專利名稱：一株用于發(fā)酵的克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域，涉及一株用于發(fā)酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的發(fā)展，傳統(tǒng)利用生物質(zhì)能的比例將越來越少，而現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)系利用 微生物的代謝活動(dòng)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化大規(guī)模制造產(chǎn)品的一門工業(yè)。則這可以進(jìn)一步說明現(xiàn)代發(fā)酵 工業(yè)體系將在今后幾十年內(nèi)在以后能源體系的重要地位。現(xiàn)代發(fā)酵微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)微生物 是發(fā)酵工業(yè)的根本，優(yōu)良菌株是高效發(fā)酵結(jié)果的前提，生產(chǎn)過程中不斷強(qiáng)化菌種的性能是 保持技術(shù)經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)的必需。而現(xiàn)代發(fā)酵產(chǎn)酒精主要是工業(yè)是以純種菌種的培養(yǎng)為基礎(chǔ)，所 以采用各種不同的篩選手段來進(jìn)行菌種選育，進(jìn)一步選出產(chǎn)量高、符合生產(chǎn)的各種條件的 純種，這是發(fā)酵產(chǎn)酒精的關(guān)鍵一步。野生菌種很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu) 勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的 優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。由于克雷伯氏菌為自然界中篩選的野生菌種，是自然界長期演化的 結(jié)果，因而相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定，并且能夠適應(yīng)環(huán)境，一般采用克雷伯氏菌產(chǎn)氫，本發(fā)明采用了利用 克雷伯氏菌分別對(duì)葡萄糖、木糖、蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇，通過實(shí)驗(yàn)，得到了 一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定、高產(chǎn)的產(chǎn)乙醇菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種能夠高產(chǎn)酒精的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08，并提供 該菌種的分離純化方法及對(duì)葡萄糖降解產(chǎn)酸和對(duì)葡萄糖或蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵 產(chǎn)乙醇的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。一株用于發(fā)酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08，其保藏號(hào)為CCTCC M 209219。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的形態(tài)學(xué)特征如下菌落呈白色， 圓形，表面光滑、濕潤、隆起，邊緣整齊、粘液狀，菌落相互融合；細(xì)胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米，呈短鏈狀排列。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化特征如下在葡萄糖培養(yǎng)基 和LB培養(yǎng)基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵葡萄糖；在溴麝香草酚 藍(lán)培養(yǎng)基中，以檸檬酸鈉作為碳源，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，菌落成藍(lán)色，且產(chǎn)生吲哚。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應(yīng)用在于其能使葡萄糖降解產(chǎn)生酸 性物質(zhì)。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應(yīng)用在于其能對(duì)葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應(yīng)用在于其能對(duì)蒸汽爆破材料酶解 液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A_08的應(yīng)用在于其能分別與釀酒酵母CICC 編號(hào)1517、大腸埃希氏菌CICC編號(hào)10308混合對(duì)蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。將菌培養(yǎng)12小時(shí)，用試劑盒抽提總DNA，凝膠電泳，用純化試劑盒純化，再將純化 產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。由南京金思特生物公司測(cè)序結(jié)果及在GenBank 數(shù)據(jù)庫中的BLAST結(jié)果可知此菌為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp)，該菌株的登錄號(hào)為 AY363386,16sDNA 的序列為agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc
ggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctggga
aactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgca
agaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagct
agtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgacca
gccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattg
cacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgt
aaagtactttcagcgaggaggaaggcgttaaggttaataaccttggcgattgacgttact
cgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggtgcaagcg
ttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaat
ccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagcttgagtcttgtagaggggg
gtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaag
gcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatta
gataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgttcccttgaggagt
ggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaac
tcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaac
gcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgcctt
cgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggt
taagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactca
aaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccc
ttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgag
agcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccat
gaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggcct
tgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaacct
tcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaacc
gtaggggaacCtgCggCtggatcacctcctt
發(fā)明的效果或特點(diǎn)
由于克雷伯氏菌Klebsiella sp. A-08保藏號(hào)CCTCC M 209219，為自然界
選的野生菌種，是自然界長期演化的結(jié)果，因而相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定，并且能夠適應(yīng)環(huán)境，本發(fā)明利 用克雷伯氏菌在葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，分別對(duì)葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行 發(fā)酵產(chǎn)乙醇，以及與釀酒酵母、大腸埃希氏菌混合對(duì)蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙
4醇，足以證明克雷伯氏菌Klebsiella sp. A_08是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定、高產(chǎn)的產(chǎn)乙醇菌株。把 Klebsiella sp. A-08與其他菌如大腸埃希氏菌、釀酒酵母混合發(fā)酵可以更好提高乙醇的產(chǎn) 率，而且相較于其它策略(如代謝工程)更為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，有利于提高資源利用率和生物 乙醇的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，具有很好的應(yīng)用前景，與其他產(chǎn)乙醇菌相比，克雷伯氏菌為自然界中篩 選的野生菌種，更加能夠適應(yīng)環(huán)境，可以抵制酶解液中的各種不利因素的影響，若能經(jīng)過改 造，能夠更加提高利用率?？死撞暇鶮lebsiella sp. A-08保藏日期2009年10月9日保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC保藏號(hào)CCTCCNO :M 209219


圖1為克雷伯氏菌在顯微鏡下觀察的形狀；圖2為克雷伯氏菌落在顯微鏡下觀察的形狀；圖3為克雷伯氏菌生長pH曲線圖。
具體實(shí)施方案以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1克雷伯氏菌Klebsiella sp. A-08的分離篩選。1、菌種來源長沙污水處理廠的廢水中的污泥。2、培養(yǎng)基及初步篩選原理、方法克雷伯氏菌能利用檸檬酸鈉作為碳源，而大腸桿菌不能，克雷伯氏菌在分解檸檬 酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸氨后，產(chǎn)生堿性化合物使PH值升高，在有溴麝香草酚藍(lán)指示劑的 情況下，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，溴麝香草酚藍(lán)指示范圍為pH小于6時(shí)呈黃色，pH為 6. 0-7. 6時(shí)為綠色，pH大于7. 6時(shí)呈藍(lán)色。分別取20g污泥，稀釋后接種于LB培養(yǎng)基，1天 后，挑取菌落接種于溴麝香草酚藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)72h，每天觀察，培養(yǎng)基由綠色變 為藍(lán)色，挑取藍(lán)色菌落，稀釋，純化。將純化后的菌種用普通LB培養(yǎng)基保存，完成初步篩選。 再將培養(yǎng)24h的菌液2ml置于5ml離心管中，再加入Iml乙醚，充分振蕩，使吲哚溶于乙醚， 靜置片刻，乙醚層浮與菌液上層然后沿離心管壁加入10滴5%的對(duì)二甲基氨基甲醛溶液， 如果有吲哚產(chǎn)生，則乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色。(克雷伯氏菌屬于腸桿菌科，能夠氧化分解蛋白 胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚無色，可與對(duì)二甲基氨基甲醛結(jié)合，生成紅色的玫瑰吲哚。加 入對(duì)二甲基氨基甲醛后切勿搖動(dòng)，否則紅色不明顯)。根據(jù)以上原理和方法，對(duì)初步篩選的 88株菌進(jìn)行吲哚實(shí)驗(yàn)，結(jié)果有22株菌呈現(xiàn)玫瑰紅，然后用10 %的葡萄糖液體培養(yǎng)基對(duì)以上 22株菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，淘汰產(chǎn)乙醇含量極低的菌，篩出1株編號(hào)為A08的菌株。其發(fā)酵能力 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌株，將其選為發(fā)酵所需菌種。所述的溴麝香草酚藍(lán)培養(yǎng)基成分為NaCl25g、MgSO4 · 7H200. 2g、(NH4)H2PO4Ig,K2H2P04lg、檸檬酸鈉5g、瓊脂12g、蒸餾水1000ml、0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液40ml、肌醇、 pH6.8。121°C高壓滅菌20min。其中0. 2%溴麝香草酚藍(lán)溶液用過濾滅菌。所述的普通LB培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl25g、瓊脂粉10g、蒸餾 水1000ml,自然pH值。所述克雷伯氏菌株A-08的形態(tài)學(xué)特征總結(jié)如下菌落呈白色，圓形，表面光滑、濕 潤、隆起，邊緣整齊、粘液狀，菌落相互融合；細(xì)胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米， 呈短鏈狀排列。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化總結(jié)特征如下在葡萄糖培 養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵葡萄糖；在溴麝香 草酚藍(lán)培養(yǎng)基中，以檸檬酸鈉作為碳源，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，菌落成藍(lán)色，且產(chǎn)生吲哚。3、克雷伯氏菌A-08生長條件A:克雷伯氏菌A-08生長pH值(圖3)用pH 梯度為 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,8. 5,9. 0、10、11、12 的 LB 液體培養(yǎng)基對(duì)
克雷伯氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37°C，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)3d。選出最佳生長pH值為7. 0。B 克雷伯氏菌A-08生長pH值的變化將菌接入pH值在3-8之間的LB液體培養(yǎng)基中，菌的生長會(huì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)，致使pH 上升，在8-12之間會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，致使pH值減小，pH在8時(shí)，基本保持不變，見表1。表1克雷伯氏菌A-08在LB液體培養(yǎng)基不同pH值條件下生長時(shí)pH值的變化
權(quán)利要求
一株用于發(fā)酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A 08，其特征在于，所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A 08的保藏號(hào)為CCTCC M 209219。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08，其特征在于，所述克雷 伯氏菌株A08的形態(tài)學(xué)特征如下菌落呈白色，圓形，表面光滑、濕潤、隆起，邊緣整齊、粘液 狀，菌落相互融合；細(xì)胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米，呈短鏈狀排列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08，其特征在于，所述克雷 伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化特征如下在葡萄糖培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中均可 分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵葡萄糖；在溴麝香草酚藍(lán)培養(yǎng)基中，以檸檬 酸鈉作為碳源，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，菌落成藍(lán)色，且產(chǎn)生吲哚。
4.權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應(yīng)用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08降解葡萄糖產(chǎn)生酸性物質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A-08的應(yīng)用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A_08對(duì)葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
6.權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應(yīng)用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08對(duì)蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
7.權(quán)利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應(yīng)用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08分別與釀酒酵母CICC編號(hào)1517、大腸埃希氏菌CICC 編號(hào)10308混合對(duì)蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酸且能夠利用還原糖產(chǎn)乙醇的新菌種克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，保藏號(hào)為CCTCC M 209219，是從造紙廠污泥中分離的一株細(xì)菌，結(jié)合16S rRNA基因序列分析和菌株形態(tài)、生理特性分析，確定該菌株為克雷伯氏菌。利用該菌能夠降解葡萄糖生成酸性物質(zhì)，還能對(duì)葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇，且相對(duì)穩(wěn)定、高產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101935619SQ20091020739
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者易琳琳, 王義強(qiáng), 陳介南 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)