至 1 500稀釋，加入至各孔中，于37°C保溫2小時。未經(jīng)感染的細胞裂解液用作陰性對照， 以兩個重復(fù)孔加入。然后用PBS/0. 05% Tween洗板3次，與100 μ 1在ELISA緩沖液中最適 稀釋度的抗MPV的多克隆抗體于37°C —起保溫1小時。用PBS/0. 05% Tween洗滌2次后， 所述板與辣根過氧化物酶標記的第二抗體(例如兔抗白鼬)一起保溫，將所述板于37°C保 溫20分鐘。然后用PBS/0. 05% Tween洗板5次，于室溫與酶底物TMB-例如得自“Sigma”的3,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺一起保溫15分鐘，并且用100 μ 1 2Μ磷酸終止反應(yīng)。用自動 微量滴定板讀出儀，測量450nm的比色讀數(shù)。用得自患有臨床MPV病毒感染的人的急性期和恢復(fù)期血清對，比較采用重組核蛋 白(或其它重組蛋白)以及采用MPV全病毒的捕獲IgM EIA的靈敏度。通過檢驗得自健康 人和患有其它副粘病毒感染的人的血清樣本，測定重組核蛋白捕獲EIA的特異性。龍誦藤滅·汰產(chǎn)Φ白働目MPV艦舶禾口蘭_ ELA _■。糖蛋白G和F是MPV病毒體的兩種跨膜包膜糖蛋白，是主要的中和保護性抗原。這 些糖蛋白在載體病毒系統(tǒng)例如桿狀病毒系統(tǒng)中的表達，提供了一種供用于檢測MPV特異性 抗體的測定用的重組抗原源。此外，它們與例如核蛋白聯(lián)用，進一步提高了酶免疫測定在檢 測抗MPV抗體中的靈敏度?？梢允褂酶鞣N各樣的其它免疫學(xué)測定(Current Protocols inlmmunology)，作為 本文所述方法的替代方法。為了發(fā)現(xiàn)病毒分離株，可以檢查優(yōu)選但不限于得自人、食肉動物(狗、貓、海豹 等)、馬、反芻動物(牛、綿羊、山羊等)、豬、兔、鳥類(家禽、鴕鳥等)的鼻咽吸出物、喉和鼻 拭抹物、支氣管肺泡灌洗液和喉拭抹物。從鳥類，也可以檢查泄殖腔和小腸拭抹物以及糞 便。對于所有樣品，可以進行血清學(xué)(抗體和抗原檢測等)、病毒分離和核酸檢測技術(shù)，來檢 測病毒。可以通過用純化的MPV或其部分(蛋白質(zhì)、肽)免疫小鼠(或其它動物)，然后隨后 用已建立的雜交瘤技術(shù)(Currentprotocols in Immunology)，產(chǎn)生單克隆抗體?；蛘?，為此 可以使用噬菌體展示技術(shù)(Currentprotocols in Immunology)。同樣，可以從受感染的人 或動物，或者從經(jīng)免疫的人或動物，獲得多克隆抗體(Currentprotocols in Immunology) 0檢測NSl和NS2蛋白是否存在，可以用采用各種各樣抗體制劑的蛋白質(zhì)印跡分析、 IFA、免疫沉淀技術(shù)來進行。檢測在病毒分離株中是否存在NSl和NS2基因或其同源物，可 以用PCR，用根據(jù)已知的NSl和/或NS2基因設(shè)計的引物組以及各種各樣的核酸雜交技術(shù)來 進行。 為了確定NS1和NS2基因是否存在于病毒基因組的3’端，可以用對所述基因組的 這一 3’端特異性的引物來進行PCR。在我們的情況下，我們使用對所述病毒基因組3’非 翻譯區(qū)特異性的一種引物和NORF中的一種引物。對于同一目的，可以設(shè)計其它引物。根據(jù) PCR產(chǎn)物的長度和/或核苷酸序列，揭示缺乏NS1/NS2基因。對NSl和/或NS2基因特異 性的引物可以與對所述病毒基因組3’端的其它部分(例如所述非翻譯區(qū)或N、M或F 0RF) 特異性的引物聯(lián)用，以達到對存在NSl基因或NS2基因的陽性鑒定。除PCR之外，對于相同 的目的，可以使用各種各樣的技術(shù)，例如分子克隆、核酸雜交。實施例3 =MPV的不同血清型/亞組通過分析9個病毒分離株的N、M、F和L ORF中的部分核苷酸序列，鑒定出兩個可能 的遺傳分類群。在分類群內(nèi)觀察到90-100%的核苷酸同一性，在分類群間觀察到81-88% 的同一性。用更多病毒分離株獲得的序列信息，證實存在兩種基因型。作為A分類群原型 的病毒分離株ned/00/01和作為B分類群原型的病毒分離株ned/99/Ol已經(jīng)用于交叉中和 測定中，以測試所述基因型是否與不同的血清型或亞組相關(guān)。MM運用RT-PCR測定，用位于聚合酶基因中的引物，我們從鼻咽吸出物樣品中鑒定出另外30個病毒分離株。有關(guān)這些新分離株的基質(zhì)基因和聚合酶基因的部分的序列信息、以 及有關(guān)先前9個分離株的所述序列信息，用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖16)。這些進化樹的 分析證實存在兩個遺傳分類群，病毒分離株ned/00/00-1為A組的原型病毒，而病毒分離株 ned/99/Ol為B組的原型病毒。組內(nèi)的核苷酸序列同一性超過92%，而所述分類群之間的 所述同一性為81-85%。已經(jīng)用病毒分離株ned/00/01和ned/99/Ol來接種白鼬，以產(chǎn)生病毒特異性抗血 清。這些抗血清與所述兩種病毒一起用于病毒中和測定。表3 病毒中和滴度
分離株00-1分離株99-1免疫前血清 白鼬A (00-1)□ 2□ 2白鼬A 22dpi (00-1)64□ 2免疫前血清 白鼬B (99-1)□ 2□ 2白鼬B 22dpi (99-1)464 對于分離株00-1，滴度相差32 (64/2)倍
對于分離株99-1，滴度相差16 (64/4)倍另外，6只豚鼠已經(jīng)接種了任一種所述病毒(ned/00/01和ned/99/Ol)。對鼻咽吸 出物樣品的RT-PCR測定表明，病毒從感染后第2天至第10天復(fù)制。感染后第70天，用或 者同種病毒或者異種病毒攻擊所述豚鼠，在所有4種情況下，都觀察到了病毒的復(fù)制。表 4 注釋對于第二次感染，不再包括豚鼠2和9。在首次攻擊后用抗血清進行的病毒中和測定顯示出與用白鼬進行的VN測定基本 相同的結(jié)果(VN滴度的差異> 16倍)。在該實施例中所述的結(jié)果證實存在兩種基因型，它們對應(yīng)于MPV的兩個血清型， 并且表明有被異種病毒和同種病毒重復(fù)感染的可能性。實施例4 進一步的序列測定該實施例描述了對MPV可讀框(ORF)序列和基因間序列以及基因組末端的部分序 列的進一步分析。MPV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)和融合蛋白(F)基因的序列分析揭 示，與主要在美國鳥類發(fā)現(xiàn)的禽肺病毒APV C血清型的序列同源性程度最高。這些分析也 揭示，缺乏位于病毒基因組3’端的非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2，并且融合蛋白緊鄰基質(zhì)蛋白定 位。在此，我們提出22K(M2)蛋白、小疏水性(SH)蛋白、吸附(G)蛋白和聚合酶(L)蛋白基 因、以及基因間區(qū)和尾隨序列的序列。與先前描述的序列一起，此中提出的序列完成了 MPV 的基因組序列，但基因組末端的最后12-15個核苷酸除外，因而建立了 MPV的基因組組構(gòu)。 MPV基因組的序列與APV A、B和C亞型、RSV A和B亞型、PVM和其它副粘病毒的序列的并 排比較，提供了有關(guān)MPV應(yīng)分類在Metapneumovirus中的強有力的證據(jù)。MM序列策略MPV分離株00-1 (van den Hoogen等，2001)在第三代猴腎(tMK)細胞中繁殖， 用接種后3周從上清液中分離的RNA作為供RT-PCR分析用的模板。根據(jù)可得到的MPV 00-1的部分序列信息(van den Hoogen等，2001)以及APV和RSV的前導(dǎo)序列和尾隨序列 (Randhawa等，1997 ；Mink等，1991)設(shè)計引物。最初，通過RT-PCR擴增產(chǎn)生在先前所得產(chǎn) 物之間的、大小范圍為長500bp至4Kb的片段，并且直接測序。隨后，通過產(chǎn)生一系列大小 范圍為500-800bp、代表完整MPV基因組的重疊RT-PCR片段，證實所述基因組序列。對于所 有PCR片段，對兩條鏈直接測序，以將擴增和測序錯誤減至最低。用所述核苷酸序列和氨基 酸序列，使用BLAST軟件(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)，搜索與Genbank數(shù)據(jù)庫中序列的 同源性。基于與已知病毒基因的同源性以及它們在所述基因組中的位置，指定蛋白質(zhì)名稱。 根據(jù)這一信息，構(gòu)建了 MPV的基因組圖譜(圖7)。MPV基因組長13378個核苷酸，其組構(gòu)與 APV的基因組組構(gòu)相似。下面，我們提出了 MPV的ORF和非編碼序列與其它副粘病毒的ORF和非編碼序列之間的比較，并且討論了重要的相似性和差異。核蛋白(N)基因正如所示的，MPV基因組圖譜中的第一個基因編碼一種394個氨基酸(aa)的蛋白 質(zhì)，并且表現(xiàn)出與其它肺病毒的N蛋白有廣泛的同源性。所述N ORF的長度與APV-C的N ORF 的長度相同(表5)，而小于其它副粘病毒N ORF的長度(Barr等，1991)。氨基酸序列的分析 揭示，與APV-C的同源性最高(88% )，而與其它副粘病毒僅有7-11%的同源性(表6)。Barr等(1991)鑒定出在屬于單分子負鏈RNA病毒目的病毒之間有相似性的3個 區(qū)A、B和C(圖8)。雖然在病毒科內(nèi)的相似性最高，但這些區(qū)在病毒科之間是高度保守 的。在所有3個區(qū)中，MPV顯示出與APV-C有97%氨基酸序列同一性，與APV-B有89%氨 基酸序列同一性，與APV-A有92 %氨基酸序列同一性，與RSV和PVM有66-73 %氨基酸序 列同一性。氨基酸殘基160和340之間的區(qū)看來在metapneumovirus中高度保守，在肺病 毒亞科中的保守性略低(Miyahara等，1992 ；Li等，1996 ；Barr等，1991)。這與MPV是一種 metapneumovirus相一致，顯示出與APV C有100%相似性。磷蛋白(P)基因所述基因組圖譜中的第二個ORF編碼一種294個氨基酸的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與 APV-C的P蛋白有68%的氨基酸序列同源性，與RSV的P蛋白僅有22-26%的氨基酸序列同 源性(表6)。MPV的P基因含有一個實質(zhì)上的0RF，在這方面與得自許多其它副粘病毒的P 相似(有關(guān)綜述參見 Lamb 和 Kolakofsky，1996 ；Sedlmeier 等，1998)。與APV A和B以及PVM相反，而與RSV和APV-C相似，MPVP ORF缺乏半胱氨酸殘 基。Ling(1995)提出，在所有肺病毒之間相似性高的一個區(qū)(aa 185-241)在RNA合成過 程或者在維持核衣殼復(fù)合體的結(jié)構(gòu)完整性方面起作用。這一高相似性的區(qū)也存在于MPV中 (圖9)，尤其是當(dāng)考慮到保守取代時，顯示出與APV-C有100%的相似性，與APV-A和B有 93%的相似性，與RSV有約81%的相似性。正如關(guān)于APV所描述的(Ling等，1995)，MPV P 蛋白的C末端富含谷氨酸殘基。基質(zhì)(M)蛋白基因MPV基因組的第三個ORF編碼一種254個氨基酸的蛋白質(zhì)，類似其它肺病毒的M ORF。MPV M ORF與其它metapneumovirus的MORF的大小完全相同(表5)，并且表現(xiàn)出與 APV的基質(zhì)蛋白的氨基酸序列同源性高(78-87 % )，與RSV和PVM基質(zhì)蛋白的同源性較低 (37-38% )，而與其它副粘病毒基質(zhì)蛋白的同源性為10%或更低(表6)。Easton (1997)對所有肺病毒的基質(zhì)蛋白的序列作出了比較，發(fā)現(xiàn)位于殘基14-19的 一個保守七肽，所述七肽在MPV中也是保守的(圖10)。對于RSV、PVM和APV而言，已經(jīng)鑒定 出M主要ORF內(nèi)或者與M主要ORF重疊的小的第二個ORF (bRSV中的52個aa和51個aa，RSV 中的 75 個 aa, PVM 中的 46 個 aa 和 APV 中的 5laa) (Yu 等，1992 ；Easton 等，1997 ；Samal 等， 1991 ；Satake等，1984)。我們注意到MPV MORF中有兩個小0RF。在M主要ORF內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個始 于核苷酸2281的54個aa殘基的小ORF (片段1，圖7)，發(fā)現(xiàn)一個始于核苷酸2893的與M主 要ORF重疊的33個aa殘基的小ORF(片段2，圖7)。與RSV和APV的第二 ORF相似，在這些 第二 ORF和其它肺病毒的第二 ORF之間沒有顯著的同源性，并且缺乏表觀的起始信號或終止 信號。另外，有關(guān)對應(yīng)于APV和RSV的這些第二 ORF的蛋白質(zhì)的合成的證據(jù)尚未有報道。融合蛋白(F)基因
MPV的F ORF鄰近M ORF定位，這是Metapneumovirus成員的特征。MPV的F基因 編碼一種539個aa的蛋白質(zhì)，該蛋白比APV-C的F長2個aa殘基(表5)。氨基酸序列分 析表明，與APV-C的同源性為81 %，與APV-A和B的同源性為67 %，與肺病毒F蛋白的同源 性為33-39%，而與其它副粘病毒的同源性僅有10-18% (表6)。在副粘病毒F蛋白中并且 也在MPV中觀察到的保守特征之一是半胱氨酸殘基的分布(Morrison，1988 ；Yu等，1991)。 metapneumovirus在Fl中共享12個半胱氨酸殘基(7個在所有副粘病毒中是保守的)，在 F2中共享2個半胱氨酸殘基(1個在所有副粘病毒中是保守的)。在MPV F ORF中存在的3 個潛在的N-聯(lián)糖基化位點中，沒有一個是與RSV共享的，與APV共享2個所述位點(位置 74和389)。MPV的第三個特有的潛在N-聯(lián)糖基化位點位于位置206 (圖11)。雖然與其它副粘病毒的序列同源性低，但MPV的F蛋白表現(xiàn)出與關(guān)于其它副粘病 毒科成員的F蛋白所描述的相一致的典型融合蛋白的特征(Morrison，1988)。副粘病毒科 成員的F蛋白作為無活性前體(FO)合成，被宿主細胞的蛋白酶切割，產(chǎn)生氨基末端F2亞基 和大的羧基末端Fl亞基。已提出的切割位點(Collins等，1996)在副粘病毒科的所有成員 中都是保守的。MPV的所述切割位點含有殘基RQSR。兩個精氨酸(R)殘基與APV和RSV共 享，但谷氨酰胺(Q)和絲氨酸(S)殘基與其它副粘病毒如人副流感病毒1型、仙臺病毒和麻 疹病毒共享(數(shù)據(jù)未顯示)。Fl氨基末端的疏水性區(qū)據(jù)認為作為膜融合結(jié)構(gòu)域起作用，并且在副粘病毒和麻 疹病毒中顯示出高序列相似性，而在肺病毒中顯示出的序列相似性程度較低(Morrison， 1988)。這26個殘基(位置137-163，圖11)在MPV和APV-C之間是保守的，這與該區(qū)在 metapneumovirus 中高度保守相一致(Naylor 等，1998 ；Seal 等，2000)。正如對于APV和其它副粘病毒的F2亞基所觀察到的，與RSV相比，MPV顯示出缺 失22個aa殘基(位置107-128，圖11)。此外，對于RSV和APV，發(fā)現(xiàn)信號肽和錨定結(jié)構(gòu)域 在亞型內(nèi)保守，而在亞型間顯示出高變異性(Plows等，1995 ；Naylor等，1998)。MPV的位于 F2氨基末端的信號肽(aa 10-35，圖11)顯示出與APV-C有一定的序列相似性(26個aa殘 基中的18個是相似的)，與其它APV或RSV有較低的保守性。在Fl羧基末端的膜錨定結(jié)構(gòu) 域中觀察到大得多的變異性，雖然仍觀察到與APV-C有一定的同源性。22K (M2)蛋白M2基因是肺病毒亞科特有的，在所有肺病毒中觀察到兩個重疊的0RF。第一個 主要ORF代表M2-1蛋白，該蛋白增強病毒聚合酶的持續(xù)合成能力(Collins等，1995 ； Collins, 1996)和其基因間區(qū)的通讀性(Hardy 等，1998 ；Fearns 等，1999)。MPV 的 M2-1 基 因鄰近F基因定位，編碼一種187個aa的蛋白質(zhì)(表5)，并且顯示出與APV-C的M2-1的 同源性最高(84%)(表6)。所有肺病毒M2-1蛋白的比較表明，在所述蛋白氨基端一半中 的保守性最高(Collins等，1990 ；Zamora等，1992 ；Ahnadian等，1999)，這與MPV顯示出在 該蛋白的前80個aa殘基中與APV-C的相似性為100%的保守性的觀察相一致(圖12A)。 MPVM2-1蛋白含有3個位于前30個aa殘基內(nèi)、在所有肺病毒中保守的半胱氨酸殘基。這種 半胱氨酸的集中在鋅結(jié)合蛋白中是常見的(Ahmadian等，1991 ；Cuesta等，2000)。與肺病毒M2-1 ORF重疊的第二 ORF(M2_2)的位置是保守的，但在序列上不保守，所 述ORF被認為參與病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄間轉(zhuǎn)換的控制(Collins等，1985 ；Elango等，1985 ； Baybutt 等，1987 ；Collins 等，1990 ；Ling 等，1992 ；Zamora 等，1992 ；Alansari 等，1994 ；Ahmadian 等，1999 ；Bermingham 等，1999)。對于 MPV 而言，M2-2 ORF 始于 M2-1 ORF 中的核苷 酸512(圖7)，這正是APV-C中的相同起始位置。APV-C和MPV的M2-20RF的長度相同，有71 個aa殘基(表5)。MPV和APV-C之間M2-20RF的序列比較(圖12B)表明有64%的氨基酸序 列同源性，而在MPV與APV-A和B之間僅有44-48 %的氨基酸序列同源性(表6)。小疏水件蛋白(SH)ORF所述基因鄰近MPV的M2定位，可能編碼一種183個aa的SH蛋白(圖1和7)。在 該ORF和其它RNA病毒基因或基因產(chǎn)物之間沒有可辨別的序列同一性。由于在肺病毒SH 蛋白之間的序列相似性一般都低，所以這一點并不出乎意料。hMPV的推定SH ORF是迄今已 知的最長的SH ORF (表1)。所述SH ORF的aa組成與APV、RSV和PVM的相當(dāng)相似，具有高 百分比的蘇氨酸和絲氨酸殘基(hMPV、APV、RSVA, RSV B、bRSV和PVM的絲氨酸/蘇氨酸含 量分別為22%、18%、19%、20. 0%、21%和28% )。hMPV的SH ORF含有10個半胱氨酸殘 基，而APV SH含有16個半胱氨酸殘基。hMPV的SH ORF含有2個潛在的N-聯(lián)糖基化位點 (aa76和121)，而APV有1個所述位點，RSV有2個或3個，而PVM有4個。推定的hMPV SH蛋白以及APV和RSV的SH的親水性分布型揭示出相似的特征(圖 7B)。APV和hMPV的SH ORF有一個親水性N末端、一個可以充當(dāng)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域的中心 疏水性結(jié)構(gòu)域(對于hMPV為aa 30-53)、一個第二疏水性結(jié)構(gòu)域(aa 155-170)和一個親 水性C末端。相反，RSV的SH看來缺乏APV和hMPV ORF的C末端部分。在所有肺病毒的 SH蛋白中，所述疏水性結(jié)構(gòu)域都鄰接多個堿性氨基酸殘基，該堿性氨基酸殘基在hMPV的SH ORF中也存在(aa 29和54)。吸附糖蛋白(G)ORFhMPV的推定的G ORF鄰近推定的SH基因定位，編碼一種236個aa的蛋白質(zhì) (nt 6262-6972，圖1)。緊接該ORF之后，發(fā)現(xiàn)第二個小0RF，可能編碼68個aa殘基(nt 6973-7179)，但缺乏起始密碼子。在在所述第二讀框中的一個194個aa殘基的第三個可 能的ORF與這兩個ORF重疊，但也缺乏起始密碼子(nt 6416-7000)。這一 ORF在同一讀框 內(nèi)后接一個65個aa殘基的第四個可能的ORF(nt 7001-7198)，但又是缺乏起始密碼子。 最后，在所述第三個讀框中發(fā)現(xiàn)一個可能的97個aa殘基的ORF(但缺乏起始密碼子)(nt 6444-6737，圖1)。與第一個ORF不同，所述其它ORF沒有表現(xiàn)的基因起始序列或基因終止 序列(參見下文)。雖然236個aa的G ORF可能代表hMPV吸附蛋白的至少一部分，但不能 排除的是所述額外的編碼序列通過某些RNA編輯事件而作為單獨的蛋白或作為所述吸附 蛋白的部分表達。應(yīng)該注意到，對于APV和RSV而言，在所述主要G ORF之后沒有鑒定出第 二個0RF，但APV和RSV在G的主要ORF內(nèi)都有第二個0RF。然而，缺乏有關(guān)這些ORF表達 的證據(jù)，并且在不同病毒的預(yù)測氨基酸序列之間沒有序列同一性(Ling等，1992)。hMPV G 中的第二個ORF沒有顯示出其它G蛋白的特征，所述額外ORF是否表達有待進一步研究。對于所有ORF的BLAST分析表明，在核苷酸序列或氨基酸序列水平上與其它已知 病毒基因或基因產(chǎn)物沒有可辨別的序列同一性。這與發(fā)現(xiàn)其它G蛋白例如hRSV A和B的 G 蛋白(53% ) (Johnson 等，1987)以及與 APVA 禾口 B 的 G 蛋白(38 % ) (Juhasz 和 Easton， 1994)的序列同一性百分比低相一致。而大多數(shù)所述hMPV ORF在長度和序列上與APV的所述ORF相似，hMPV的236個 aa殘基的推定G ORF比APV的G ORF小得多(表1)。氨基酸序列表明，絲氨酸和蘇氨酸的含量為34%，這甚至高于RSV的32%和APV的24%。所述推定的G ORF也含有8. 5%的脯 氨酸殘基，這高于RSV的8 %和APV的7 %。APV、RSV和hMPV的G蛋白中脯氨酸殘基的不 尋常的豐度在粘蛋白起源的糖蛋白中也觀察到，在粘蛋白起源的糖蛋白中這是蛋白質(zhì)三維 結(jié)構(gòu)的一個主要考慮因素(Collins 和 Wertz，1983 ；Wertz 等，1985 Jentoft, 1990)。hMPV 的G ORF含有5個潛在N-聯(lián)糖基化位點，而hRSV有7個，bRSV有5個，APV有3_5個。hMPV G的預(yù)測親水性分布型揭示了與其它肺病毒相似的特征。氨基末端含有一個 親水性區(qū)，后接一個短的疏水性區(qū)(對于hMPV為aa33-53)和一個主要為親水性的羧基末 端(圖8B)。這種總體組構(gòu)與錨定II型跨膜蛋白的相一致，與APV和RSV的G蛋白中的這 些區(qū)很好地對應(yīng)。hMPV的推定G ORF僅含有1個半胱氨酸殘基，這與RSV和APV形成對比 (分別有5個和20個)。當(dāng)然，所述G基因內(nèi)4個第二 ORF中的僅2個ORF含有一個額外 的半胱氨酸殘基，這4個可能的ORF顯示出12-20%的絲氨酸和蘇氨酸殘基以及6-11%的 脯氨酸殘基。聚合酶基因(L)與其它負鏈病毒類似，MPV基因組的最后一個ORF是復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的依賴RNA的 RNA聚合酶組分。MPV的L基因編碼一種2005個aa的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)比APV-A的所述 蛋白長1個殘基(表5)。MPV的L蛋白與APV-A有64 %的同源性，與RSV有42-44 %的同源 性，而與其它副粘病毒有約13%的同源性(表6)。Poch等(1989 ； 1990)鑒定出非分段負鏈 RNA病毒的L蛋白內(nèi)的6個保守結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域III含有被認為對于聚合酶功能所必需 的4個核心聚合酶基序。這些基序(A、B、C和D)在MPV L蛋白中的保守性很好在基序A、 B禾口 C中MPV與所有肺病毒有100%的相似性，在基序D中，MPV與APV有100%相似性，與 RSV有92%的相似性。對于完整的結(jié)構(gòu)域III (L ORF中的aa 627-903)，MPV與APV有77% 的同一性，與RSV有61-62%的同一性，與其它副粘病毒有23-27%的同一性(圖15)。除 所述聚合酶基序之外，肺病毒的L蛋白含有一個符合共有ATP結(jié)合基序K (X)21GEGAGN(X)2tlK 的序列(Stec，1991)。MPV L ORF含有一個與APV類似的基序，其中中間殘基的距離少一個 殘基K(x)22GEGAGN (X) 19K。系統(tǒng)發(fā)育分析作為MPV和肺病毒亞科成員之間關(guān)系的一個指標，先前已經(jīng)構(gòu)建了基于N、P、M和 F ORF的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(van den Hoogen等，2001)，并且揭示出MPV和APV-C之間關(guān)系密 切。因為MPV SH和G基因與其它副粘病毒的所述基因的同源性低，所以不能對于這些基因 構(gòu)建可靠的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。另外，肺病毒屬和Metapneumovirus的成員之間不同的基因 組組構(gòu)，使得不可能基于所述完整的基因組序列生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。因此，我們除了對那 些先前已發(fā)表的基因之外，僅對M2基因和L基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。這兩個進化樹證 實，在肺病毒亞科內(nèi)APV和MPV密切相關(guān)(圖16)。MV非編碼序列副粘病毒基因組的基因接點在每個基因的起點和結(jié)尾(基因起始信號和基因終 止信號)處含有短的高度保守的、可能在轉(zhuǎn)錄起始和終止中起作用的核苷酸序列(Curran 等，1999)。MPV的所有基因之間的基因間序列的比較揭示出一個N、P、M、F、M2和G的基因 起始信號的共有序列GGGACAAGU(圖17A)，該序列與metapneumovirus的共有基因起始信 號(Ling 等，1992 ;Yu 等，1992 ;Li 等，1996 ；Bayon -Auboyer 等，2000)相同。發(fā)現(xiàn) MPV 的SH基因和L基因的基因起始信號與這一共有序列略有不同(SH :GGGAUAAU, L :GAGACAAAU)。 對于APV，也發(fā)現(xiàn)L的基因起始信號與所述共有序列不同AGGACCAAT (APV-A) (Randhawa等， 1996)和 GGGACCAGT (APV-D) ( Bayon -Auboyer 等，2000)。 與MPV和APV的基因起始序列相似相比，APV的共有基因終止序列 UAGUUAAUU (Randhawa等，1996)在MPV基因間序列中不能找到。除G-L基因間區(qū)之外，在 大多數(shù)基因中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列是UAAAAA U/A/C，該重復(fù)序列可能起基因終止信號的作用。 然而，由于我們是對病毒RNA測序，而不是對mRNA測序，所以不能指定確定的基因終止信 號，因此需要進一步研究。肺病毒的基因間區(qū)在大小和序列上有所不同(Curran等，1999 ； Blumberg等，1991 ；Collins等1983)。MPV的基因間區(qū)沒有顯示出與APV和RSV的基因間 區(qū)有同源性，并且其大小范圍為10-228個核苷酸(圖17B)。MPV的M ORF和F ORF之間的 基因間區(qū)含有始于主要M ORF的第二 ORF的一部分(參見上文)。SH和G之間的基因間 區(qū)含有192個核苷酸，基于所有三個讀框中存在許多終止密碼子，看來沒有編碼潛力。G和 L之間的基因間區(qū)含有241個核苷酸，可能包括額外的ORF(參見上文)。有趣的是，L ORF 的起始位于這些第二 ORF中。而APV的L基因不在前面的G ORF中起始，RSV的L ORF也 在前面的M2基因內(nèi)起始。在副粘病毒基因組的3’末端和5’末端，短的基因外區(qū)被稱為前 導(dǎo)序列和尾隨序列，前導(dǎo)序列的前12個核苷酸和尾隨序列的最后12個核苷酸大致互補，可 能是因為它們分別含有病毒啟動子的基本元件(Curran等，1999 ；Blumberg等，1991 ；Mink 等，1986)。MPV和APV的3’前導(dǎo)序列的長度都是41個核苷酸，在這兩種病毒的核苷酸16 和41之間的區(qū)中觀察到一定的同源性(26個核苷酸中的18個)(圖17B)。如上所述，MPV 基因組圖譜的前15個核苷酸基于以APV基因組為基礎(chǔ)的引物序列。MPV 5’尾隨序列的長 度(188個核苷酸)類似RSV 5’尾隨序列的大小(155個核苷酸)，這比APV的5’尾隨序 列(40個核苷酸)長得多。MPV尾隨序列和APV尾隨序列的末端40個核苷酸的序列比對揭 示，除代表基于APV的基因組序列的引物序列的最末端12個核苷酸之外，32個核苷酸中有 21個有同源性。我們的序列分析揭示，在所述基因組3’端缺乏NSl和NS2基因，并且基因 組組構(gòu)類似 metapneumovirus 的組構(gòu)(3' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5 ‘)。所發(fā)現(xiàn)的 MPV 和 APV基因之間的序列同源性高，進一步強調(diào)了這兩種病毒之間的密切關(guān)系。對于MPV的N、 P、M、F、M2-1和M2-2基因而言，發(fā)現(xiàn)與APV-C的總體氨基酸同源性為79%。事實上，對于這 些基因而言，APV-C和MPV顯示出的序列同源性在其它屬的亞組之間例如RSV-A和B或者 APV-A和B之間所發(fā)現(xiàn)的序列同源性相同的范圍內(nèi)。APV-C和MPV的這種密切關(guān)系在系統(tǒng)發(fā) 育分析中也觀察到，系統(tǒng)發(fā)育分析揭示，MPV和APV-C總是在同一樹枝(branch)中，與包含 APV-A和B的樹枝分開。相同的基因組組構(gòu)、序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析都支持將MPV分類 為Metapneumovirus內(nèi)可從哺乳動物中分離的第一個成員。應(yīng)該注意到，在MPV的不同病毒 分離株之間所發(fā)現(xiàn)的在N、M、F和L基因方面的序列變異表明，可能存在不同的基因型(van den Hoogen等，2001)。MPV和APV-C之間的密切關(guān)系并未在寄主范圍方面反映出，因為與 MPV形成對比，APV感染鳥類van den Hoogen等，2001)。這種寄主范圍的差異可能是由于 兩種病毒的SH蛋白和G蛋白之間高度趨異的差異所決定。MPV的SH蛋白和G蛋白沒有顯 示出與任何其它病毒的SH蛋白和G蛋白有顯著的氨基酸序列同源性。雖然氨基酸含量和疏 水性曲線圖支持將這些ORF確定為SH和G，但需要實驗數(shù)據(jù)來評價其功能。這類分析也將 為這些SH基因和G基因中所述額外的重疊ORF的作用提供線索。另外，對APV-C的SH和G基因的序列分析可能使得可以更深入了解MPV的SH蛋白和G蛋白的功能以及它們與APV-C 的所述蛋白之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)MPV的非編碼區(qū)與APV的非編碼區(qū)相當(dāng)相似。APV和MPV的 3’前導(dǎo)序列和5’尾隨序列顯示出高度同源性。雖然APV和MPV的基因間區(qū)的長度不總是 相同，但發(fā)現(xiàn)所述ORF中大多數(shù)的共有基因起始信號是相同的。相比之下，APV的基因終止 信號在MPV基因組中并未發(fā)現(xiàn)。雖然我們在大多數(shù)基因間區(qū)中的確發(fā)現(xiàn)一個重復(fù)序列(U AAAAA U/A/C)，但需要對病毒mRNA進行序列分析，以便正式描繪那些基因終止序列。應(yīng)該注 意到，通過采用改良的cDNA末端快速擴增(RACE)方法，獲得了有關(guān)3’最末端的15個核苷 酸和5’最末端的12個核苷酸的序列信息。這一技術(shù)已被其它人證明對于相關(guān)病毒是成功 的(Randhawa,J. S.等，Rescue of syntheticminireplicons establishes the absence of the NSl and NS2 genes from avianpneumovirus. J. Virol,71,9849-9854(1997) ；Mink, M. A.,等，Nucleotidesequences of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Virology 185，615—24 (1991))。為了 貝 Ij 定 3’ vRNA前導(dǎo)序列的序列，使用poly-A聚合酶將同源聚合物A尾加入到經(jīng)純化的vRNA上， 隨后用poly-T引物和N基因中的引物，通過PCR擴增所述前導(dǎo)序列。為了測定5’ vRNA尾 隨序列的序列，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和L基因中的引物，制備尾隨序列的cDNA拷貝，然后用末端轉(zhuǎn) 移酶，給所述cDNA加上同源聚合物dG尾。隨后，用poly-C引物和L基因中的引物擴增所 述尾隨序列區(qū)。作為一種替代策略，將vRNA自身相連接，或者與合成接頭連接，此后用L基 因和N基因中的引物和接頭特異性引物，擴增所述前導(dǎo)序列區(qū)和尾隨序列區(qū)。對于5’尾隨 序列，對純化vRNA進行直接雙脫氧核苷酸測序也是可行的(Randhawa，1997)。運用這些方 法，我們可以分析hMPV基因組末端的實際序列。在此提供的序列信息對于產(chǎn)生針對MPV和 MPV感染的診斷檢驗、疫苗和抗病毒藥具有重要性。材料和方法序列分析依照先前已描述的方法(van den Hoogen等，2001)，將病毒分離株00-1在第三代 猴腎細胞上繁殖到高滴度(約10，000TCID50/ml)。用HighPure RNA Isolating Kit (高純 度 RNA 分離試劑盒)，依照生產(chǎn)商的說明(Roch Diagnostics, Almere, The Netherlands)， 從受感染細胞的上清液分離病毒RNA。除已發(fā)表的有關(guān)APV/RSV的前導(dǎo)序列和尾隨序列的 序列(Randhawa等，1997 ；Mink等，1991)之外，基于先前已發(fā)表的序列(vanden Hoogen等， 2001)設(shè)計引物，所述引物可通過請求而得到。采用一種單管測定，在含有50mM Tris pH 8. 5、50mM NaCl、4. 5mM MgCl2,2mM DTT、1 μ M 正向引物、1 μ M 反向引物、0. 6mM dNTP、20 單 itL RNAsin (Promega, Leiden, The Netherlands) UOU AMV ^BI (Promega, Leiden, The Netherlands)禾口5單位Taq聚合酶(PE AppIiedBiosystems,Nieuwerkerk aan de IJssel, The Netherlands)的50 μ 1總體積中，用病毒RNA進行RT-PCR測定。逆轉(zhuǎn)錄于42°C進行30 分鐘，然后于95°C滅活8分鐘。如下擴增所述cDNA :95°C 1分鐘、42°C 2分鐘、72°C 3分鐘進 行40個循環(huán)，最后于72°C進行10分鐘的延伸。在瓊脂糖凝膠上檢查之后，用Qiaquick Gel Extraction Kit (凝膠提取試劑盒)(Qiagen，Leusden, The Netherlands)，從凝膠中 ^tit RT-PCR/fe^jMipffl Dyenamic ET terminator sequencing kit(Dyenamic ET 序試齊Ll盒)(Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands)禾口 ABI 373 自 動 DNA 測序儀(ΡΕ Applied Biosystem, Nieuwerkerk aan de IJssel, theNetherlands),依照生產(chǎn)商的說明直接測序。用 在 BioEdit version 5.0.6 (http//jwbrown. mbio. ncsu. edu/Bioedit// bioedit. html ；Hall, 1999)的軟件包中可得到clustal軟件包，進行序列比對。系統(tǒng)發(fā)育分析為了構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，用ClustalW軟件包進行DNA序列的比對，并且用使用 100個引導(dǎo)程序和3個jumble的Phylip 3. 5程序的DNA-ML軟件包，生成最大似然進化樹。 計算用consense軟件包(Felsenstein，1989)創(chuàng)建的共有序列進化樹的引導(dǎo)程序值。MPV基因組序列可從Genbank獲得，登記號為AF371337。此中所用的所有其 它序列可從Genbank獲得，登記號為:AB046218 (麻疹病毒，所有0RF)、NC_001796(人副 流感病毒3型，所有0RF)、NC-001552(仙臺病毒，所有0RF)、X57559 (人副流感病毒2 型，所有 0RF)、NC-002617(新城疫病毒，所有 0RF)、NC-002728 (Nipah 病毒，所有 0RF)、 NC-OO1989 (bRSV,所有 0RF)、M11486 (hRSV Α,除 L 外的所有 0RF)、NC_001803 (hRSV, L 0RF)、 NC-OO1781 (hRSV B,所有 0RF)、D10331 (PVM, N 0RF)、U09649 (PVM, P 0RF)、U66893 (PVM, M 0RF)、U66893 (PVM，SH 0RF)、D11130 (PVM, G 0RF)、Dl 1128 (FORF)。PVM M2 ORF 取自 Ahmadian(1999)、AF176590(APV-C, N0RF)、U39295(APV-A, N 0RF)、U39296(APV-B,N 0RF)、 AF262571 (APV-C, M 0RF)、U37586(APV-B, M 0RF)、X58639(APV-A, M0RF)、AF176591(APV-C, P 0RF)、AF325443 (APV-B, P 0RF)、U22110 (APV-A, P 0RF)、AF187152 (APV-C, F 0RF)、 Y14292 (APV-B, F0RF)、D00850 (APV-A, F 0RF)、AF176592 (APV-C, M20RF)、AF35650 (APV-B, M2 0RF)、X63408(APV-A, M20RF)、U65312(APV-A, L0RF)、S40185(APV-A, SH 0RF)。表5 =MPV和其它副粘病毒的所述ORF的長度。 腳注1.氨基酸殘基的長度。2.不能得到序列3.其它人副流感病毒2和3型、仙臺病 病毒(phocine distemper virus)禾口新城疫病毒。4. ORF在病毒基因組中不存在表6 =MPV的ORF和其它副粘病毒的ORF之間的氨基酸序列同
、麻疫病毒、nipah病毒、phocine瘟熱
.性 1.用已知的G和SH蛋白沒有發(fā)現(xiàn)序列同源性，因此被排除。2.不能得到序列。3.參見表5中一覽表的腳注3。4. ORF在病毒基因組中不存在。參考文獻Current Protocols in Molecular Biology,volume 1—3(1994—1998)。Ausubel， F. M. ，Brent, R. ，Kinston, R. Ε. ，Moore, D. D. ，Seidman, J. G. ，Smith, J. Α.禾卩 Struhl, K.編 著，John Wiley and sons, Inc. , USA 出版。Current Protocols in Immunology, volume 1-3. Coligan, J. Ε. , Kruisbeek, A.M. , Margulies, D. H. , Shevach, Ε. M.禾口 Strobe, W.編著，John Wiley and sons, Inc., USA出版。Sambrook 等，Molecular cloning, a laboratory manual, second ed.，vol. 1-3. (Cold Spring Harbor Laboratory,1989)0Fields, Virology. 1996. Vol. l_23rd. Edition, Fields, B. N.，Knipe, D. Μ.和 Howley, P. Μ.編著，Lippincott-Raven, Philadelpia, USA。1. Pringle, C. R. Virus taxonomy at the Xith international congress ofvirology, Sydney, Australia 1999. Arch. Virol. 144/2, 2065-2070 (1999)。2. Domachowske, J. B.禾口 Rosenberg, H. F. Respiratory syncytial virusinfection immune response, immunopathogenesis, and treatment (呼吸道合胞病 毒感染免疫應(yīng)答、免疫發(fā)病機理和治療)· Clin. Microbio. Rev. 12 (2)，298-309 (1999)。綜 述。3. Giraud, P. , Bennejean, G. , Guittet, M.禾口 Toquin, D. Turkeyrhinotracheitis in France preliminary investigations on a ciliostatic virus (法國的火雞鼻氣管 炎對 ciliostatic 病毒的初步研究).Vet. Rec. 119，606-607 (1986)。4. Ling7R. ，Easton，A. J.禾口Pringle，C. R. Sequence analysis of the22K，SH and G genes of turkey rhinotracheitis virus and their intergenicregions reveals a gene order different from that of other pneumoviruses (火雞鼻氣管炎病毒的 22K、 SH和G基因及其基因間區(qū)的序列分析揭示出一種不同于其它肺病毒的基因順序).J. Gen.
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病毒引物 位于蛋
HPIV-Ifwd5，-TGTTGTCGAGACTATTCCAA-3‘HN
Rev5，-TGTTG(T/A)ACCAGTTGCAGT6T-3，
HPIV-2Fwd5，-TGCTGCTTCTATTGAGAAACGCC-3’N
Rev5，-GGTGAC/T TC(T/C)AATAGGGCCA-3，
HPIV-3Fwd5，-CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3’HN
Rev5，-CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3’
HPIV-4Fwd5，-TTC (A/G)GTTTTAGCTGCTTACG-3，N
Rev5，-AGGCAAATCTCTGGATAATGC-3’
腮腺炎Fwd5，-TCGTAACGTCTCGTGACC-3’SH
Rev5，-GGAGATCTTTCTAGAGTGAG-3’
NDVFwd5，-CCTTGGTGAiTCTATCCGIAG-3’F
Rev5，-CTGCCACTGCTAGTTGiGATAATCC-3’
TupaiaFwd5，-GGGCTTCTAAGCGACCCAGATCTTG-3’N
Rev5，-GAATTTCCTTATGGACAAGCTCTGTGC-3，
MapueraFwd5，-GGAGCAGGAACTCCAAGACCTGGAG-3’N
Rev:5，-GCTCAACCTCATCACATACTAACCC-3’
HendraFwd5，-GAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAG-3，N
Rev5，-GCCTTTGCAATCAGGATCCAAATTTGGG-3，
NipahFwd5，-CTGCTGCAGTTCAGGAAACATCAG-8’N
Rev5，-ACCGGATGTGCTCACAGAACTG-3’
HRSVFwd5，-TTTGTTATAGGCATATCATTG-3’F
Rev5，-TTAACCAGCAAAGTGTTA-3’
麻疹Fwd5，-TTAGGGCAAGAGATGGTAAGG-3’N
Rev5，-TTATAACAATGATGGAGGG-3’
一般副粘病毒科
正向5'-CATTAAAAAGGGCAGAGACGC-3‘P
反向5'-TGGACATTCTCCGCAGT-3‘
用于RAP-PCR的引物
ZFl 5'--CCCACCACCAGAGAGAAA-3‘
ZF4 5'--ACCACCAGAGAGAAACCC-3 ’
ZF7 5'--ACCAGAGAGAAACCCACC-3 ’
ZFlO :5，-AGAGAGAAACCCACCACC-3’
ZF13 :5，-GAGAAACCCACCACCAGA-3’
ZF16 :5，-AAACCCACCACCAGAGAG-3’
CSl 5'--GGAGGCAAGCGAACGCAA-3’
CS4 :5，--GGCAAGCGAACGCAAGGA-3’
CS7 5'--AAGCGAACGCAAGGAGGC-3’
CSlO :5，-CGAACGCAAGGAGGCAAG-3，
CS13 :5’ -ACGCAAGGAGGCAAGCGA-3‘CS16 :5，-CAAGGAGGCAAGCGAACG-8‘
對20種片段進行成功地純化和測序 在APV中發(fā)現(xiàn)的有序列同源性的10種片段
片段1 片段2 片段3 片段4 片段5 片段6 片段7 片段8 片段9 片段10
ZF 7，335bp ZF 10,235bp ZF 10,800bp CS 1，1250bp CS 10,400bp CS 13，1450bp CS 13,750bp ZF 4，780bp ZF 10,330bp
N基因 N基因 M基因 F基因 F基因 F基因 F基因
L基因(蛋白質(zhì)水平) L基因(蛋白質(zhì)水平) L基因(蛋白質(zhì)水平)
ZF 10,250bp 用于從原型分離株RAP-PCR擴增核酸的引物。 實施例5
對所沭兩種亞型的hMPV的講一步探察
根據(jù)對迄今獲得的hMPV的不同分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定了兩種基因型，病毒 分離株00-1是基因型A的原型，而分離株99-1是基因型B的原型。我們假定，所述基因型與亞型相關(guān)，并且在有先有免疫的情況下發(fā)生被得自兩個 亞組的病毒再感染，并且對于允許再感染而言可能并不嚴格需要抗原性變異。此外，看來hMPV與一種主要見于家禽的禽肺病毒密切相關(guān)。這兩種病毒的核苷酸 序列顯示有高百分率的同源性，但SH蛋白和G蛋白除外。在此我們表明，所述病毒在主要基 于核蛋白和基質(zhì)蛋白的試驗中交叉反應(yīng)，但它們在基于吸附蛋白的試驗中反應(yīng)不同。病毒 中和滴度的差異進一步提供了 hMPV的兩種基因型是一種病毒的兩種不同的血清型、而APV 是一種不同的病毒的證據(jù)。所述兩種血清型之間的交叉反應(yīng)和APV與hMPV之間的交叉反應(yīng)^fe用于IgG、IgA和IgM抗體檢測hMPV的方案基本上依照先前已描述的方法(Rothbarth，P.H.等，1999 ;Influenzavirus serology-a comparative study. J. of Vir. Methods 78 (1999) 163-169)，在微量滴定板中 進行對hMPV的間接IgG EIA。簡而言之，通過用TritonX-100處理使?jié)饪shMPV溶解，在通過棋盤滴定 (checkerboard titration)測定最適工作稀釋度之后，將其在PBS中于室溫包被到微量滴 定板中達16小時。隨后，向各孔中加入100 μ 1體積的在EIA緩沖液中以1 100稀釋的 人血清樣品，于37°C孵育1小時。通過加入山羊抗人IgG過氧化物酶綴合物(Biosource， USA)，檢測人IgG的結(jié)合。加入TMB作為底物，使板顯色，測量450nm的0D。結(jié)果以O(shè)D的 S(即信號)/N(即陰性)之比來表示。如果S/N比超出陰性對照加上三倍標準之外，則認為 血清為IgG陽性。
通過基本上如先前已描述的捕獲EIA(Rothbarth，P.H等，1999;Influenza virus serolgy-a comparative study. J. Vir. methods 78 (1999) 163—169),檢測血i青中 IgM禾口 IgA 類別的hMPV抗體。為了檢測IgA和IgM，使用以抗人IgM或IgA特異性單克隆抗體包被的 市售微量滴定板。在于37°C孵育1小時之后，將血清以1 100稀釋，在各孔中加入hMPV 的最適工作稀釋液(100 μ 1)。于37°C孵育1小時。洗滌后，加入用過氧化物酶標記的多克 隆抗hMPV，將板于37°C孵育1小時。加入TMB作為底物使板顯色，測量450nm的0D，結(jié)果以 OD的S(即信號)/N(即陰性)之比來表示。如果S/N比超出陰性對照加上三倍標準之外， 則認為血清為IgG陽性。用APV抑制測定來檢測APV抗體。用于APV抑制試驗的方案包括 APV-Ab S VANO VIR 酶免疫測定，它由 SVANOVA Biotech AB (Uppsal Science Park Glunten SE-75183 Uppsala Sweden)生產(chǎn)。結(jié)果以O(shè)D的S(即信號)/N(即陰性)之比來 表示。如果S/N比超出陰性對照加上三倍標準之外，則認為血清為IgG陽性。1.豚鼠A.用兩種hMPV亞型(再)感染豚鼠已經(jīng)用病毒分離株ned/00/01 (亞型A)和ned/99/Ol (亞型B)接種了每種亞型6 只豚鼠(guinea pig)(氣管內(nèi)、鼻和眼)。6GP 用 hMPV 00-1 (10e6, 5TCID50)感染6GP 用 hMPV 99-1 (10e4,1TCID50)感染初次感染后54天，給所述豚鼠接種同種亞型和異種亞型(10e4TCID50/ml)2只豚鼠第一次感染00-1 ；第二次感染99-1 (異種)3只豚鼠第一次感染00-1 ；第二次感染00-1 (同種)2只豚鼠第一次感染99-1 ；第二次感染00-1 (異種)3只豚鼠第一次感染99-1 ；第二次感染99-1 (同種)在感染后采集了 12天(第一次感染)或8天(第二次感染)的喉和鼻拭抹物，并 且通過RT-PCR測定，檢驗了所述病毒的存在情況。RT-PCR測定的結(jié)果圖29結(jié)果總結(jié)用病毒分離株ned/00/01接種的豚鼠，在感染后第1_10天表現(xiàn)出上呼 吸道感染。用病毒分離株ned/99/Ol接種的豚鼠，在感染后第1_5天表現(xiàn)出上呼吸道感染。 看來被ned/99/Ol感染的嚴重程度低于被ned/00/01感染。用異種病毒第二次接種所述豚 鼠，在4只豚鼠的3只中弓丨起再感染，而用同種病毒第二次接種，在6只豚鼠的2只中引起 再感染。注意到在再感染的那些動物中沒有臨床癥狀或臨床癥狀很少，在受保護抵抗所述 再感染的那些動物中沒有觀察到臨床癥狀，證明甚至用野生型病毒，第一次感染的保護效 應(yīng)也是明顯的，表明有可能用異種(當(dāng)然還有同種)分離株作為疫苗，甚至有可能有未減毒 形式的分離株。hMPV的兩種亞型都能夠感染豚鼠，雖然似乎被B亞型(ned/99/Ol)感染的嚴重程 度低于(病毒在鼻和喉中的存在時間短)被A亞型(ned/00/01)感染。這可能是由于A亞 型給予的劑量較高，或者B亞型的毒力較低。雖然先有免疫的存在并不完全保護而抵抗同種病毒以及異種病毒的再感染，所述 感染看來不太顯著，因為注意到病毒存在的時間較短，并且并非所有動物都變?yōu)椴《娟栃浴?br> B.被兩種hMPV亞型感染的豚鼠的血清學(xué)第0、52、70、80、90、110、126和160天，從豚鼠采集血清，以1 100的稀釋液，用 針對ned/00/01和ned/99/Ol抗原的全病毒ELISA來測試。圖30A和B 每只豚鼠針對ned/0/01和ned/9/Ol的IgG應(yīng)答Mil :ned/00/01和ned/99/OlELISA的特異性。僅使用了得自同種再感染豚鼠的數(shù)據(jù)。圖 32 3 只同種(00-1/00-1)、2 只同種(99-1/99-1)、2 只異種(99-1/00-1)和 2 只異種(00-1/99-1)感染豚鼠的針對ned/00/01和ned/99/01ELISA的平均IgG應(yīng)答。結(jié)果總結(jié)在對所述兩種不同ELISA的應(yīng)答方面，僅觀察到較小的差異。針對00_1或99_1 的全病毒ELISA不能用來辨別所述兩種亞型。C.豚鼠體內(nèi)針對hMPV產(chǎn)牛的血清與APV杭原的/i應(yīng)十牛已經(jīng)用APV抑制ELISA，測試了從所述受感染豚鼠采集的血清。M33 :hMPV感染豚鼠的平均APV抑制百分率。結(jié)果總結(jié)豚鼠針對hMPV產(chǎn)生的血清在APV抑制試驗中反應(yīng)的方式與它們在hMPV IgG ELISA中反應(yīng)的方式相同。針對ned/99/Ol產(chǎn)生的血清顯示出在APV抑制ELISA中的抑制百分率低于針對 ned/00/01產(chǎn)生的血清。被ned/99/Ol感染的豚鼠的效價可能較低(正如在hMPV ELISA中 所見的)，或者ned/99/Ol與APV的交叉反應(yīng)低于ned/00/01的所述交叉反應(yīng)。然而，可以 用APV-Ab抑制ELISA來檢測豚鼠的hMPV抗體。P.用豚鼠的針對hMPV產(chǎn)生的血清進行的病毒中和測定。在采用ned/00/01、ned/99/01和APV-C的病毒(交叉)中和測定中，使用于第0 天、感染后第52、70和80天采集的血清。起始稀釋度為1-10，每孔用100TCID50病毒。中 和后，病毒附著在tMK細胞上，以3500RPM離心15分鐘，然后更換培養(yǎng)基。APV試驗是生長4天，而hMPV試驗是生長7天。用80%丙酮固定細胞，用以FITC 標記的猴抗hMPV進行IFA。染色為陰性的孔被認為是中和效價。對于每種病毒，包括病毒 原液的ΙΟ-log連續(xù)稀釋液(titration)和工作溶液的2倍連續(xù)稀釋液(titration)。圖 34 :ned/00/01 和 ned/99/Ol 感染豚鼠的針對 ned/00/01、ned/99/01 和 APV-C 的病毒中和效價2. f亙 可猴Α.用兩種hMPV亞型(再)感染恒河猴用病毒分離株ned/00/01 (亞型A)和ned/99/Ol (亞型B) (le5TCID50)每種亞 型接種2只恒河猴(氣管內(nèi)、鼻和眼)。第一次感染后6個月，給所述恒河猴第二次接種 ned/00/01。在感染后，采集了 14天(第一次感染)或8天(第二次感染)的喉擦拭，并且 通過RT-PCR測定檢驗了所述病毒的存在情況。M35 對接種了 ned/00/01 (兩次)的恒河猴的喉拭抹物的RT-PCR測定結(jié)果。結(jié)果總結(jié)接種了病毒分離株ned/00/01的恒河猴在感染后第1_10天表現(xiàn)出上呼吸道感染。臨床癥狀包括化膿性鼻炎。給所述恒河猴第二次接種同種病毒，通過PCR證實引起了再感 染，然而沒有觀察到臨床癥狀。B.對從hMPV感染的恒河猴采集的血清講行的血清學(xué)。從接受ned/00/01的恒河猴中，在第一次感染后6個月期間采集血清(再感染對 于猴3而言發(fā)生在第240天，而對于猴6發(fā)生在第239天)。用血清檢驗針對或者ned/00/01或者APV的IgG抗體存在的情況，以及針對 ned/00/01的IgA和IgM抗體存在的情況。結(jié)果圖36A2只用ned/00/01 (再)感染的恒河猴的針對ned/00/01的IgA、IgM和IgG應(yīng)答。圖 36B2只用ned/00/01感染的恒河猴的針對APV的IgG應(yīng)答。結(jié)果總結(jié)已經(jīng)用ned/00/01成功地感染了 2只恒河猴，并且在有抗ned/00/01抗體的情況 下，用同種病毒進行了再感染。IgA和IgM抗體的應(yīng)答顯示出在第一次感染之后IgM抗體升 高，而在再感染之后無IgM抗體升高。IgA抗體僅在再感染之后可檢測到，表明在第一次感 染后免疫應(yīng)答的直接性。恒河猴的針對hMPV所產(chǎn)生的血清在APV抑制ELISA中測試時表 現(xiàn)出的應(yīng)答與hMPV IgG ELISA相似。試論/結(jié)論用APV抑制ELISA檢測恒河猴的hMPV抗體的靈敏度與使用hMPV ELISA的靈敏度 相似，因此，APV抑制ELISA適合于檢驗人樣品中hMPV抗體的存在。C.使用從hMPV感染的恒河猴采集的血清的病毒(交叉)中和測定結(jié)果總結(jié)從第0天至的第一次感染后第229天采集的血清，僅表現(xiàn)出針對 ned/00/01的低病毒中和效價(0_80)，在第二次感染后采集的血清表現(xiàn)出針對ned/00/01 的高中和效價> 1280。僅在第二次感染后采集的血清表現(xiàn)出針對ned/99/Ol的中和效價 (80-640)，沒有一種血清中和APV C病毒。在病毒(交叉)中和測定中，APV-C和hMPV之間沒有交叉反應(yīng)；而在一次加強所 述抗體應(yīng)答后，在ned/00/01和ned/99/Ol之間有交叉反應(yīng)。3.人類年齡小于6個月至大于20歲的患者的血清，先前已經(jīng)在IFA測定和病毒中和測定 中針對ned/00/01進行了測試(參見專利的表1)。在此，我們已經(jīng)用針對ned/00/01的ELISA檢驗了這些血清中的許多血清的IgG、 IgM和IgA抗體的存在，并且我們用APV抑制ELISA檢驗了所述樣品。結(jié)果應(yīng)用hMPV ELISA和APV抑制ELISA檢測人血清中IgG抗體的比較，在 所述IgG hMPV試驗和所述APV-Ab試驗之間有強相關(guān)性，因此所述APV-Ab試驗基本上能夠 檢測人中抗hMPV的IgG抗體。4.家禽用APV抑制ELISA以及所述ned/00/01ELISA，對96只雞檢驗了針對APV的IgG抗 體的存在情況。結(jié)果總結(jié):hMPV ELISA和APV抑制ELISA都檢測到針對APV的抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)果總結(jié)我們發(fā)現(xiàn)了 hMPV的兩個基因型，ned/00/01是A亞組的原型，而ned/99/Ol是B亞 組的原型?！耙勒战?jīng)典血清學(xué)分析(例如已知的 Francki, R. I. B.，F(xiàn)auquet, C. M.，Knudson, D. L.禾口 Brown, F. , Classification and nomenclature ofviruses. Fifth report of the international Committee on Taxonomy ofViruses. Arch Virol,1991. Supplement 2 :p. 140-144)，根據(jù)通過用動物抗血清進行定量中和測定而確定的免疫學(xué)區(qū) 別(distinctiveness)，可以確定兩個亞型。兩個不同的血清型或者相互沒有交叉反應(yīng)，或 者表現(xiàn)出兩個方向的同種與異種效價之比>16。如果中和表明兩種病毒之間在任一個方向 或兩個方向有一定程度的交叉反應(yīng)(同種與異種效價之比為8或16)，則如果存在DNA的顯 著生物物理/生物化學(xué)差異，則推定有血清學(xué)區(qū)別(distinctiveness)。如果中和表示兩種 病毒之間在任一方向或兩個方向有不同程度的交叉反應(yīng)(同種與異種效價之比小于8)，則 推定所研究的分離株的血清型相同?！睂τ赗SV，已知在先有免疫存在的情況下發(fā)生再感染(同種以及異種)。用同種血 清型和異種血清型的hMPV感染豚鼠和恒河猴表明，對于hMPV的情況也是如此。另外，針對 hMPV的IgA和IgM ELISA揭示，IgA抗體的反應(yīng)僅在再感染后發(fā)生。針對hMPV或APV產(chǎn)生 的血清在APV ELISA和hMPV ELISA中以同樣的方式反應(yīng)。根據(jù)核苷酸序列的比較，已知所 述病毒對于N、P、M和F基因顯示出約80%的氨基酸序列同源性。在ELISA中，N和M蛋白 是引起反應(yīng)的主要抗原。病毒中和測定(已知針對表面糖蛋白G、SH和F反應(yīng))表明在這 兩種不同血清之間有差異。雖然APV和hMPV在ELISA中交叉反應(yīng)，但對hMPV和APV的核 苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析、針對所述兩種不同病毒產(chǎn)生的血清的病毒中和效價的差異、以 及宿主用法的差異再次表明，APV-C和hMPV是兩種不同的病毒。根據(jù)所述結(jié)果，我們推測 哺乳動物中的hMPV感染可能是從鳥類至哺乳動物的動物傳染病事件的結(jié)果。但是，所述病 毒已經(jīng)以這樣一種方式(即G蛋白和SH蛋白)適應(yīng)了，使得考慮到在鳥類中存在APV，回復(fù) (從哺乳動物至鳥類)動物傳染病事件看來是可能的。附錄肺病毒的背景信息副粘病毒科(Paramyxoviridae)有兩個亞科副粘病毒亞科(Paramyxovirinae) 和肺病毒亞科(Pneumovirinae)。肺病毒亞科由兩個屬組成肺病毒屬(Pneumovirus)和 Metapneumovirus0肺病毒屬有人、牛、綿羊和山羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒(PVM)。 Metapneumovirus 有禽肺病毒(APV，也稱為 TRTV)。肺病毒亞科中屬的分類基于經(jīng)典的病毒特征、基因順序和基因構(gòu)象。肺病毒屬病 毒在副粘病毒科中是獨特的，因為在基因組3’端具有兩個非結(jié)構(gòu)蛋白(3' -NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5 ‘)。相比之下，Metapneumovirus的病毒缺乏NSl和NS2基因，并且M編 碼區(qū)和L編碼區(qū)之間的基因組構(gòu)不同3' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'。副粘病毒亞科的所有成員都有血細胞凝集活性，但這一功能不是肺病毒亞科的限定 性特征，在RSV和APV中無此功能，而在PMV中有此功能。在副粘病毒屬(Paramyxovirus)和 腮腺炎病毒屬(RubulavirusK副粘病毒亞科)的成員中有神經(jīng)氨酸酶活性，但在麻疹病毒屬 (Morbillivirus)(副粘病毒亞科)以及肺病毒屬和Metapneumovirus (肺病毒亞科)中無此活性。
肺病毒亞科的第二個鑒別性特征是RSV對mRNA內(nèi)可變ORF的表觀有限的利用。相 比之下，副粘病毒亞科的幾個成員，例如仙臺病毒和麻疹病毒，可利用mRNA中編碼磷蛋白 (P)的可變ORF來指導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成。肺病毒亞科的G蛋白與副粘病毒亞科的HN蛋白或H蛋白沒有序列相關(guān)性或結(jié)構(gòu) 相似性，僅為其鏈長的大約一半。另外，N蛋白和P蛋白都比副粘病毒亞科的其對應(yīng)物小，并 且缺乏明確的序列同源性。大多數(shù)非分段負鏈RNA病毒有一種基質(zhì)(M)蛋白。肺病毒亞科 的成員例外，因為它們有兩種這樣的蛋白-M和M2。M蛋白小于其副粘病毒亞科的對應(yīng)物， 并且與副粘病毒亞科沒有序列相關(guān)性。當(dāng)在細胞培養(yǎng)物中生長時，肺病毒亞科的成員表現(xiàn)出典型的細胞病變效應(yīng)；它們 誘導(dǎo)細胞特征性的合胞體形成(Collins，1996)。肺病毒亞科，肺病毒屬hRSV是肺病毒屬的代表種，并且是嬰兒和幼兒期間主要且分布廣的下呼吸道疾病 的病因(Selwyn，1990)。另外，hRSV越來越被認為是其它患者群、包括無免疫應(yīng)答個體和老 年人中的重要病原體。RSV也是所有年齡住院成人中社區(qū)獲得性肺炎的重要病因(Englimd， 1991 ；Falsey,2000 ；Dowel 1,1996) 0已經(jīng)根據(jù)與單克隆抗體和多克隆抗體的反應(yīng)性以及核 酸序列分析，鑒定了 RSV的兩個主要抗原性類型(A和B) (Anderson, 1985 Johnson, 1987 ； Sullender，2000)。具體地說，用G蛋白區(qū)別所述兩個亞型。RSV-A和B在G中僅有53%的氨 基酸序列同源性，而其它蛋白在所述亞型之間顯示出較高的同源性(表1) (Collins, 1996)。已經(jīng)描述了在免疫熒光技術(shù)(DIF，IFA)、病毒中和測定和ELISA或RT-PCR測定中， 運用單克隆抗體和多克隆抗體檢測RSV感染(Rothbarth，1988 ；Van MiIaan, 1994 ；Coggins, 1998)。與hRSV密切相關(guān)的是牛RSV (bRSV)、綿羊RSV (oRSV)和山羊RSV (oRSV)，其中對bRSV 的研究最為廣泛?；谂chRSV的序列同源性，反芻動物RSV被分類在肺病毒亞科肺病毒屬 中(Collins，1996)。反芻動物RSV感染的診斷和分亞型基于血清學(xué)、抗原檢測、病毒分離和 RT-PCR 測定的聯(lián)合應(yīng)用(Uttenthal，1996 ；Valarcher, 1999 ；Oberst, 1993 ；Vilcek, 1994)。已經(jīng)用人抗血清和?？寡?、單克隆抗體和cDNA探針，進行了對bRSV分子組構(gòu)的 幾種分析。這些分析揭示，hRSV和bRSV的蛋白質(zhì)組成非常相似，bRSV的基因組組構(gòu)類似 hRSV的基因組組構(gòu)。對于bRSV和hRSV兩者而言，G蛋白和F蛋白代表主要的中和保護性 抗原。G蛋白在hRSV亞型之間以及在hRSV和bRSV之間高度可變(分別為53%和28%) (Prozzi, 1997 ；Lerch, 1990)。hRSV和bRSV毒株的F蛋白存在相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)特征和抗原相關(guān) 性。bRSV的F蛋白顯示出與hRSV有80-81 %的同源性，而兩個hRSV亞型在F中有90%的 同源性(Walravens, K. 1990)?；趹?yīng)用hTSV和bRSV特異性單克隆抗體的研究已經(jīng)提示存在不同的bRSV抗原亞型。 Α、β和AB亞型根據(jù)對G蛋白特異性的單克隆抗體的反應(yīng)模式來辨別(Furze, 1994 ；Prozzi, 1997 ； Elvander，1998)。bRSV的流行病學(xué)與hRSV的流行病學(xué)非常相似。在小牛中的自發(fā)感染通常與重 癥呼吸道體征相關(guān)，而實驗性感染一般導(dǎo)致輕度疾病，有輕微的病理學(xué)改變(Elvander, 1996)。也已經(jīng)從天然感染的綿羊(oRSV)(LeaMaster, 1983)和山羊(cRSV) (Lehmkuhl， 1980)中分離出RSV。這兩個毒株與牛RSV共享96%的核苷酸序列，并且在抗原上交叉反 應(yīng)。因此，這些病毒也被分類在肺病毒屬中。肺病毒亞科肺病毒屬的一個特殊成員是小鼠肺炎病毒(PVM)。
PVM在實驗動物群體中，特別是在包括無胸腺小鼠的那些實驗動物群體中是一種 常見的病原體。天然獲得性感染被認為是無癥狀的，通過病毒在小鼠肺部傳代，引起明顯的 疾病體征，從上呼吸道感染到致死性肺炎(Richter，1988 ；Weir，1988)。對于PVM和hRSV的核衣殼蛋白(N)和磷蛋白(P)之間有限的血清學(xué)交叉反應(yīng)性 已有描述，但外部蛋白中沒有一個顯示出交叉反應(yīng)性，并且所述病毒在病毒中和測定中可 以相互區(qū)別開(Chambers, 1990a ；Gimenez, 1984 ；Ling, 1989a)。就其糖基化模式而論，PVM 的糖蛋白看來不同于其它副粘病毒的糖蛋白，而類似RSV的糖蛋白。然而，它們在加工上不 同。與RSV不同，而與其它副粘病毒相似，PVM與鼠紅細胞有血細胞凝集活性，看來G蛋白 對此負責(zé)，因為針對該蛋白的單克隆抗體抑制血細胞凝集(Ling，1989b)。PVM的基因組類似hRSV的基因組，在其3，端包括兩個非結(jié)構(gòu)蛋白，并且有相似的 基因組組構(gòu)(Chambers，1990a ；Chambers, 1990b)。PVMNS1/NS2 基因的核苷酸序列與 hRSV 的 所述基因的核苷酸序列沒有可檢測的同源性(Chambers，1991)。PVM的某些蛋白顯示出與 hRSV有強同源性(N:60%，F(xiàn):38-40%)，而G明顯不同(氨基酸序列長31 % ) (Barr，1991 ； Barr，1994 ;Chambers，1992)。據(jù)報道，PVM P基因，而不是RSV或APV的P基因，編碼一個 第二 0RF，代表一種特有的PVM蛋白(Collins，1996)。新的PVM分離株通過病毒分離、血細 胞凝集測定、病毒中和測定和各種免疫熒光技術(shù)來鑒定。附錄的表肺病毒亞科肺病毒屬內(nèi)不同病毒之間的氨基酸同源性。 *無可檢測的序列同源性Metapneumovirus禽肺病毒(APV)已被鑒定是火雞鼻氣管炎的病原(MCDougall，1986 ;CollinS， 1988)，因此通常被稱為火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)。所述疾病是火雞的一種上呼吸道感染， 導(dǎo)致高發(fā)病率和可變但常常高的死亡率。在母火雞中，所述病毒也可以誘導(dǎo)產(chǎn)蛋量顯著下 降。所述病毒也可以感染雞，但在這一物種中，該病毒作為主要病原體的作用的確不是太清 楚，雖然它通常與種雞中的腫頭綜合征(swollen head syndrome) (SHS)相關(guān)(Cook，2000)。 所述病毒體是多態(tài)的，雖然主要為球形，大小為70-600nm，并且含有線性非分段負義RNA基 因組的核衣殼顯示出螺旋對稱(Collins，1986 ；Giraud，1986)。這種形態(tài)類似副粘病毒科 的成員。對APV編碼的蛋白和RNA的分析提示，在該科的兩個亞科(副粘病毒亞科和肺病 毒亞科)中，APV 最密切類似肺病毒亞科(Collins, 1988 ；Ling, 1988 ；Cavanagh, 1988)。APV 沒有非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl 和 NS2)，并且基因順序(3 ‘ -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5 ‘) 不同于哺乳動物肺病毒例如RSV的基因順序。因此，APV最近被分類為新的屬 Metapneumovirus的代表種(Pringle，1999)。中和模式、ELISA和與單克隆抗體的反應(yīng)性 的差異已經(jīng)揭示存在不同的APV抗原類型。G基因的核苷酸測序使得確定了兩個病毒亞型 (A和B)，它們僅有38%的氨基酸同源性(Collins, 1993 Juhasz, 1994)。從美國科羅拉多 分離的一種APV(Cook，1999)表明出與A和B亞型病毒的交叉中和差，并且根據(jù)序列信息， 被指定為一個新亞型_C(Seal，1998 ;Seal 2000)。在法國分離出兩種非A/非B APV，表明 它們在抗原性上不同于A、B和C亞型。根據(jù)F、L和G基因的氨基酸序列，這些病毒又被分 類為一個新的亞型-D (Bayon-Auboyer，2000)。通過在雞或火雞氣管器官培養(yǎng)物(TOC)或在Vero細胞培養(yǎng)物中分離病毒，可以達 到診斷APV感染。一般在一次或兩次另外的傳代之后，觀察到細胞病變效應(yīng)(CPE)。這種 CPE的特征為導(dǎo)致合胞體形成的分散的局限性細胞rounding區(qū)(Buys，1989)。已經(jīng)開發(fā)了 多種血清學(xué)測定，包括IF和病毒中和測定。通過ELISA檢測針對APV的抗體，是最常用的方 法(0' Loan, 1989 ；Gulati，2000)。最近，已經(jīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)來診斷APV感染。 可以用取自食管的拭抹物作為起始材料(Bayon-Auboyer，1999 ；Shin, 2000) 0Alansari, H 禾口 Potgieter, L. N. D. 1994. Nucleotide and predictedamino acid sequence analysis of the ovine respiratory syncytial virus non-structural IC and IB genes and the small hydrophobic protein gene (羊呼吸道合胞病毒非結(jié)構(gòu) IC禾口 IB基因以及小疏水性蛋白基因的核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列分析).J. Gen. Virol. 75 401-404.Alansari, H. , Duncan R. B. , Baker, J. C 禾口 Potgieter, L. N. 1999. Analysis of ruminant respiratory syncytial virus isolates by RNAseprotection of the G lycoprotein transcripts (通過G糖蛋白轉(zhuǎn)錄物的RNA酶保護分析反芻動物呼吸道合胞病 毒分離株)· J. Vet. Diagn. Invest. 11 :215_20Anderson, L. J, Hierholzer, J. C. , Tsou, C. , Hendry, R. Μ. , Fernic, B. F. , Stone, Y 禾口 Mcintosh, K. 1985. Antigenic characterisation of respiratorysyncytial virus strains with monoclonal antibodies (用單克隆抗體對呼吸道合胞病毒毒株進行抗原性 表征)· J. Inf. Dis. 151 :626_633.
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權(quán)利要求
一種分離的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒(MPV)，所述病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒亞科(Pneumovirinae)，并且可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus。
2.一種分離的負義單鏈RNA病毒(MPV)，所述病毒屬于副粘病毒科肺病毒亞科，并且通 過測定所述病毒的核酸序列并且在系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析中對其進行測試，其中采用100個 引導(dǎo)程序和3個jumble生成最大似然進化樹，并且發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育上與對應(yīng)于也稱為火雞 鼻氣管炎病毒(TRTV)即禽鼻氣管炎的病原的禽肺病毒(APV)的病毒分離株相比，它更密切 地對應(yīng)于以1-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分離株，所述病毒可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng) 于 Metapneumovirus。
3.—種權(quán)利要求2的病毒，其中所述禽肺病毒包括APV C型(APV-C)。
4.一種權(quán)利要求1-3的病毒，其中所述核酸序列包含編碼所述病毒的病毒蛋白的可讀 框(0RF)。
5.一種權(quán)利要求4的病毒，其中所述可讀框選自編碼N蛋白、P蛋白、M蛋白和F蛋白 的 0RF。
6.一種權(quán)利要求5的病毒，其中所述可讀框選自編碼SH蛋白或G蛋白的0RF。
7.—種權(quán)利要求1-6中任一項的病毒，所述病毒包含在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于圖6所示的 序列的核酸或功能片段。
8.—種權(quán)利要求1-7中任一項的病毒，所述病毒包括以1-2614保藏于巴黎巴斯德研究 所CNCM的MPV分離株或者與其在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)的病毒分離株。
9.一種可從患有呼吸道疾病的人中分離的權(quán)利要求8的病毒。
10.一種可得自權(quán)利要求1-9中任一項的病毒的分離或重組的核酸或其MPV特異性功 能片段。
11.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求10的核酸。
12.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求10的核酸或權(quán)利要求11的載體。
13.一種由權(quán)利要求10的核酸編碼的分離或重組的蛋白性分子或其MPV特異性功能片段。
14.一種抗原，所述抗原包含權(quán)利要求13的蛋白性分子或其MPV特異性功能片段。
15.一種抗體，所述抗體特異性地針對權(quán)利要求14的抗原。
16.一種鑒定病毒分離株為MPV的方法，所述方法包括使所述病毒分離株或其組分與 權(quán)利要求15的抗體反應(yīng)。
17.一種鑒定病毒分離株為MPV的方法，所述方法包括使所述病毒分離株或其組分與 權(quán)利要求10的核酸反應(yīng)。
18.一種權(quán)利要求16或17的方法，其中所述MPV包括人MPV。
19.一種病毒分離株，所述病毒分離株可用權(quán)利要求16-18中任一項的方法鑒定為副 粘病毒科肺病毒亞科的哺乳動物負義單鏈RNA病毒，并且可被鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于 Metapneumovirus。
20.一種用于病毒學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述哺乳動 物的樣品與權(quán)利要求10的核酸或權(quán)利要求15的抗體反應(yīng)，測定所述樣品中病毒分離株或 其組分的存在情況。
21.一種用于血清學(xué)診斷哺乳動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述哺乳動 物的樣品與權(quán)利要求13的蛋白性分子或其片段或者權(quán)利要求14的抗原反應(yīng)，測定所述樣 品中特異性針對MPV或其組分的抗體的存在情況。
22.一種用于診斷MPV感染的診斷試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-9中任一項的病 毒、權(quán)利要求10的核酸、權(quán)利要求13的蛋白性分子或其片段、權(quán)利要求14的抗原和/或權(quán) 利要求15的抗體。
23.權(quán)利要求1-9中任一項的病毒、權(quán)利要求10的核酸、權(quán)利要求11的載體、權(quán)利要求 12的宿主細胞、權(quán)利要求13的蛋白性分子或其片段、權(quán)利要求14的抗原或權(quán)利要求15的 抗體在藥用組合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
24.在用于治療或預(yù)防MPV感染的藥用組合物生產(chǎn)方面的權(quán)利要求23的應(yīng)用。
25.在用于治療或預(yù)防呼吸道疾病的藥用組合物生產(chǎn)方面的權(quán)利要求23或24的應(yīng)用。
26.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權(quán)利要求1-9中任一項的病毒、權(quán)利要求10 的核酸、權(quán)利要求11的載體、權(quán)利要求12的宿主細胞、權(quán)利要求13的蛋白性分子或其片 段、權(quán)利要求14的抗原或權(quán)利要求15的抗體。
27.一種治療或預(yù)防MPV感染的方法，所述方法包括給個體提供權(quán)利要求26的藥用組 合物。
28.一種治療或預(yù)防呼吸道疾病的方法，所述方法包括給個體提供權(quán)利要求26的藥用 組合物。
29.一種權(quán)利要求27或28的方法，其中所述個體包括人類。
30.一種獲得可用于治療呼吸道疾病的抗病毒藥的方法，所述方法包括建立包含權(quán)利 要求1-9中任一項的病毒的細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游?，用候選抗病毒藥處理所述培養(yǎng)物或治 療所述動物，測定所述候選抗病毒藥對所述病毒或所述病毒對所述培養(yǎng)物或動物感染的影 響，并且選擇具有所需效應(yīng)的抗病毒藥。
31.一種可依照權(quán)利要求30的方法獲得的抗病毒藥。
32.權(quán)利要求31的抗病毒藥在藥用組合物制備中的應(yīng)用。
33.在用于治療呼吸道疾病的藥用組合物制備方面的權(quán)利要求33的應(yīng)用。
34.在用于治療MPV感染的藥用組合物制備方面的權(quán)利要求32或33的應(yīng)用。
35.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權(quán)利要求31的抗病毒藥。
36.一種治療或預(yù)防MPV感染的方法，所述方法包括給個體提供權(quán)利要求35的藥用組 合物。
37.一種治療或預(yù)防呼吸道疾病的方法，所述方法包括給個體提供權(quán)利要求35的藥用 組合物。
38.一種權(quán)利要求36或37的方法，其中所述個體包括人類。
39.一種用于病毒學(xué)診斷動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述動物的樣品 與同禽肺病毒(APV)的組分特異性反應(yīng)的核酸或抗體反應(yīng)，測定所述樣品中病毒分離株或 其組分的存在情況，其中所述核酸或抗體與MPV的組分交叉反應(yīng)。
40.一種用于血清學(xué)診斷動物MPV感染的方法，所述方法包括通過使所述動物的樣品 與來源于APV分離株或其組分的蛋白性分子或其片段或者抗原反應(yīng)，測定所述樣品中針對 MPV或其組分的抗體的存在情況，其中所選的所述分子、片段或者抗原與MPV的組分基本上同源。
41.一種用于病毒學(xué)診斷鳥類APV感染的方法，所述方法包括通過使所述鳥類的樣品 與權(quán)利要求10的核酸或權(quán)利要求15的抗體反應(yīng)，測定所述樣品中病毒分離株或其組分的 存在情況，其中所述核酸或抗體與APV的組分交叉反應(yīng)。
42.一種用于血清學(xué)診斷鳥類APV感染的方法，所述方法包括通過使所述鳥類的樣品 與權(quán)利要求13的蛋白性分子或其片段或者權(quán)利要求14的抗原反應(yīng)，測定所述樣品中特異 性針對APV或其組分的抗體的存在情況，其中所選的所述分子、片段或者抗原與APV的組分 基本上同源。
43.一種權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述APV包括APV-C。
44.設(shè)計用于檢測APV特異性抗體的診斷性試驗在檢測針對MPV的抗體中的應(yīng)用。
45.權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述試驗包括酶免疫測定(EIA)。
46.一種用于檢測樣品中針對MPV的抗體的方法，所述方法包括在設(shè)計用于檢測APV特 異性抗體的診斷性試驗中測試所述樣品。
47.一種權(quán)利要求46的方法，其中所述試驗包括酶免疫測定(EIA)。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種分離的副粘病毒科肺病毒亞科內(nèi)可鑒定為在系統(tǒng)發(fā)育上對應(yīng)于Metapneumovirus及其組分的基本上為哺乳動物的負義單鏈RNA病毒(MPV)。
文檔編號C12N15/09GK101921732SQ200910206209
公開日2010年12月22日 申請日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者A·D·M·E·奧斯特豪斯, B·G·范登霍根, J·C·德永, J·格羅恩, R·A·M·?；鶢?申請人:維洛諾瓦蒂夫公司