專利名稱：：植物子房注射轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：生物技術(shù)(biotechnology)又稱生物工程(bioengineering)，是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計、構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種、新品種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的綜合技術(shù)體系。通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞是現(xiàn)代遺傳育種的重要途徑，外源基因轉(zhuǎn)化，整合到受體植物細(xì)胞基因組中是植物基因工程的重要環(huán)節(jié)。但目前研究的瓶頸在于遺傳轉(zhuǎn)化的效率，因此高效遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究在生物工程領(lǐng)域中尤其重要。經(jīng)過十多年的研究，目前已建立多種基因轉(zhuǎn)化方法，得到一大批有價值的轉(zhuǎn)化外源基因的工程植株。遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株可分成兩大類，第一類需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；另一類方法則不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法及子房注射法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于一些雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應(yīng)用。根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法是目前研究最多，理論機(jī)理相對清楚，技術(shù)方法最成熟的基因轉(zhuǎn)化途徑。但是，對于一些組培再生能力極其困難的植物來說，該方法的應(yīng)用卻存在這一定的局限性。基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法基因槍技術(shù)(Particlegun)又稱微粒轟擊技術(shù)(Particlebombardmenttechnology)、生物彈道技術(shù)(Biolistictechnology)，其原理是采用一種微粒加速裝置，使裹著外源基因的金?；蜴u粒獲得足夠高的動量后，打入受體細(xì)胞或組織，并釋放出外源DNA，使DNA在植物細(xì)胞中整合表達(dá)，從而實現(xiàn)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。根據(jù)微粒加速系統(tǒng)的不同可以將基因槍分為火藥引爆型(G皿power)、壓縮氣體型(Pneumatic)和高壓放電型(Electricdischarge)等3種類型，目前，廣泛應(yīng)用的是以高壓氦氣為加速動力的氣動式基因槍。3種槍型在轉(zhuǎn)化原理、可控度、入射深度及轉(zhuǎn)化效率等方面都有差異?；鹚幨交驑尩牧Ｗ铀俣戎饕芑鹚幍臄?shù)量及射程控制，不能無級調(diào)速，可控度較低，不能使微彈均勻有效地分布，轉(zhuǎn)化效率較低，且易使樣品受到污染。壓縮氣體型基因槍的動力系統(tǒng)由氦氣、氮?dú)饣蚨趸嫉葋眚?qū)動，可以通過調(diào)節(jié)氣體壓力有效地控制粒子的運(yùn)行速度，可控度高，金屬粒子分布較均勻，每槍之間的差異小，轉(zhuǎn)化效率較高。高壓放電型基因槍可通過改變工作電壓準(zhǔn)確地控制粒子速度和射入深度，使載有DNA的金屬粒子能夠達(dá)到較深的細(xì)胞層，因此可以有效地轉(zhuǎn)化各種類型的器官和組織，且轉(zhuǎn)化效率較高。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對簡單，因此也是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。但是，此種方法成本較高，儀器昂貴，而且也要通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株。所以，該方法在實際應(yīng)用中也受著某些方面的限制?；ǚ酃芡ǖ婪ㄔ谑诜酆笙蜃臃孔⑸浜康幕虻腄NA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。子房注射法子房注射法是對整體植株的早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA，直接將質(zhì)粒DNA注射到植物的子房。此法更適用于子房較大的植物，如甜瓜、黃瓜、西瓜等。采用這種方法，無需進(jìn)行細(xì)胞或原生質(zhì)體的組織培養(yǎng)，可以在田間或溫室進(jìn)行。比花粉管通道或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等其它方法導(dǎo)入外源DNA更簡單。二甲基亞砜(DMSO)是一種含硫有機(jī)化合物。它是一種滲透性保護(hù)劑，對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，提高細(xì)胞膜對水的通透性。本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)利用1-2X的匿S0溶解表達(dá)載體質(zhì)粒DNA進(jìn)行植物的子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化能有效的提高轉(zhuǎn)化效率，在現(xiàn)在文獻(xiàn)中未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明主要涉及利用子房注射法轉(zhuǎn)化植物的方法，包括以下步驟，選晴天上午對植物花朵進(jìn)行授粉，次日上午進(jìn)行子房注射；將微量注射器吸入2-3iUDNA溶液(優(yōu)選為載體質(zhì)粒DNA溶液)，將針頭慢慢伸入子房3-4mm，迅速將DNA注入子房。待種子成熟后收獲種子，種植。所述DNA溶液含有重量比濃度為1_2%的二甲基亞砜，濃度為l-50iig/iU的DNA，其余為水。DNA濃度對于轉(zhuǎn)化的效率影響不大，優(yōu)選DNA含量為l-3yg/yl。所述植物優(yōu)選為瓜類植物，如黃瓜、甜瓜等，轉(zhuǎn)化效果更加明顯。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.子房注射法是對整體植株的早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA，直接將質(zhì)粒DNA注射到植物的子房。比花粉管通道或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等其它方法導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)更簡單，而且較容易掌握。2.子房注射法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，不需要裝備精良的實驗室，無需進(jìn)行細(xì)胞或原生質(zhì)體的組織培養(yǎng)，可以在田間或溫室進(jìn)行。很大程度上節(jié)省了裝備精良實驗室以及培訓(xùn)組織培養(yǎng)技術(shù)工人等的財力開支。3.利用DMSO溶解表達(dá)載體質(zhì)粒DNA進(jìn)行的子房注射能顯著提高植物的轉(zhuǎn)化效率，特別是甜瓜，解決了甜瓜利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的難度問題。而且該方法可以進(jìn)一步應(yīng)用于子房較大、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化極其困難的其它瓜類植物。對瓜類植物的基因工程研究與應(yīng)用具有重要價值。圖1子房注射法對甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化操作示意圖。圖2甜瓜果實酸性轉(zhuǎn)化酶基因RT-PCR產(chǎn)物。其中泳道1為目的基因的PCR產(chǎn)物，泳道2為DNAMARKER。圖3不同植物酸性轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列同源性比較I:Melon(AF490425);II:Tomato(Z12026);111:Potato(AY341425);IV:Sweetpotato(AY037937);V:Carrot(X75351);VI:Orange(AF433643)。圖4反義AI基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。圖5PCR鑒定結(jié)果。泳道1-10為轉(zhuǎn)基因植株；泳道11為未轉(zhuǎn)基因植株；泳道12為陽性對照；泳道M為MarkerDL2000。圖6Northernblot鑒定結(jié)果。5，10，15，20，25，30DAP為果實授粉天數(shù)后的RNA，Wildtype為對照(非轉(zhuǎn)基因)，T-4為轉(zhuǎn)基因果實。圖7反義表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切及PCR驗證。泳道1為A-HindIIIDNAMarker;泳道2為酶切產(chǎn)物；泳道3為PCR產(chǎn)物。圖8果實發(fā)育過程中乙烯釋放量的變化。非轉(zhuǎn)基因(對照)果實采收在授粉后15，20天和成熟期(大約授粉后30天左右)。轉(zhuǎn)基因果實采收在授粉后15，20天和成熟期(大約授粉后25天左右)。圖9果實發(fā)育過程中糖含量的變化。轉(zhuǎn)基因株系T-3(A)，T-4(B)和T_6(C)以及非轉(zhuǎn)基因(對照)(D)。果實發(fā)育過程中蔗糖(A)，葡萄糖(參)，果糖(O)，和總糖()濃度。非轉(zhuǎn)基因果實采收在授粉后5，10，15，20，25和成熟期(大約授粉后30天左右)，轉(zhuǎn)基因果實采收在授粉后5，10，15，20和成熟期(大約授粉后25天左右)。具體實施方式實施例1(1)甜瓜果實酸性轉(zhuǎn)化酶基因AI片段的擴(kuò)增甜瓜自交系01-3(CucumismeloL.)播種于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站日光溫室，以開花后5d的果實為材料，提取總RNA。RNAPCRKit，pMD18-T載體和T4DNA連接酶均購自大連寶生物有限公司；DNAExtractionKit購自MBI公司；大腸桿菌DH5a由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院基因工程實驗室提供。RNA的提取采用異硫氰酸胍(GTC)-酸性酚-氯仿抽提法。按Genebank中公布的序列(AF490425)設(shè)計基因特異引物。按RNAPCRKit說明書，逆轉(zhuǎn)錄取1yL(約1yg)甜瓜果實總RNA于8.5iiL無RNA酶的無菌雙蒸水中，7(TC水浴10min，立即置冰上2min后，加入25mMol/LMgCl24iiL，10XRNAPCRBuffer2iiL，10mMol/L的dNTP2iiL，Rnaselnhibitor0.5liL，ReverseTranscriptase1uL(濃度為5U/L)禾口oligo(dT)-Adaptorprimer1uL置PCR儀中，反應(yīng)條件為42°C30min，99°C5min，5°C5min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，向反應(yīng)體系中加入下列成分；25mMol/LMgCl26iiL，10XRNAPCRbuffer8iiL，滅菌雙蒸水57.5iiL，引物GSP^iiL(濃度為20pMo1/iiL)，引物GSP24iiL(濃度為20pMo1/iiL)，TakaraLATaq酶0.5iiL(濃度為5U/ii1)總體積100iiL。PCR反應(yīng)參數(shù)為94"C預(yù)變性5min，隨后94°Clmin，50°Clmin，72。C2min，30個循環(huán)后，72。C再延伸10min。PCR產(chǎn)物純化后直接與pMD18-T(大連寶生物T載體試劑)載體連接、測序。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2法。利用DNAman、DNAclub軟件及NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列分析。(2)反義AI表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在pMD18-T載體上的甜瓜AI基因用HincII和KpnI于37。C條件下進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后用回收試劑盒回收約1038bp的片段，將該片段與經(jīng)KpnI和SmaI酶切的植物表達(dá)載體PR0K2(該表達(dá)載體由本實驗室構(gòu)建，也可用其它的類似植物表達(dá)載體構(gòu)建)用T4DNA連接酶于16t:條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，過夜。這樣獲得的重組質(zhì)粒中AI片段反向插入35S啟動子之后，NOS之前。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，從Km平板上挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定。從Km平板上挑取單菌落，用堿變性法從培養(yǎng)的大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，做酶切及PCR驗證，(電泳結(jié)果如圖7)。鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了甜瓜果實AI基因的反義表達(dá)載體。質(zhì)粒載體DNA分別溶于二甲基亞砜水溶液和無菌雙蒸水(對照)中，DNA濃度為1iig/ii1，二甲基亞砜的濃度為重量比2%。用于對甜瓜的子房轉(zhuǎn)化。(3)子房注射法對甜瓜的轉(zhuǎn)化上午9點(diǎn)左右對甜瓜進(jìn)行自交授粉，掛牌標(biāo)記，次日上午9點(diǎn)左右進(jìn)行子房注射，微量注射器用70X酒精消毒后，吸入上述反義表達(dá)載體質(zhì)粒DNA溶液，將針頭伸入子房3-4mm，每個子房注射2.0yL，具體操作如圖1所示。收獲種子，并再種植。A匿SO溶解表達(dá)載體質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率分別收獲用匿SO和無菌雙蒸水溶解的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA的甜瓜果實，統(tǒng)計飽滿種子數(shù)目。然后將這些種子播于日光溫室，苗期提取DNA進(jìn)行PCR(如圖5所示)初步鑒定，鑒定出的陽性植株進(jìn)一步做SouthernBlot鑒定。鑒定結(jié)果表明匿SO作為質(zhì)粒溶劑的轉(zhuǎn)化率為1.91%，大約是用無菌雙蒸水作為質(zhì)粒溶質(zhì)的轉(zhuǎn)化率的三倍。匿SO能夠顯著提高子房注射法對甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化效率，可能是因為匿SO是一種滲透性保護(hù)劑，它能促進(jìn)表達(dá)載體質(zhì)粒DNA迅速透入細(xì)胞，從而提高轉(zhuǎn)化效率。表1子房注射法介導(dǎo)的甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>B轉(zhuǎn)基因植株的Northernblot檢測大量提取PCR檢測陽性植株(DMSO為溶劑)和非轉(zhuǎn)基因(野生型)植株果實發(fā)育各時期的總RNA。以甜瓜酸性轉(zhuǎn)化酶基因3'非編碼區(qū)片段作為探針，按照DIGHighPrimeRNALabelingandDetectionStarterKitII說明書進(jìn)行探針合成及檢測。電泳，轉(zhuǎn)膜，預(yù)雜交，雜交，洗膜，顯影和曝光等雜交操作嚴(yán)格按照DIGHighPrimeR亂abelingandDetectionStarterKitII說明書的要求進(jìn)行。Northernblot結(jié)果表明反義酸性轉(zhuǎn)化酶基因在mRNA水平上得到了表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株果實各發(fā)育時期酸性轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)明顯受到抑制(如圖6所示)。C轉(zhuǎn)基因甜瓜縮短了果實生育期，果實乙烯釋放量顯著提高在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甜瓜(匿S0為溶劑)果實在花后25天即達(dá)到成熟，比對照果實提早5天成熟。為了探明反義AI基因?qū)μ鸸瞎麑嵃l(fā)育的影響，我們測定了轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(野生型)果實發(fā)育過程中乙烯釋放量，結(jié)果表明非轉(zhuǎn)基因甜瓜自交系M01-3果實屬于乙烯誘導(dǎo)的呼吸躍變類型，而轉(zhuǎn)基因果實改變了這種呼吸躍變。在果實發(fā)育的早期，轉(zhuǎn)基因果實中乙烯釋放量很低，比非轉(zhuǎn)基因果實低了大約260%;而在果實的成熟階段，轉(zhuǎn)基因果實中乙烯釋放量比非轉(zhuǎn)基因果實中高了160%(如圖8所示)。D轉(zhuǎn)基因甜瓜果實含糖量顯著提高甜瓜品質(zhì)主要決定于果實中可溶性糖的含量，甜瓜果實中主要的可溶性糖是蔗糖、果糖和葡萄糖。其中蔗糖含量達(dá)到總糖含量的60_70%左右，所以蔗糖含量是甜瓜品質(zhì)優(yōu)劣的主要決定因素。我們利用毛細(xì)管電泳檢測了轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(野生型)果實中可溶性糖的含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因果實中果糖和葡萄糖含量幾乎沒有變化，而蔗糖含量顯著提高，轉(zhuǎn)基因果實中蔗糖含量比非轉(zhuǎn)基因果實中蔗糖含量提高了40%左右(如圖9所示)。說明甜瓜反義酸性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)μ鸸限D(zhuǎn)化的成功，也進(jìn)一步證明了子房注射法在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化中的成功應(yīng)用。實施例2:該實施例中，其轉(zhuǎn)化方法同實施例l，不同的是質(zhì)粒載體DNA分別溶于二甲基亞砜水溶液和無菌雙蒸水(對照)中，DNA濃度為3iig/ii1，二甲基亞砜的濃度為重量比1%。鑒定結(jié)果表明匿SO作為質(zhì)粒溶劑的轉(zhuǎn)化率為1.93%，大約是用無菌雙蒸水作為質(zhì)粒溶質(zhì)的轉(zhuǎn)化率的3倍。實施例3:該實施例中，其轉(zhuǎn)化方法同實施例l，不同的是質(zhì)粒載體DNA分別溶于二甲基亞砜水溶液和無菌雙蒸水(對照)中，DNA濃度為50iig/iil，二甲基亞砜的濃度為重量比1%。鑒定結(jié)果表明匿SO作為質(zhì)粒溶劑的轉(zhuǎn)化率為2.15%，大約是用無菌雙蒸水作為質(zhì)粒溶質(zhì)的轉(zhuǎn)化率的3.3倍。權(quán)利要求一種利用子房注射轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征包括以下步驟選晴天上午對植物花朵進(jìn)行授粉，次日上午進(jìn)行子房注射；將微量注射器吸入2-3μlDNA溶液，將針頭慢慢伸入子房3-4mm，迅速將DNA注入子房，待種子成熟后收獲種子，種植；所述DNA溶液含有重量比濃度為1-2％的二甲基亞砜，濃度為1-50μg/μl的DNA，其余為水。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的DNA溶液為載體質(zhì)粒DNA溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述DNA溶液的DNA含量為1_3yg/。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述的植物為甜瓜。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，利用子房注射法將溶于二甲基亞砜溶液的載體質(zhì)粒DNA高效地直接導(dǎo)入植物體內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因植物。文檔編號C12N15/82GK101696422SQ20091021109公開日2010年4月21日申請日期2009年11月12日優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日發(fā)明者于喜艷,孔慶國,田紅梅,聞小霞申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué);