專利名稱：源自谷氨酸棒桿菌的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及具有啟動(dòng)子活性的核苷酸片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棒桿菌屬于革蘭氏陽性菌。 一些棒桿菌作為工業(yè)微生物在生物工程領(lǐng)域里廣泛 應(yīng)用，可以用來生產(chǎn)多種化學(xué)物質(zhì)，例如氨基酸和核苷酸，L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨 酸、L-色氨酸、肌苷酸等。氨基酸和核苷酸可用作藥品、食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料。經(jīng) 過物理和/或化學(xué)方法誘變處理得到的棒桿菌突變株具有較強(qiáng)的合成上述有用物質(zhì)的能 力，而通過遺傳工程和/或代謝工程對(duì)棒桿菌野生菌株或突變株進(jìn)行改造，可以獲得具有 更高生產(chǎn)強(qiáng)度的菌株。這種遺傳工程的基本操作即是在棒桿菌中表達(dá)涉及多種代謝途徑 的基因。通常基因都是在啟動(dòng)子控制下表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度依賴于啟動(dòng)子元件。已經(jīng)在棒 桿菌基因組、棒桿菌帶有的質(zhì)粒以及棒桿菌噬菌體中分離出33個(gè)具有啟動(dòng)子活性的核 苷酸片段，這些核苷酸片段中包括一些已知基因的啟動(dòng)子例如，amt、 argS、 fda、 g即基因 等((P6tek M et al. ， Journal ofBiotechnology 104:311-323,2003)。來自大腸桿菌、 鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子能夠在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)，說明棒桿菌中的mRNA聚 合酶既可以識(shí)別來自革蘭氏陽性細(xì)菌，又可以識(shí)別來自革蘭氏陰性細(xì)菌中的多種啟動(dòng)子 (Martin J F et al. ， Nature Biotechnology 5(2) : 137-146， 1987)。大腸桿菌trp操縱子 的operator-r印ressor系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中仍然有功能，并可以被噴哚乙酸(IAA)所誘 導(dǎo)。Tsuchya等利用大腸桿菌的lac和A噬菌體PKPt operator-r印ressor系統(tǒng)，在棒桿 菌中表達(dá)了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Tsuchiya M & Morinaga Y， NatureBiotechnology 6(4): 428-430,1988)。 Liebl等使用tac啟動(dòng)子和lacl構(gòu)建了可誘導(dǎo)的大腸桿菌_谷氨酸棒 桿菌穿梭表達(dá)載體，大量表達(dá)了金黃色葡萄球菌的核酸酶(Liebl W et al.， Journal of Bacteriology 174(6) :1854-1861， 1992)。已知trc啟動(dòng)子可以在棒桿菌屬細(xì)菌中顯示活 性(Patek M et al. Journal ofBiotechnology 104:311-323,2003)。在谷氨酸棒桿菌中 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)大都使用了大腸桿菌中的強(qiáng)啟動(dòng)子，例如Ptrp、PlacUV5、Ptac等。
但是，由于大腸桿菌的啟動(dòng)子在棒桿菌中有泄漏阻遏，以及有關(guān)誘導(dǎo)物在較低濃 度下不易穿過棒桿菌的細(xì)胞壁等原因，因而在實(shí)際生產(chǎn)中其應(yīng)用還很有限。仍然需要從谷 氨酸棒桿菌中篩選可受各種物理化學(xué)因子誘導(dǎo)的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯?dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種啟動(dòng)子。 本發(fā)明提供的啟動(dòng)子是從谷氨酸棒桿菌基因組分離得到的核苷酸片段并且具有 啟動(dòng)子活性。本發(fā)明中的術(shù)語"啟動(dòng)子"系指DNA上一段序列，RNA聚合酶結(jié)合到該序列上， 可以起始基因的轉(zhuǎn)錄。 所述啟動(dòng)子的核苷酸序列是如下1)或2)或3):
1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；
2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序 列； 3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序 列。 所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7.2，7%SDS)中，65t:預(yù)雜交30min ;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩 沖液，pH7.2，7% SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65t:雜交12hr ;棄雜交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 5% SDS) ，65。C洗膜2次，每次30min ;加入洗膜液 II (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 1% SDS) ，65。C洗膜30min。本發(fā)明的啟動(dòng)子活性片段還包括與來自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互補(bǔ)的
核苷酸序列。這里使用的術(shù)語"互補(bǔ)的"系指遵循堿基配對(duì)原則產(chǎn)生的之意。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方
法，對(duì)本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得
到的啟動(dòng)子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達(dá)靶基因的啟動(dòng)子活
性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。 這里使用的術(shù)語"同源性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同源性"包括與本發(fā) 明的啟動(dòng)子核苷酸序列具有優(yōu)選地75%或更高，更優(yōu)選地85%或更高，甚至更優(yōu)選地90% 或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件 進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性可以用百分比(％ )表示，其可 以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同源性。 含有上述的啟動(dòng)子的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 上述重組載體是上述的啟動(dòng)子插入載體pAKC6多克隆位點(diǎn)制成的重組載體。 含有上述的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 含有上述的啟動(dòng)子的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 上述重組菌是含有上述啟動(dòng)子的原核細(xì)菌，所述原核細(xì)菌是如下1)或2)或3):
1)棒桿菌屬細(xì)菌
2)埃希氏菌屬細(xì)菌 3)棒桿菌屬或埃希氏菌屬細(xì)菌經(jīng)誘變得到的突變菌株。 本發(fā)明的啟動(dòng)子活性片段除了在棒桿菌屬細(xì)菌中具有活性外，還在埃希氏菌屬細(xì) 菌中具有活性。本發(fā)明中所指的棒桿菌屬細(xì)菌可以是該屬的任何細(xì)菌，例如谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032，鈍齒棒桿菌AS 1. 542和北京棒桿菌AS 1.299等等。但是，棒桿菌屬細(xì)菌不限 于此，還包括由棒桿菌屬細(xì)菌經(jīng)各種物理的或化學(xué)的方法誘變得到的突變菌株。本發(fā)明中 所指的埃希氏菌屬細(xì)菌包括大腸桿菌。 本發(fā)明的另一目的在于提供上述的啟動(dòng)子在棒桿菌屬或埃希氏菌屬細(xì)菌中啟動(dòng) 目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。 上述目的基因可為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。 含有上述啟動(dòng)子的重組棒桿菌或埃希氏菌通過常規(guī)技術(shù)可以生產(chǎn)氨基酸和核苷 酸等，如L-谷氨酸丄-賴氨酸丄-蘇氨酸丄-色氨酸、肌苷酸等可用作藥品、食品、食品添加 劑或動(dòng)物飼料。
實(shí)驗(yàn)證明來自SEQ ID NO :1的啟動(dòng)子活性片段在棒桿菌屬細(xì)菌中具有比trc啟 動(dòng)子(SEQ ID NO :2)更高的活性。


圖1為鳥槍法克隆谷氨酸棒桿菌10147基因組中啟動(dòng)子活性片段。
圖2為帶有trc啟動(dòng)子的啟動(dòng)子探針載體構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 術(shù)語"tac"啟動(dòng)子系將大腸桿菌色氨酸操縱子的啟動(dòng)子的-35區(qū)與大腸桿菌乳糖 操縱子的-10區(qū)，乳糖操縱子中的操作基因部分以及SD序列融合而成，-35區(qū)與-10區(qū)間 隔16個(gè)堿基。已知tac啟動(dòng)子是非常強(qiáng)的啟動(dòng)子。術(shù)語"trc"啟動(dòng)子系在"tac"啟動(dòng)子 的-35區(qū)和-10區(qū)之間插入一個(gè)堿基構(gòu)建得到，其-35區(qū)與-10區(qū)的間隔為17個(gè)堿基。已 知在大腸桿菌中trc啟動(dòng)子的活性是tac啟動(dòng)子的90X。 (Brosius J et al. ，The Journal of Biological Chemistry 260(6) :3539-3541)。 LB培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl 10g，用蒸餾水定容至1升。 實(shí)施例1、獲得具有啟動(dòng)子活性的DNA片段
—、培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌10147并提取基因組DNA
1、細(xì)菌的培養(yǎng) 挑取谷氨酸棒桿菌10147 (棒狀類細(xì)菌電擊轉(zhuǎn)化中多種條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響沈 天翔等生物工程學(xué)報(bào)11(3) :245-2791995)(該菌株可在中國科學(xué)院微生物研究所得到，具 體見保證函)單菌落接種于3ml LB培養(yǎng)基的試管中，置于3(TC的搖床上300rpm過夜培養(yǎng)， 該培養(yǎng)液作為種子液。取種子液400 iiL接種于30ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30°C的搖 床上300rpm過夜培養(yǎng)。 2、谷氨酸棒桿菌10147基因組DNA的提取 lOOOOrpm離心5min收集步驟1中過夜培養(yǎng)的菌體，用5ml溶液I (50mmol/L葡萄 糖，25mmol/L Tris-HCl pH8. 0， lOmmol/L EDTA pH8. 0)洗菌兩遍。菌體用4. 5ml溶液I懸 浮，加溶菌酶至其終濃度為10-15mg/ml，懸浮液于37t:處理l_2h。加0. 5mll0% SDS，振蕩 混勻至透亮。然后加lml 5M NaCl，于4t:放置lh。劇烈振蕩離心管多次，至溶液呈乳白色。 13500rpm，4。C離心30min。等體積酚仿抽提3次，14000rpm，離心10min，取上清。加2倍體 積無水乙醇，用玻璃棒攪出絲狀沉淀，該沉淀即是基因組DNA。然后用70%乙醇洗滌一遍， 將沉淀風(fēng)干后溶于lml TE(10mM Tris_HClpH8. 0， lmM EDTA pH8. 0)中，加適當(dāng)RNase處理 RNA。 二 、篩選獲得啟動(dòng)子片段 采用鳥槍法，利用啟動(dòng)子探測(cè)載體從谷氨酸棒桿菌10147基因組DNA中篩選具有 啟動(dòng)子活性的DNA片段，篩選啟動(dòng)子的過程參見圖1。 用限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A I完全酶切谷氨酸棒桿菌10147的基因組DNA，將Sau3A I片段與經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶Bgl 1I酶切的啟動(dòng)子探測(cè)載體pAKC6(谷氨酸棒桿 菌/大腸桿菌穿梭型啟動(dòng)子探針載體的構(gòu)建李開等，微生物學(xué)報(bào)200747 (2) :191-196)連接 (Sau3A I和Bgl II屬于同尾酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Sambrook J，F(xiàn)ritsch E，Maniatis T分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.金冬雁，黎孟楓，等譯.第二版.北京科學(xué)出版社， 1989)，轉(zhuǎn)化液涂布于含60 ii g/mL氯霉素的LB平板進(jìn)行初篩；于37。C溫箱培養(yǎng)24h后，用 牙簽挑取轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于含400 ii g/mL氯霉素的LB平板進(jìn)行復(fù)篩，于37。C溫箱培養(yǎng)24h ;從 能夠生長的轉(zhuǎn)化子菌落中提取質(zhì)粒，使用SEQ ID N0:3和4引物進(jìn)行PCR反應(yīng)分析，反應(yīng) 條件94。C 2min ;94。C 30s，55。C lmin，72。C 3min，30個(gè)循環(huán)；72。C 10min。挑取插入片段小 于600bp的轉(zhuǎn)化子，然后從這些轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌10147的感受態(tài) 細(xì)胞(Liebl W et al. ，Brosius J et al. ，F(xiàn)EMS Microbiology Letters, 65 (3) :299—304， 1989)，轉(zhuǎn)化液涂布于含50 i！ g/mL卡那霉素的LB平板以篩選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于含 30 g/mL氯霉素的LB平板以篩選帶有插入片段的轉(zhuǎn)化子，于3(TC溫箱培養(yǎng)24h，從能生長 的菌落中提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行PCR反應(yīng)分析。同時(shí)以pAKC6為對(duì)照進(jìn)行相同操作。結(jié)果，得 到30個(gè)具有啟動(dòng)子功能的活性片段。該結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子活性片 段在大腸桿菌和棒桿菌屬細(xì)菌中都顯示活性。
實(shí)施例2、檢測(cè)分析啟動(dòng)子片段
—、啟動(dòng)子活性片段的DNA序列測(cè)定 提取實(shí)施例l(二)中的30個(gè)具有啟動(dòng)子功能的活性片段的質(zhì)粒DNA，分別使用人 工合成引物SEQ ID N0:3進(jìn)行啟動(dòng)子活性片段的DNA序列測(cè)定，得到30個(gè)DNA序列。本專 利涉及的啟動(dòng)子序列是SEQ ID N0:1。
二、總蛋白含量的測(cè)定
1)粗酶液的制備 制備序列SEQ ID NO :1所示的DNA片段。 將該片段與經(jīng)過內(nèi)切酶Bgl 1I酶切處理的啟動(dòng)子探測(cè)載體pAKC6連接，采用氯化 鈣法(Sambrook J， Fritsch E， Maniatis T分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.金冬雁，黎孟楓，等譯.第 二版.北京科學(xué)出版社，1989)轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a ，篩選陽性克隆，使用引物SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4進(jìn)行PCR、測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的目的片段的序列與SEQ ID NO :1相同。 提取上述陽性克隆的質(zhì)粒DNA，電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌10147的感受態(tài)細(xì)胞，然后 將轉(zhuǎn)化液涂布于含30 g/mL氯霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，將鑒定 正確后的谷氨酸棒桿菌單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，置于3(TC搖床培養(yǎng)16h， lOOOOrpm離 心5min收集菌體，用100mmol/L Tris-HCl (pH7. 8)洗滌兩遍，懸浮。超聲波破碎細(xì)胞(條件 溶液體積300ii L，功率280w，工作10s，間隔30s， 30次循環(huán))，于4°C ， 13500rpm離心15min， 取上清用于粗酶液的測(cè)定。 以帶有pAKC6以及pAKC6-trc的谷氨酸棒桿菌為對(duì)照，進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。
其中pAKC6-trc是啟動(dòng)子trc與pAKC6的連接，連接過程參見圖2，具體步驟如下
參照質(zhì)粒pXC99E(Kirchner 0 & T塞h A， Journal Biotechnology, 104 (1-3): 287-299,2003)的DNA序列，人工合成啟動(dòng)子trc，合成時(shí)在其兩側(cè)分別添加Kpnl和Hind III的酶切位點(diǎn)，序列見SEQ ID No. 2。將該片段與經(jīng)內(nèi)切酶Kpnl和Hindi 11雙酶切的啟動(dòng)子探測(cè)載體pAKC6連接，電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌10147的感受態(tài)細(xì)胞，得到含有已知啟動(dòng) 子trc的重組載體pAKC6-trc作為陽性對(duì)照。
2)總蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford M， Analytical Biochemistry, 72 (1-2) :248-254， 1976)，以牛血清白蛋白(組分V)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。 蛋白顯色試劑稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇中，然后加入 100ml 85%磷酸，最后定容到1L，用濾紙過濾后于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取25mg牛血清白蛋白(組分V)溶于25ml蒸餾水中配制成lmg/ ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線量取100 y L蛋白溶液(lmg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒸餾水以不同比例組 成)與5ml蛋白顯色試劑混勻，靜置5min后測(cè)定0D595，根據(jù)測(cè)定值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定先取10iiL待測(cè)樣品用90iiL蒸餾水稀釋到0. lml，加到試管中，然后加入 5ml蛋白顯色試劑，振蕩搖勻，靜置5min后測(cè)定0D595 。 測(cè)定結(jié)果如表1所示，含有序列1的谷氨酸棒桿菌表達(dá)出的總蛋白量比含有序列
2(trc啟動(dòng)子)的谷氨酸棒桿菌表達(dá)出的總蛋白量略低。 表l.谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化子中插入片段的大小和啟動(dòng)子活性
在pAKC6中的片段片段大小 (bp)(mg/mU谷氨酸棒桿菌 的氯霉素乙醆轉(zhuǎn)移SI 活性(U/mg)
Non605. 290, 15
(pAKC6對(duì)照)
』f判丄4373 to
』f判Z3. 9026,33
(pAKC6-trc對(duì)照) 二、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性的測(cè)定 通過對(duì)啟動(dòng)子探測(cè)載體pAKC6上的報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶酶活的測(cè)定，比較 本發(fā)明的啟動(dòng)子活性片段與常用于谷氨酸棒桿菌中的trc啟動(dòng)子在谷氨酸棒桿菌10147中 的活性。 參照方法(Shaw W V， Method in Enzymology， 43 :737-755,1975)進(jìn)行，1. Oml反 應(yīng)體系含lOOmM Tris-HC1(PH7.8)，0. ImM acetyl-CoA， 0. 4mg/ml 5， 5' - 二硫(2-硝基苯 甲酸)[DTNB]，適量體積的粗酶液；將反應(yīng)混合液在水浴中加熱到37t:后，加入氯霉素使其 終濃度為O. lmM，混勻，立即測(cè)定OD^ ;以未加氯霉素的反應(yīng)液為對(duì)照。每個(gè)樣品測(cè)定三次， 取平均值作酶活曲線。 CAT活性單位的定義一個(gè)活力單位(U)為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘乙酰化 lymol氯霉素所需的酶量。 結(jié)果如表1所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子活性片段能在棒桿菌細(xì)菌中有效 表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。具體地，SEQ ID NO:l啟動(dòng)子活性片段在棒桿菌中顯示出高 活性，該活性比trc啟動(dòng)子(SEQ ID NO :2)的活性更高。
序列表 〈110〉中國科學(xué)院微生物研究所 〈120〉源自谷氨酸棒桿菌的啟動(dòng)子及其應(yīng)用 〈130〉CGGNAL92649 〈160>4 〈210>1 〈211>437 〈212>DNA 〈213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutami固) 〈400〉 1 gatccgctgg aaacccgaca gacgtcgaaa agcctggtcg ctcgcgcaag acgcgccggg c朋tgcateg 3ggggcc朋3 gccaagacct ggttacgctt gg朋3朋tte gcgcatcagg aaactttaga tttcctaatg tgtggcatta cttgatc 〈210>2 〈211>295 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>2 ggtaccgcga attgatctgg ctggcgtcag gcagccatcg aattcgtgtc gctcaaggcg acggttctgg caaatattct gtgtggaatt gtgagcggat 〈210>3 〈211>25 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>3 aaaaggtgtc aacctcgata atttg 25 〈210>4
agccgtettg gccgtcaaag actggattga aggggaggga 60
tgcggcgctt gccgccgcaa ctcgcctgag cgtccgactg 120
aaacagcgtg gaggtgcggg tecccccatt tgttgcggtg 180
3C3tecacgc ggc3C3ccac cc朋cgtggt ggagaccgac 240
3gc朋ctggg C3朋cc3cat ttgatgcag3 atttg朋3gc 300
tecccgagcc aaagagattg cggactggtt accagtggtc 360
ctcattegtt tctgggcaac cgacagacta cgatttgacc 420
437
tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt
60
gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat 120
cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcate 180
g朋3tgagct gttgac朋tt朋tcatccgg ctcgtet朋t 240
朋c朋tttca c3C3gga朋c 3g3ccatgg3 agctt 295
<211>25 <212〉DNA 〈213>人工序列 〈220〉 <223> [O川]〈400>4 gaacggtctg gttataggta cattg
權(quán)利要求
一種啟動(dòng)子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。
2. 含有權(quán)利要求l所述的啟動(dòng)子的重組載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子插入載體pAKC6多克隆位點(diǎn)制成的重組載體。
4. 含有權(quán)利要求l所述的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5. 含有權(quán)利要求l所述的啟動(dòng)子的重組菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的原核細(xì)菌，所述原核細(xì)菌是如下1)或2)或3):1) 棒桿菌屬細(xì)菌2) 埃希氏菌屬細(xì)菌3) 棒桿菌屬或埃希氏菌屬細(xì)菌經(jīng)誘變得到的突變菌株。
7. 權(quán)利要求l所述的啟動(dòng)子在棒桿菌屬或埃希氏菌屬細(xì)菌中啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。本發(fā)明的提供的啟動(dòng)子可以用在以棒桿菌屬或埃希氏菌屬細(xì)菌為工業(yè)微生物的生物工程領(lǐng)域中。實(shí)驗(yàn)證明來自SEQ ID NO1的啟動(dòng)子活性片段在棒桿菌屬細(xì)菌中具有比trc啟動(dòng)子(SEQ ID NO2)更高的活性。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101698845SQ20091021096
公開日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者丁久元, 劉桂明, 張英姿, 李開, 王宇, 趙 智 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所