專利名稱：acyB1基因中斷菌株的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化泰樂菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種耐熱鏈霉菌基因工程菌，以及用該菌轉(zhuǎn)化泰樂菌素為乙酰泰樂 菌素的方法。根據(jù)已報道的基因序列信息設(shè)計引物，從耐熱鏈霉菌基因組DNA中將含有 acyBl基因的基因片段克隆下來，得到含有acyBl基因片段的重組載體；通過SOE-PCR技術(shù) 構(gòu)建acyBl基因被破壞了的重組載體；通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移，將這個載體導(dǎo) 入耐熱鏈霉菌中；通過同源重組、抗性篩選、PCR驗證和HPLC-MS分析得到acyBl基因被破 壞的耐熱鏈霉菌基因突變株；將這個基因突變株轉(zhuǎn)化大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，得到乙酰大環(huán)內(nèi) 酯類抗生素。本研究工作為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行專一性?；脑旖⒘艘粋€平臺。
背景技術(shù)：
耐熱鏈霉菌是一種具有非常重要工業(yè)價值的鏈霉菌，其重要性不在于其所產(chǎn)生的 次級代謝產(chǎn)物碳霉素，而在于它生物轉(zhuǎn)化泰樂菌素生產(chǎn)乙酰異戊酰泰樂菌素(AIV)。AIV是 一種重要的泰樂菌素衍生物，主要用于治療畜禽的支原體感染疾病。已有的研究表明分別 負(fù)責(zé)乙?；彤愇祯；δ艿幕驗閍cyA基因和acyBl基因，以及acyBl的正調(diào)節(jié)基 因acyB2。acy和aCyBl_B2已經(jīng)相繼在異源宿主中，如在變鉛青鏈霉菌和弗氏鏈霉菌中表 達(dá)。在弗氏鏈霉菌中，通過質(zhì)粒游離表達(dá)了 aCyA-aCyBl-aCyB2基因，得到了預(yù)期的AIVdfi 是產(chǎn)量距離工業(yè)化生產(chǎn)還比較遠(yuǎn)。鏈霉菌中已經(jīng)發(fā)展了非常成熟的基因克隆和功能分析系統(tǒng)，其中最為常用的是基 于同源重組的基因中斷和基因置換技術(shù)，其基本原理如圖1所示。用作基因置換的質(zhì)粒上攜帶有兩個長度合適而且與天然方向一致的染色體片段 A、B。片段之間插入有在鏈霉菌中表達(dá)的抗性基因D，同時載體部分也含有在鏈霉菌中表達(dá) 的抗性基因E。相應(yīng)的，染色體上的同源片段為A、B，C則為A和B之間將要被抗性基因D 置換的目的片段?；蛑脫Q是在抗生素的選擇壓力下，以單拷貝或低拷貝的形式發(fā)生的， 因此質(zhì)粒在受體菌中一般是不復(fù)制的。質(zhì)粒通常采用的形式有幾種，如只在大腸桿菌中復(fù) 制的單功能載體，溫度敏型質(zhì)粒或復(fù)制及穩(wěn)定功能有缺陷的質(zhì)粒。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌時，可 通過單抗或雙抗篩選獲得發(fā)生單交換的轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒這時通過與染色體上同源片段之間的 重組而整合到染色體上。將上述轉(zhuǎn)化子在松弛條件下生長一代或幾代，可大大提高二次交 換發(fā)生的頻率，然后通過影印或者點種在兩種不同抗生素平板上，挑取只對插入抗性標(biāo)記D 敏感的轉(zhuǎn)化子即可能為發(fā)生基因中斷或置換的菌株。若A、B直接相連，最后得到的染色體 結(jié)構(gòu)是抗性標(biāo)記插入A、B之間而將有關(guān)基因打斷，稱為基因中斷；若A、B中間由C片段隔 開，最后得到的染色體結(jié)構(gòu)是抗性標(biāo)記置換C片段而將基因打斷，稱為基因置換。

發(fā)明內(nèi)容
本研究的主要目的就是通過基因中斷的方法，構(gòu)建acyBl基因被中斷的耐熱鏈霉 菌基因重組菌株，得到只具有乙?；δ艿哪蜔徭溍咕蚬こ讨亟M菌株，為大環(huán)內(nèi)酯 類抗生素?；脚_的建立提供“核心部件”。該菌現(xiàn)已于2009年7月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物所； 郵編100101)，保藏編號為 CGMCC No. 3193，分類命名為 Sti^ptomyces thermotoIerans0本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種上述基因工程菌的構(gòu)建方法，即通過SOE-PCR 技術(shù)構(gòu)建acyBl基因被破壞了的重組載體。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案—方面，本發(fā)明所提供的只具有乙?；肪毓δ艿哪蜔徭溍咕蚬こ叹?， 是通過中斷acyBl基因而得到的。已有的研究表明分別負(fù)責(zé)乙?；彤愇祯；δ艿幕驗閍cyA基因和 acyBl基因，將acyBl基因中斷后，得到只能乙?；肪氐哪蜔徭溍咕?。另一方面，本發(fā)明提供了構(gòu)建acyBl基因被破壞了的重組載體的方法，再通過大 腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移，將這個載體導(dǎo)入耐熱鏈霉菌中。acyBl基因被破壞了的重組 載體是通過SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建成的，其中包括以下步驟IacyBl基因中斷兩側(cè)交換臂及acc (3) IV抗性盒PCR擴增根據(jù)已公布的acyBl 基因及其兩側(cè)基因序列，以耐熱鏈霉菌基因組DNA為模板，設(shè)計兩對引物分別擴增acyBl 基因被中斷序列兩側(cè)1. 4kb左右的交換臂，再以質(zhì)粒PIJ773為模板，設(shè)計一對引物擴增含 有安普霉素抗性基因aac (3) IV和接合轉(zhuǎn)移起始位點oriT的抗性基因中斷盒。反應(yīng)條件 950C 45s, 660C 60s, 72°C 90s，30Cycles ；72°C延伸5min。反應(yīng)完成后，電泳檢測到三條約 1. 4kb的DNA片段。2S0E-PCR構(gòu)建acyBl基因中斷結(jié)構(gòu)擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化回收 定量后進(jìn)行 S0E-PCR，反應(yīng)條件:95°C 45s, 72°C 6min, 30Cycles ；72°C 延伸 IOmin0 反應(yīng)完 成后，電泳檢測到一條4. 2kb的DNA片段，所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收純化， BglII酶切后插入pIJ2925的BmaHI位點中。通過安普霉素抗性篩選，得到若干acyBl基因 發(fā)生中斷的陽性克隆子，命名為PZM2009。3acyBl基因中斷載體的構(gòu)建選用了 SuperCosl作為基因置換載體。將pZM2009 經(jīng)BglII酶切后回收4. 2kb的片段插入SuperCosl載體中，相應(yīng)得到acyBl基因中斷載體 PZM2010。^cyBl基因中斷載體導(dǎo)入耐熱鏈霉菌1)將pZM2010轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/ PUZ8002 ；接種Iml耐熱鏈霉菌菌絲體于9ml YEME培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)18h ；2)用超聲波處理耐熱鏈霉菌菌絲體，轉(zhuǎn)接2ml培養(yǎng)物于18ml新鮮TSB培養(yǎng)基中繼 續(xù)于34°C培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)16h。同時挑取一大腸桿菌轉(zhuǎn)化子于含有安普霉素(Am)、卡那霉素 (Km)、氯霉素(Cml)的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16h ；3)用超聲波處理耐熱鏈霉菌菌絲體，轉(zhuǎn)接Iml培養(yǎng)物于9ml新鮮TSB培養(yǎng)基，于 34°C繼續(xù)培養(yǎng)3 4h。同時轉(zhuǎn)接大腸桿菌培養(yǎng)物于加了上述三種抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基 中培養(yǎng)3 4h ；同時收集鏈霉菌菌絲體和大腸桿菌培養(yǎng)物，3500rpm離心IOmin去上清，收 集菌體，用新鮮TSB懸浮菌體。3500rpm再離心10分鐘去上清，用1/10體積的TSB懸浮菌 體；4)對鏈霉菌菌絲體進(jìn)行適度的稀釋，選擇合適的稀釋度，將大腸桿菌和鏈霉菌菌 絲等體積混合后涂布于YEME培養(yǎng)基，于34°C培養(yǎng)18 20小時；5)從34°C培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)物，用含安普霉素(1000yg/ml)和萘啶酮酸 (500 μ g/ml)的Iml無菌水覆蓋。3 5天后平板上長出5 30個數(shù)量不等的抗性菌落。4
5篩選acyBl基因中斷雙交換菌株挑取若干抗性菌落，分別涂布加入了安普霉 素的抗性平板和卡那霉素的抗性平板。不需要通過放松培養(yǎng)，可直接篩選得到了 acyBl基 因中斷的雙交換菌株，雙交換頻率> 10%，所得到的突變株命名為ZM7。本發(fā)明還提供了一種耐熱鏈霉菌生物轉(zhuǎn)化泰樂菌素的方法，其具體步驟如下1種子培養(yǎng)方法從改良高氏一號培養(yǎng)基上挑取ZM7單菌落，接入一級種子搖瓶 培養(yǎng)基中，種子搖瓶培養(yǎng)基裝量為50ml/500ml搖瓶，30°C搖床，200RPM培養(yǎng)48hr左右。取 0. 2ml 一級種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于二級種子培養(yǎng)基中，30°C搖瓶，200RPM培養(yǎng)Mhr左右。2發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法取3ml 二級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，發(fā)酵搖瓶培 養(yǎng)基裝量為50ml/500ml搖瓶，30°C發(fā)酵48hr后，向培養(yǎng)液中加入泰樂菌素底物，繼續(xù)轉(zhuǎn)化 48hr左右后，下?lián)u床。3液相檢測泰樂菌素、乙酰泰樂菌素和異戊酰泰樂菌素取發(fā)酵液10ml，加入50% 甲醇10ml，超聲波處理30min，0. 45um濾膜過濾發(fā)酵液，處理過的樣品適量稀釋后，進(jìn)行液 質(zhì)聯(lián)機檢測，結(jié)果如圖3所示，表明泰樂菌素中的A組分只能被轉(zhuǎn)化成乙酰泰樂菌素A，未檢 測到異戊酰泰樂菌素A及泰樂菌素其它組分的異戊酰基化衍生物。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明原理和實施方案，其中圖1基因中斷或置換原理示意^cyBl基因序列(CDS)(下劃線部分)圖3泰樂菌素生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相圖譜
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 :acyBl基因中斷菌株的構(gòu)建IacyBl基因中斷兩側(cè)交換臂及acc (3) IV抗性盒PCR擴增根據(jù)基因BLAST結(jié)果(序列詳見附圖)，我們設(shè)計acyBl基因中斷引物序列如下Ρ-acyBl-l gaagatctatggctgcgctcctgaagcP-acyBl-2 :ggtcgacggatccccggaattctacatgttcccgccggtgP-acyBl-3 :caccggcgggaacatgtagaattccggggatccgtcgaccP-acyBl-4 :gcccctgccgaaacatcttctgtaggctggagctgcttcP-acyBl-5 :gaagcatctccagcctacagaagatgtttcggcaggggcP-acyBl-6 gaagatcttcagcgggacagggccgg(P-acyBl-l&P-acyBl-6 的下劃線部分為 BglII 識別位點，P-acyBl-3&P-acyBl_4 的下劃線部分為質(zhì)粒PIJ773上的引物位點，引物P-acyBl-2和P-acyBl-3序列互補，引物 P-acyBl-4 和 P_acyBl_5 序列互補)根據(jù)已公布的acyBl基因及其兩側(cè)基因序列，以耐熱鏈霉菌基因組DNA為模板，設(shè) 計兩對引物分別擴增acyBl基因被中斷序列兩側(cè)1.41Λ左右的交換臂，再以質(zhì)粒pIJ773為 模板，設(shè)計一對引物擴增含有安普霉素抗性基因aaCC3)IV和接合轉(zhuǎn)移起始位點oriT的抗性基因中斷盒。反應(yīng)條件:95°C 45s, 66°C 60s, 72°C 90s，30Cycles ；72°C延伸5min。反應(yīng)完 成后，電泳檢測到三條約1. 4kb的DNA片段，與預(yù)計情況完全符合。2S0E-PCR構(gòu)建acyBl基因中斷結(jié)構(gòu)擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化回收定量后進(jìn)行S0E-PCR，反應(yīng)條件 950C 45s, 720C 6min, 30Cycles ；72°C延伸 IOmin0 反應(yīng)完成后，電泳檢測到一條 4. 2kb 的 DNA 片段，與預(yù)計情況完全符合。所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收純化，BglII酶切后 插入pIE925的BmaHI位點中。通過安普霉素抗性篩選，得到若干acyBl基因發(fā)生中斷的 陽性克隆子，命名為PZM2009。對所得到的陽性克隆子pZM2009再進(jìn)行PCR及酶切驗證，結(jié)果與SOE-PCR構(gòu)建 acyBl基因中斷結(jié)構(gòu)完全符合。3acyBl基因中斷載體的構(gòu)建PZM2009不含鏈霉菌復(fù)制子，但由于其不含有其它適合在鏈霉菌系統(tǒng)中篩選 的抗性標(biāo)記，所以不適合作為穿梭自殺載體用于鏈霉菌的基因置換。因此，本研究選用 了 SuperCosl作為基因置換載體。將pZM2009經(jīng)BglII酶切后回收4. 21Λ的片段插入 SuperCosl載體中，相應(yīng)得到acyBl基因中斷載體pZM2010。^cyBl基因中斷載體導(dǎo)入耐熱鏈霉菌1)將pZM2010轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002 ；接種Iml耐熱鏈霉菌菌絲體于9ml YEME培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)18h ；2)用超聲波處理耐熱鏈霉菌菌絲體，轉(zhuǎn)接2ml培養(yǎng)物于18ml新鮮TSB培養(yǎng)基中繼 續(xù)于34°C培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)16h。同時挑取一大腸桿菌轉(zhuǎn)化子于含有安普霉素(Am)、卡那霉素 (Km)、氯霉素(Cml)的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16h ；3)用超聲波處理耐熱鏈霉菌菌絲體，轉(zhuǎn)接Iml培養(yǎng)物于9ml新鮮TSB培養(yǎng)基，于 34°C繼續(xù)培養(yǎng)3 4h。同時轉(zhuǎn)接大腸桿菌培養(yǎng)物于加了上述三種抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基 中培養(yǎng)3 4h ；同時收集鏈霉菌菌絲體和大腸桿菌培養(yǎng)物，3500rpm離心IOmin去上清，收 集菌體，用新鮮TSB懸浮菌體。3500rpm再離心10分鐘去上清，用1/10體積的TSB懸浮菌 體；4)對鏈霉菌菌絲體進(jìn)行適度的稀釋，選擇合適的稀釋度，將大腸桿菌和鏈霉菌菌 絲等體積混合后涂布于YEME培養(yǎng)基，于34°C培養(yǎng)18 20小時；5)從34°C培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)物，用含安普霉素(ΙΟΟΟμ g/ml)和萘啶酮酸(500g/ ml)的Iml無菌水覆蓋。3 5天后平板上長出5 30個數(shù)量不等的抗性菌落。5篩選acyBl基因中斷雙交換菌株挑取若干抗性菌落，分別涂布加入了安普霉素的抗性平板和卡那霉素的抗性平 板。不需要通過放松培養(yǎng)，可直接篩選得到了 acyBl基因中斷的雙交換菌株，雙交換頻率 ^ 10%，所得到的突變株命名為ZM7。在本實例中以下是應(yīng)用到的一些培養(yǎng)基的組成(包含一些單項的制備方法)LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基(Sambrook et al.，1989)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH7. 0。LA 培養(yǎng)基(Sambrook et al.，1989)LB中加入終濃度為1. 5%的瓊脂粉。
酵母膏-麥芽糖培養(yǎng)基(YEME)(Kisser et al.，2000)Difco酵母提取物3g，Difco蛋白胨5g，Oxoid麥芽糖3g，葡萄糖10g，蔗糖103g, 蒸餾水 1000ml，115°C滅菌 25min，臨用前補加 MgCl2 · 6H20(2. 5M)2ml/l。改良高氏一號培養(yǎng)基玉米淀粉20g, NaCl 0. 5g, KNO3 lg, FeSO4 0. Olg, K2HPO4 0. 5g, MgSO4 7H20 0. 5g, 瓊脂 20g,蒸餾水 1000ml, pH 7. 0-7. 2大腸桿菌培養(yǎng)方法在LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床，200RPM培養(yǎng)過夜。耐熱鏈霉菌培養(yǎng)方法在改良高氏一號培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周產(chǎn)孢后備用。耐熱鏈霉菌菌絲培養(yǎng)方法在YEME培養(yǎng)基中，30°C搖床，200RPM搖床培養(yǎng)48小時。耐熱鏈霉菌基因組DNA提取方法用YEME培養(yǎng)基培養(yǎng)耐熱鏈霉菌菌絲體，吸取一定量的菌液于1. 5ml離心管中， 3000rpm離心15min收集菌體，加入Iml 10. 3%蔗糖溶液洗滌菌體兩次后用500 μ 1溶菌酶 溶液重新懸浮50mg菌絲體，于37°C溫育約30min至細(xì)胞成為半透明狀。加入500 μ 1 2% SDS，混合振蕩約Imin直到溶液的粘度顯著下降，55°C溫育15min，然后加入1/10體積3M醋 酸鈉(unbuffered)和200 μ 1中性苯酚/氯仿，混合振蕩均勻后，12000rpm離心5min，小心 地吸取上清液，棄去白色中間層。用中性苯酚/氯仿重復(fù)四五次抽提直至看不見(或非常 少)中間層為止，最后加入1倍體積的異丙醇(或2. 2倍體積的無水乙醇)，反復(fù)顛倒置絮 狀DNA沉淀出現(xiàn)。用槍頭挑取沉淀塊置于一新離心管中，加入75%乙醇洗滌DNA兩次，最后 棄去所有上清液，待乙醇揮發(fā)后，溶解于一定量TE緩沖液中。大腸桿菌質(zhì)粒提取方法大腸桿菌在加入合適抗生素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，用1. 5ml離心管收集 菌液，12000rpm離心30s去上清收集菌體，加入200 μ 1預(yù)冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl, IOmM EDTA, pH8. 0)懸浮菌體，振蕩均勻后加入 400 μ 1 溶液 II (0. 2M NaOH, 1 % SDS)，快速顛倒10次左右混合均勻(動作要輕柔)，然后再加入300 μ 1溶液III (3. OM乙酸 鉀，ΡΗ4. 8)混合均勻，12000rpm離心5min，吸取上清，用1/4體積苯酚氯仿溶液振蕩抽提， 12000rpm離心5min后吸取上清，加入1倍體積異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，離心5min后去上清收 集沉淀物，用70%乙醇洗滌兩次，置工作臺吹干后加一定量的TE緩沖液或ddH20溶解。PCRPCR反應(yīng)參照試劑公司產(chǎn)品說明書推薦的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行。本研究所用 的酶為TaKaRa公司的LA-Taq酶(用于長鏈PCR和高保真PCR)。長鏈PCR反應(yīng)體系如下引物QOpmol/μ 1)各 1 μ 1模板DNA (約 30ng/ μ 1)1 μ 1DMSO2· 5 μ 12 X GC Buffer II25 μ 1dNTPs 混合物(2· 5mM)8 μ 1
LA-Taq 或 Taq (5U)(MH2O總體積0. 5μ 1 11. 0μ 1 50 μ 1DNA片段回收步驟1)從反應(yīng)液中回收PCR產(chǎn)物將0. 4ml純化樹脂(使用前充分混勻)裝入離心純化柱，然后加入50 100 μ 1 無石蠟油的PCR反應(yīng)液，顛倒混勻后靜置3分鐘。13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢 液。加入500μ1 80%異丙醇(或乙醇)，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重 復(fù)第二步一次，此步驟13000rpm離心2分鐘，務(wù)必將異丙醇(或乙醇)除盡。如果純化柱 上還殘留有異丙醇(或乙醇)，再離心1分鐘。將純化柱套入干凈的1.5ml離心管中，加入 50 μ 1超純水或TE緩沖液于純化樹脂上，不能粘在管壁上。放置2分鐘后，13000r/min離 心30秒。離心管中的液體即是純化的PCR產(chǎn)物，取4μ 1電泳檢測。2)從普通瓊脂糖凝膠中回收DNA片段將無石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液(50 100 μ 1反應(yīng)體系)在1 %的普通瓊 脂糖凝膠上電泳，染色。在長波紫外燈下迅速切下含有目標(biāo)DNA片段的瓊脂糖凝膠，并裝入 2ml離心管中。盡量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡化操作，提高回收量及DNA片段 的質(zhì)量。200-400mg瓊脂糖凝膠中加入0. 4ml純化樹脂(使用前充分混勻)，70°C保溫5_10 分鐘，每兩分鐘顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。對于高濃度的瓊脂糖凝膠O. 0% )， 每200mg的瓊脂糖凝膠中加入500 μ 1純化樹脂，加熱時間延長到15分鐘將混和液裝入離 心純化柱，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入500 μ 1 80%異丙醇(或乙醇)， 13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)4步一次，此步驟13000rpm離心2分鐘， 務(wù)必將異丙醇(或乙醇)，再離心1分鐘。將純化柱套入干凈的1.5ml或2ml離心管中，加 入40 μ 1超純水或TE緩沖液于純化樹脂上，不能粘在管壁上。放置2分鐘后，13000rpm離 心30秒。離心管中的液體即是純化的PCR產(chǎn)物，取4μ 1電泳檢測。DNA 連接用于DNA連接反應(yīng)的載體DNA和外源DNA片段經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗苾?nèi)切酶切割后，純化 后用T4DNA連接酶連接。酶連反應(yīng)體系中外源DNA與載體的比例應(yīng)為3 4 1，酶連體系 為20 μ 1左右，16°C酶連反應(yīng)過夜或置于室溫酶連2 3小時后備轉(zhuǎn)化用。實施例2 :acyBl基因中斷菌株轉(zhuǎn)化泰樂菌素1種子培養(yǎng)方法從改良高氏一號培養(yǎng)基上挑取ZM7單菌落，接入一級種子搖瓶培養(yǎng)基中，種子搖 瓶培養(yǎng)基裝量為50ml/500ml搖瓶，30°C搖床，200RPM培養(yǎng)48hr左右。取0. 2ml 一級種子培 養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于二級種子培養(yǎng)基中，30°C搖瓶，200RPM培養(yǎng)Mhr左右。2發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法取3ml 二級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，30°C發(fā)酵48hr后，向培養(yǎng)液中 加入泰樂菌素底物，繼續(xù)轉(zhuǎn)化48hr左右后，下?lián)u床。3液相檢測泰樂菌素、乙酰泰樂菌素和異戊酰泰樂菌素取發(fā)酵液10ml，加入50%甲醇10ml，超聲波處理30min，0. 45um濾膜過濾發(fā)酵液， 處理過的樣品適量稀釋后，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)機檢測，結(jié)果如圖3所示，表明泰樂菌素中的A組分只能被轉(zhuǎn)化成乙酰泰樂菌素A，未檢測到異戊酰泰樂菌素A及泰樂菌素其它組分的異戊酰 基化衍生物。以下是實例中應(yīng)用到的一些培養(yǎng)基成分(包含一些單項的制備方法)耐熱鏈霉菌種子搖瓶培養(yǎng)基大豆粉15g，玉米淀粉30g，酵母提取物2g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，自來水 1000ml, pH 7. 0-7. 2。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基玉米淀粉30g,大豆粉 30g,酵母提取物 2g，MgSO4 · 7H20 5g，K2HPO4IOOg, KH2PO4 60g，消泡劑 0. 2ml,自來水 1000ml, PH 7. 0-7. 2。底物配制及補料方法將3g泰樂菌素溶于IOOml蒸餾水中，使用0. 22微米無菌過濾器過濾除菌，取5ml 泰樂菌素加入50ml發(fā)酵液中。檢測效價用流動相的配制乙腈醋酸銨冰醋酸=45 45 10，醋酸銨溶液濃度為0. 15M。序列表<110>中牧實業(yè)股份有限公司<120>acyBl基因中斷菌株的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化泰樂菌素的方法<130>ZM001<160>7<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>27<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>1gaagatctat ggctgcgctc ctgaagc27<210>2<211>40<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>2ggtcgacgga tccccggaat tctacatgtt cccgccggtg40<210>3<211>40<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>3caccggcggg aacatgtaga attccgggga tccgtcgacc40<210>4
<211>39<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>4gcccctgccg aaacatcttc tgtaggctgg agctgcttc39<210>5<211>39<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>5gaagcatctc cagcctacag aagatgtttc ggcaggggc39<210>6<211>26<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>6gaagatcttc agcgggacag ggccgg26<210>7<211>2749<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>70152]gatcacactcttcgaggaactccacgggcgctgacgcacgcggcgagggcgcgccccgca600153]ccggtcgtcccgcgtcggctacggagtgccggacggggcgggttcggacctgggtgtcga1200154]gccggcgtccggggaccgccgcggccgtcccagggttcgcatgaccggcttctccacgaa1800155]gaagtgcaggaacgccgacagccccagcgccagcgtgaaggcgagcagggtcagcccgac2400156]ggcggccggtgtgtcccactgccggtaatagccctgcttcccgccggcgaagcggtgccc3000157]gtactggatgatcaggtagtgcacgaggtagaaggcgaaggtgagttcccccagcagcac3600158]catcgtcctggtccccagccaggagcggacgccgcgcacatcaccgacggccaccgaggc4200159]gagcagcagcgcgatcaccgggacggtcaaCgCgCCggggtcgtagtggttcggcaccgc4800160]gaacgtcaccgcgaacaccgctgagaacagcgcgacgcaggccaggggacgcgggcccct5400161]ccagcgtccccggatcacgatctgggccatgagcatcccgagcacgaactccagcagccg6000162]caccggcgggaacatgtagatgaaccaccaccgcagctgcggcatgtccgggtcccacgg6600163]caggggcgggctggccggcagcagcagtgcgaccagggggatggagacggcggccacgga7200164]caccgcggcggcccaccgccagagccggtccgtacggaccttggtgaagaaggcgaagag7800165]gaacgggaacatggcgtagaagaacagctcgcaggagagcgaccacgccaccgggttcat8400166]gctgccgtactcgtggtggtcggggaaccatgcctggatcagcagcaggttcgtgagcag9000167]tccgtcccacaccgatcggcccatgttgggctcgttgagggccagcacgatcagcagcgt9600168]caccagcagcacgggcaggtgcagcgagtacgcgcggaccgtgcgccgccgccagaagtt1020
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權(quán)利要求
1.耐熱鏈霉菌CGMCCNo. 3193。
2.構(gòu)建的acyBl基因被破壞了的重組載體pZM2010。
3.一種發(fā)酵轉(zhuǎn)化泰樂菌素的方法，該方法包括先培養(yǎng)耐熱鏈霉菌CGMCC No. 3193, 然后向發(fā)酵液中補入泰樂菌素底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵培養(yǎng)基PH為 7. 0-7. 2。
全文摘要
根據(jù)已報道的基因序列信息設(shè)計引物，從耐熱鏈霉菌基因組DNA中將含有acyB1基因的基因片段克隆下來，得到含有acyB1基因片段的重組載體；通過SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建acyB1基因被破壞了的重組載體；通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移，將這個載體導(dǎo)入耐熱鏈霉菌中；通過同源重組、抗性篩選、PCR驗證和HPLC-MS分析得到acyB1基因被破壞的耐熱鏈霉菌基因突變株；將這個基因突變株轉(zhuǎn)化大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，得到乙酰大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。本研究工作為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行專一性?；脑旖⒘艘粋€平臺。
文檔編號C12P19/62GK102051341SQ200910210820
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者張國棟, 曹芹, 王華麗, 鄭應(yīng)華, 閔勇, 齊鵬 申請人:中牧實業(yè)股份有限公司