專利名稱：鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3及其單克隆抗體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及青蟹養(yǎng)殖生物技術領域，尤其涉及鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3 及其單克隆抗體和應用。
背景技術：
鋸緣青蟹Mud crab(Scylla serrata)，俗稱青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的熱 帶、亞熱帶海域，是經(jīng)濟價值很高的食用蟹類，為名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一。 病毒病是鋸緣青蟹養(yǎng)殖過程中的主要病原，其造成青蟹養(yǎng)殖業(yè)的嚴重經(jīng)濟損失， 因此鋸緣青蟹養(yǎng)殖過程中，對各類病毒病的研究是當前的重要課題。 2004年始在珠海發(fā)現(xiàn)患"嗜睡病"(SD)的鋸緣青蟹同時存在兩種病毒鋸緣青蟹 雙順反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)禾口呼腸孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。
MCDV是水生甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)，其單獨存在就可以使 鋸緣青蟹致病，而且死亡率可達80%以上，因此對MCDV的感染機制和致病性進行研究，在 青蟹養(yǎng)殖業(yè)中及時監(jiān)測MCDV的發(fā)病情況，尋找有效的預防和防治方法，是當前鋸緣青蟹養(yǎng) 殖需要解決的重要問題。 雙順反子病毒(dicistrivirus)是一個新分類的病毒屬，隨著海洋病毒學的不斷 深入，越來越多的水生生物的雙順反子病毒被發(fā)現(xiàn)，但是其結(jié)構(gòu)蛋白還未見研究，有關鋸緣 青蟹雙順反子病毒(MCDV)的結(jié)構(gòu)蛋白的研究也未見有相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種鋸緣青蟹雙順反子病毒的結(jié)構(gòu) 蛋白3。 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆 抗體。 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述單克隆抗體在制備檢測MCDV病毒試劑盒或膠 體金試紙中的應用。 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述單克隆抗體在制備預防或治療水生生物細菌 病的抗菌劑中的應用。 本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的 本發(fā)明人從同時存在于鋸緣青蟹的兩種病毒(MCDV和MCRV)中分離純化出MCDV， 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其直徑為20 30nm，球形，無囊膜，呈二十面體對稱，在CsCl中的浮力密度為 1. 32 1. 36g/cm3，核酸性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)此病毒基因組為單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)。
本發(fā)明人對MCDV的基因組分析發(fā)現(xiàn)其包含有被基因間非編碼區(qū)(IGR)隔開的兩 個開放讀碼框0RF1和0RF2，其中，0RF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，0RF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白。
本發(fā)明人對0RF2進行進一步地研究發(fā)現(xiàn)，0RF2由三個結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別是分子 量為53KD的結(jié)構(gòu)蛋白3(簡稱VP1)、分子量為35KD的結(jié)構(gòu)蛋白2(簡稱VP2)和分子量為
322KD的結(jié)構(gòu)蛋白3 (簡稱VP3)。 接著，本發(fā)明人對結(jié)構(gòu)蛋白3進行了一系列的研究分析，如下所示 1 、氨基酸序列及其編碼核苷酸序列 結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示； 編碼結(jié)構(gòu)蛋白3的核苷酸序列，如SEQ ID NO :1所示。 2、單克隆抗體的獲得 首先本發(fā)明人采用全病毒也就是MCDV作為抗原，進行體內(nèi)免疫試驗，然后采用 HAT與HT選擇雜交瘤細胞、間接ELISA法篩選陽性單克隆抗體，接著利用Western blot方 法從陽性單克隆抗體中將結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體篩選出來，最終獲得4株能識別MCDV結(jié) 構(gòu)蛋白3的單克隆抗體。
3、結(jié)構(gòu)蛋白3的定位 本發(fā)明人在MCDV病毒分離純化的基礎上，對其三個結(jié)構(gòu)蛋白的N端氨基酸進行了 測序，并與MCDV的基因組序列對比和結(jié)構(gòu)分析，在MCDV基因組中找到了三個結(jié)構(gòu)蛋白的相 應位置。 為了進一步對結(jié)構(gòu)蛋白3精確定位，本發(fā)明人采用免疫電鏡方法，觀察上述 Western blot結(jié)果中，結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體所識別的抗原決定簇的位置，電鏡結(jié)果顯 示，該抗原決定簇定位于病毒粒子的邊緣，從而實現(xiàn)了對MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的精確定位。
本發(fā)明篩選到的MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體可用于MCDV的感染機制和致病性 研究，用于青蟹養(yǎng)殖業(yè)中及時監(jiān)測MCDV的發(fā)病情況，用于鋸緣青蟹雙順反子病毒(MCDV)活 體的中和作用，以及用于制備體外檢測樣品中是否存在MCDV病毒的試劑盒或膠體金試紙 條。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果 1.本發(fā)明通過對MCDV進行研究分析，首次獲得其結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列、核苷 酸序列和單克隆抗體，并對該結(jié)構(gòu)蛋白3進行了定位，為鋸緣青蟹的病毒病研究提供了新 的研究方向； 2.本發(fā)明篩選到結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體可用于MCDV監(jiān)控和檢測的多個方面。


圖1為實施例1中純化MCDV的SDS-PAGE電泳圖； 其中，M為蛋白marker, 1 5為純化的MCDV粒子，6為53KD的MCDV-VP1 ， 7為35KD 的MCDV-VP2， 8為22KD的MCDV-VP3 ; 圖2為實施例4中MCDV-VP3表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為蛋白Marker, 1和2為pET-VP3在lmM IPTG 37tH秀導5h， 3和4為純化
的MCDV ; 圖3為實施例5中單克隆抗體識別蛋白的Western-blot電泳圖； 其中，M為蛋白Marker, 1為純化的MCDV-VP3重組蛋白，2、3和4為三株能識別
MCDV-VP3的單克隆抗體，箭頭所指為目標蛋白。 圖4為實施例6中識別MCDV-VP3的單克隆抗體的免疫電鏡圖； 其中，1為能識別MCDV-VP3的單克隆抗體，2為陰性對照，bars = 20nm。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任 何限定。 實施例1MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的獲得 本實施例通過對MCDV純化、N端測序與分析，得到結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列和核 苷酸序列，并對結(jié)構(gòu)蛋白3進行生物學分析，預測其理化性質(zhì)及保守功能結(jié)構(gòu)域，為MCDV結(jié) 構(gòu)蛋白的功能研究奠定基礎，其具體步驟如下所示。
1. MCDV的純化 (1)稱量病蟹的鰓樣品約15g，液氮下迅速研磨至粉末狀；
(2)將研好的粉末倒入250ml離心管中，按20倍體積的量加入PBS，勻漿；
(3)將勻漿后的病毒液4。C離心除渣1000rpm離心20min ;轉(zhuǎn)向后3000rpm離心 3min ;上清轉(zhuǎn)入新管，平衡后，12000 15000rpm高速離心1小時； (4)收集上述離心上清液，再次44000rpm (200000 X g)離心2小時或者
33000rpm(150000Xg)離心7 10小時，沉淀病毒; (5)將沉淀的病毒粒子中加入0. 5ml PBS分散過夜； (6)制備CsCl密度梯度分別用質(zhì)量百分比濃度為15%、25%、35%和45%的 CsCl溶液先輕后重依次加入SW41透明離心管中； (7)將分散過夜的病毒粒子加入CsCl梯度的最上層，35000rpm超速離心10小時 左右； (8)吸出病毒條帶，在35質(zhì)量X蔗糖墊上，用PBS洗滌，35000rpm超速離心2小 時； (9)初步純化的每條帶的病毒液分別上第二次CsCl梯度，重復步驟(7)， (S)，所述 CsCl梯度同步驟(6); (10)收集純化病毒液，取其中5 10 ill fC保存，以備及時測定病毒濃度和電鏡 觀察，其余-S(TC保存?zhèn)溆谩?2.純化MCDV的濃度測定、電鏡觀察和SDS-PAGE鑒定 取2 5iU上述新鮮純化的病毒液，用紫外分光光度計粗略測定病毒濃度，結(jié)果 為2. 83ii g/iU。 取5iU病毒懸液滴到噴有碳粉的銅網(wǎng)上，吸附lmin，用濾紙吸干懸液；然后，用 2%的磷鎢酸溶液染色40秒，再用濾紙吸去多余染液；燈照烘干，用Philips-CMIO透射電子 顯微鏡觀察病毒的形態(tài)、數(shù)量和種類，通過統(tǒng)計多個視野中兩種病毒粒子的數(shù)量計算其純 度，結(jié)果為99. 99%。 取10 iil上述新鮮純化的病毒液，進行常規(guī)的SDS-PAGE電泳，觀察電泳結(jié)果中的 蛋白帶型，結(jié)果如圖1所示，純化的MCDV經(jīng)SDS-PAGE電泳，可見清晰的VP1、 VP2、 VP3三條 蛋白帶，與預期的MCDV的三個結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)相一致，分別命名為VP1、VP2、VP3，分子量大小分 別為53KD、35KD、22KD。 實施例2MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的序列測定及生物學分析根據(jù)實施例1中的SDS-PAGE電泳結(jié)果，MCDV含有分子量為53KD的結(jié)構(gòu)蛋白3 (簡稱VP1)、分子量為35KD的結(jié)構(gòu)蛋白2(簡稱VP2)和分子量為22KD的結(jié)構(gòu)蛋白3 (簡稱VP3)。
本實施例對結(jié)構(gòu)蛋白3進行N端測序以及生物學分析。 按照本領域進行蛋白質(zhì)N端氨基酸測序的常規(guī)操作，首先制備MCDV的PVDF膜上， 選擇PVDF膜上的結(jié)構(gòu)蛋白3，進行N端氨基酸測序。
測序方法EDMAN降解法。測序儀器美國Applied Biosystems公司的PR0CISE491測序儀。
測序結(jié)果 結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示；
編碼結(jié)構(gòu)蛋白3的核苷酸序列，如SEQ ID NO :1所示。
實施例3MCDV病毒cDNA的獲取 本發(fā)明人用Clontech公司SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒，構(gòu)建了斜帶石斑魚白細胞 cDNA文庫，通過隨機挑取克隆測序，并將測得序列用BLAST程序與Genbank序列進行比較， 獲得了 MCDV病毒cDNA。
1. MCDV總RNA的提取本實施例采用RNeasy Mini Kits(Qiagen)法提取總RNA : (1)將保存于-80°C的RLT細胞裂解液取出，于37。C融解約5min，稍微離心將液體 收集于管底； (2)各管加入350 ill (與裂解液等體積)70 %乙醇(DEPC處理水配制)，顛倒均勻 (可能會形成沉淀，但切勿離心)； (3)將上述液體700 iil (包括可能形成的沉淀)轉(zhuǎn)移至RNA Mini Column (試劑盒 提供)中，室溫下，10，000rpm離心15s，棄廢液; (4)力Q 350 ii 1 buffer RW1至RNA Mini Column中，室溫下，10， OOOrpm離心15s， 棄廢液； (5)配好DNase I消化液對每個柱子，10 u 1 DNase I stock solution+70 u 1 buffer RDD，輕輕混勻(切勿劇烈振蕩); (6)將上述DNase I消化液80 ii 1均勻加入柱中，20 30。C放置15min ; (7)加350 ii 1 buffer RW1至RNA Mini Column中，室溫下，10， OOOrpm離心15s，
棄廢液； (8)轉(zhuǎn)移RNA Mini Column至新的2ml收集管(試劑盒提供)中，加500 y lbuffer RPE (第一次使用前加入4倍體積的無水乙醇)，室溫下，10， OOOrpm離心15s，洗柱，棄廢液；
(9)往柱中加入500 ii 1 buffer RPE，室溫下，10， OOOrpm離心2min ;
(10)將柱子轉(zhuǎn)移至1. 5ml RNase-free收集管(試劑盒提供)，加入 20 ii lRNase-free洗脫RNA。 將提取所得總RNA經(jīng)過光密度測定和電泳分析，證實提取所得總RNA樣品完整，可 用于后續(xù)試驗。 采用常規(guī)操作對上述提取所得總RNA進行基因組DNA污染檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得總 RNA中無基因組DNA污染。
2. RT-PCR
(1)逆轉(zhuǎn)錄反應
6
取上述提取的總RNAO. 6ii g，加DEPC處理的無菌水至5 iU，混勻后，短暫離心，收
集液體于管底，95t:孵育5min(PCR儀)后，取出置于冰上，再加入如下成分 dNTP(10mM) 1 ii 1 ; 9bp隨機引物(50-250ng) 1 iU ; DEPC處理的滅菌水 5 總體積 12iU。 輕輕搖勻后，短暫離心，收集液體于管底，25t:孵育10min(PCR儀)后，取出置冰 上，再加入下列成分 5 X Reverse Transcription Buffer 2 li 1
DTT(20mmol/L) 2 ii 1 RNAsin 1 u 1 M-MLV 1 ii 1 總體積 20 ill 。 再混勻離心，置于PCR儀，37"孵育50min，然后7(TC孵育15min。將上述合成的第 一鏈cDNA分裝成小管，-2(TC保存，用于后續(xù)PCR擴增的MCDVcDNA模板。
(2)引物設計 根據(jù)MCDV全基因組序列(Genebank accession no. AF389451)，利用軟件Primer Premier 5. 0與DNAstar進行引物設計，最后得到可用于擴增的一對引物，如下所示(括號 內(nèi)為引入的酶切位點) 上游引物P1 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示(Kpn I);
下游引物P2 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示(BamH I)。 (3) PCR擴增









PCR反應體系(50 ii 1): lOXpfu Buffer 5 ii 1 ;
10,1/L d證s 1 ii 1 ;
50iimol/L上下游引物(PI和P2) 各liU; MCDV cDNA模板 2 ii 1 ;
pfu高保真DNA聚合酶 0. 5 ill ;
超純水 39. 5 ill 。
PCR擴增反應
95。C變性3min ;95。C變性30sec，引物Tm值復性30sec，68。C延伸Xsec，72。C溫浴 10min共30個循環(huán)；4。C保存。 X表示延伸時間，不同大小片段的延伸時間各異。pfu的延伸速度為600 800bp/ miru PCR擴增完成后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物長度為567bp，與預期 大小相符。 (4)采用相關試劑盒，對上述擴增產(chǎn)物進行切膠回收、純化、酶切和T載體連接等， 這些步驟均為本領域技術人員進行PCR擴增后的常規(guī)操作，參考相關試劑盒的說明書操作 進行即可。
(5)插入子的PCR擴增 對上述載體連接后所得連接產(chǎn)物進行插入子的PCR擴增檢測，其步驟如下所示
從文庫平板隨機挑取單個噬菌斑，加至500iilA噬菌體稀釋液，室溫放置1 2h，以使噬菌體從瓊脂中釋放出來。取1 iU噬菌體做模板，用AdvantagecDNA PCR試劑盒 (Clontech)進行PCR，鑒定插入子的大小。
PCR擴增的引物為 上游引物P1 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示(Kpn I); 下游引物P2 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示(BamH I)。PCR反應混合液10XPCR緩沖液5ii 1， API和AP2引物(每種10 ii mol/L) 2 ii 1，
4 X dNTP混合液(每禾中10,1/L) 1 ii 1 ， cDNA聚合酶混合物1 ii 1 ，水40. 5 ii 1 。PCR循環(huán)參數(shù)94。C，10min ;30次循環(huán)94。C，30s ;68。C，3min。 68。C，3min。 PCR結(jié)
束后取5iU進行瓊脂糖凝膠電泳。大于500bp的PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒(購
自上海生工生物工程有限公司)進行回收純化。 經(jīng)上述PCR擴增檢測后，證實連接產(chǎn)物中確實含有目的基因片段的插入，因此將 連接產(chǎn)物送交生物公司進行序列測定。測序結(jié)果分析用美國國立生物技術信息中心(NCBI)的BLAST N和BLAST X工 具，與GenBank的數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。發(fā)現(xiàn)一個序列與其它抗菌肽的cDNA有一定的同 源性，經(jīng)分析確認為是MCDV的VP3-cDNA序列，該序列如序列表SQ ID NO :1所示。
實施例4MCDV-VP3在原核表達載體的重組表達
(1)重組質(zhì)粒的制備 本實施例采用CaCl2法制備DH5 a大腸桿菌細胞感受態(tài)細胞，并將實施例3制備
所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 a大腸桿菌細胞感受態(tài)細胞中，得到重組質(zhì)粒。本步驟涉及的感
受態(tài)細胞的制備以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，均采用本領域技術人員的常規(guī)操作。 本實施例將上述所得重組質(zhì)粒采用常規(guī)堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，提取的質(zhì)粒
DNA用BamH I和Kpn I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，取適量酶切反應液和DNA Marker共同進
行瓊脂糖凝膠電泳，對酶切片段的大小進行鑒定。 將酶切鑒定和PCR鑒定的質(zhì)粒DNA，送至Invetrogen測序，根據(jù)測序結(jié)果，將已經(jīng) 過鑒定無序列錯誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21 (DE3)感受態(tài)細胞。 [O1巧](2)重組蛋白的原核表達 上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落，經(jīng)搖床 活化過夜后，轉(zhuǎn)接于新鮮的LA液體培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)至OD,約為0.8-1.0 左右時，加入10Ommol/L IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2 3hr。取培養(yǎng)后的菌液 lml 12000rpm離心lmin收集菌體，盡可能地棄掉上清液，于沉淀中加適量的2 X SDS-PAGE上 樣緩沖液，充分打散后煮沸5 10min，取lOiU用于SDS-PAGE。 SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，重組蛋白(MCDV-VP3)的預測大小為38. 5KD，從圖
上的蛋白膠可以看出，本實施例的重組蛋白都有特異性表達帶。 實施例5MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體的制備 本實施例首先將實施例4制備所得重組蛋白MCDV-VP3的蛋白膠切下，浸提后作為 抗原，進行體內(nèi)免疫試驗，然后采用HAT與HT選擇雜交瘤細胞、間接ELISA法篩選陽性單克隆抗體，接著利用Western blot方法從陽性單克隆抗體中將結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體篩選 出來，最終獲得3株能識別MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體，具體步驟如下所示。
1.體內(nèi)免疫試驗 體內(nèi)免疫試驗的抗原將實施例4制備的重組蛋白MCDV-VP3的蛋白膠切下浸提后， 其操作采用本領域技術人員進行體內(nèi)免疫試驗時的常規(guī)操作，分別對BalB/C鼠和新西蘭 大白兔進行體內(nèi)免疫試驗，最后分別收集血液(分別為小白鼠的和大白兔的)，在室溫下放 置30min，待其凝固后，放置4t:過夜使血塊收縮，有血清析出。次日，吸出血清，其余的血液 于4t: 1500g離心10min，取上清液即為抗血清，與前面的血清混合，分裝，置-8(TC保存。
上述制備的抗血清中含有多種抗體，下面采用HAT與HT選擇雜交瘤細胞、和間接 ELISA法將其中的陽性單克隆抗體篩選出來，也就是將MCDV的單克隆抗體篩選出來。
2.陽性單克隆抗體的篩選 本實施例的HAT與HT選擇雜交瘤細胞、和間接ELISA法均采用本領域技術人員的
常規(guī)操作，篩選得到了 4株強陽克隆。 3.抗體識別蛋白的Western-blot鑒定 本實施例的Western-blot采用本領域技術人員的常規(guī)操作，其電泳圖如圖3所示。 從圖3中可以看出，用上述間接ELISA法篩選得到的4株強陽性、效價高的抗 MCDV-VP3單抗做為第一抗體進行MCDV蛋白抗原決定簇的檢測。純化的MCDV-VP3重組蛋 白Western-blot實驗結(jié)果顯示，有3株可以在病毒中找到與推測大小一致的單一條帶單 抗識別MCDV-VP3，大約22KD。 實施例6MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3的免疫電鏡定位 為了確定MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3在病毒粒子上的定位，本實施例采用實施例5制備所得
MCDV結(jié)構(gòu)蛋白3單克隆抗體，對結(jié)構(gòu)蛋白3進行間接免疫電鏡的細胞定位。 電鏡結(jié)果如圖4所示，結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體所識別的抗原決定簇的位置，定位
于病毒衣殼上，陰性血清作為一抗或者直接用PBS作陰性對照，而陰性對照的病毒粒子周
圍沒有金顆粒。 鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3及其單克隆抗體和應用序列表
SEQUENCE LISTING
〈110>中山大學 〈120〉鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3及其單克隆抗體和應用
〈130〉
〈160>5 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>576
〈212>DNA 〈213>鋸緣青蟹(Scylla serrata)
〈400〉 1 ggtggtggga tggattetgc teaatcagat tcttcttctt tegttecaac aatgggtgag 60
9
caatttcgttetcttegtet gctcactcgtcgctctegtc ctectgatgt tcttectggt120acctctgtcactctecctgg tettectettggtectgate gttctttgcg tcagagtgtt180tttcttetet gtetcgctttacteagggte gtetttcate tea皿ttett240acttctegtg ctgacaatet tgaatteaat300tcteatgcttattcctttga tgteaatcgtgctctecact atcaaaatec agectteaat360cctgtggttcaagttegtct accatettectgtccttctg aaaatctcgt aattgattct420acttcttttccteatctcag teatttegtttteacteacc tegagegtte tegteateca■tetectgttctggtcagtgc 3ggtg3tg3Ccatecttttt ctcaacttgc tgggtgtccc540gcctttectettggccccag caggtctgetgcttea576〈210>2〈211>576〈212>DNA〈213>鋸緣青蟹(Scylla serrata)〈220〉〈221>CDS〈22'2>(1)..(573)〈400>2ggtggt ggg atg gat tet get a朋tea gat tct tct tct tte gtt aca48GlyGly Gly Met Asp Tyr Ala Lys Ser Asp Ser Ser Ser Leu Val Thr1510 15atg ggtgag caa ttt cgt tct ctt cgt atg etc act cgt cgc tct96ThrMet Gly Glu Gin Phe Arg Ser Leu Arg Met Leu Thr Arg Arg Ser2025 30Elgtcct actgat gtt ctt act ggt acc tct gtc act cte cct ggt att144SerPro Thr Asp Val Leu Thr Gly Thr Ser Val Thr Leu Pro Gly lie354045actatt ggt act gat agt tct ttg cgt cag agt gtt tte aat att att192Thrlie Gly Thr Asp Ser Ser Leu Arg Gin Ser Val Leu Asn lie lie505560tcttat atg tat cgc ttt act aag ggt agt att tea tat aaa att att240SerTyr Met Tyr Arg Phe Thr Lys Gly Ser lie Ser Tyr Lys lie lie657075 80cctaaa att aag ggt gat ctt tat ate acc act tct agt get gac aat288ProLys lie Lys Gly Asp Leu Tyrlie Thr Thr Ser Ser Ala Asp Asn8590 95attg朋tteaat tct aat get tat tec ttt gat gta aat cgt get eta336lieGlu Leu Asn Ser Asn Ala Tyr Ser Phe Asp Val Asn Arg Ala Leu100105 110C3Ctat caaaat aca gcc tta aat cct gtg gtt caa gtt agt eta cca384
10
HisTyrGinAsnThr AlaLeuAsnPro Val Val Gin ValSerLeuPro115120125tattactgtcct tct gaa aat etc gta att gat tct act tcttttcctTyrTyrCys ProSer GluAsnLeuVal lie Asp Ser ThrSerPhePro130135140朋tetcagt aat tte gtt tta act aac etc gag cgt tct agt朋tAsnLeuSerAsnLeu ValLeuThrAsn Leu Glu Arg SerSerAsnThr145150155160tatactgttctg gtc agt gca ggt gat gac cat act ttt tctc朋cttTyrThrValLeuVal Ser Ala Gly Asp Asp His Thr PheSerGinLeu165170175getgggtgtccc gcc ttt act att ggc ccc age agg tct getget taaAlaGlyCys Pro Ala Phe ThrlieGly Pro Ser Arg SerAlaAla180185190〈210>3〈211>191〈212>PRT〈213〉鋸緣青蟹(Scylla serrata)〈400>3GlyGlyGlyMetAsp TyrAlaLysSer Asp Ser Ser SerLeuValThr151015ThrMetGlyGluGin PheArgSerLeu Arg Met Leu ThrArgArgSer202530SerProThrAspVal LeuThrGlyThr Ser Val Thr LeuProGlylie354045ThrlieGlyThrAsp SerSerLeuArg Gin Ser Val LeuAsnlielie505560SerTyrMetTyrArg PheThrLysGly Ser lie Ser TyrLyslielie65707580ProLyslieLysGly AspLeuTyrlie Thr Thr Ser SerAlaAspAsn859095lieGluLeuAsnSer AsnAlaTyrSer Phe Asp Val AsnArgAlaLeu100105110HisTyrGinAsnThr AlaLeuAsnPro Val Val Gin ValSerLeuPro115120125TyrTyrCysProSer GluAsnLeuVal lie Asp Ser ThrSerPhePro130135140AsnLeuSerAsnLeu ValLeuThrAsn Leu Glu Arg SerSerAsnThr145150155160
Tyr Thr Val Leu Val Ser Ala Gly Asp Asp His Thr Phe Ser Gin Leu
165 170 175 Ala Gly Cys Pro Ala Phe Thr lie Gly Pro Ser Arg Ser Ala Ala
180 185 190 〈210>4 〈211>31 <212>DNA 〈213〉人工合成 〈400〉4 ggggtaccat ggattatgct aaatcagatt c 31 〈210>5 〈211>31 〈212〉DNA 〈213〉人工合成 <400>5 cgggatcctt aagcagcaga cctgctgggg c 3權利要求
一種鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
2. —種編碼權利要求1所述結(jié)構(gòu)蛋白3的DNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO :1所
3. —種與權利要求1所述結(jié)構(gòu)蛋白3特異性結(jié)合的單克隆抗體。
4. 權利要求3所述單克隆抗體在制備檢測MCDV病毒試劑盒中的應用。
5. 權利要求3所述單克隆抗體在制備檢測MCDV病毒膠體金試紙中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3及其單克隆抗體和應用，該鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明通過對MCDV進行研究分析，首次獲得其結(jié)構(gòu)蛋白3的氨基酸序列、核苷酸序列和單克隆抗體，并對該結(jié)構(gòu)蛋白3進行了定位，為鋸緣青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向。本發(fā)明篩選到結(jié)構(gòu)蛋白3的單克隆抗體可用于MCDV監(jiān)控和檢測的多個方面，以及制備預防或治療鋸緣青蟹雙順反子病毒病的試劑盒或者金標試紙條。
文檔編號C12R1/93GK101717435SQ200910213700
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權日2009年12月8日
發(fā)明者何建國, 呂玲, 張銳, 翁少萍, 董傳甫 申請人:中山大學