專利名稱：：一種提高質(zhì)粒dna在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基屬于生物領(lǐng)域，特別是涉及一種培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：隨著近年來重組DNA技術(shù)和基因組測序的發(fā)展，基因治療和DNA疫苗研究領(lǐng)域取得重大進展。而攜帶有外源基因的質(zhì)粒DNA為基因治療和DNA疫苗研究開發(fā)中使用的主要藥物載體。目前，治療性的質(zhì)粒DNA臨床用量已達到了mg級，因此大量制備的質(zhì)粒DNA需要工業(yè)規(guī)模的大腸桿菌工程菌發(fā)酵技術(shù)來制備。在發(fā)酵工藝方面，早期的質(zhì)粒發(fā)酵培養(yǎng)基配來源于重組蛋白基因工程菌培養(yǎng)基。但由于與表達重組蛋白為目標的工程菌不同，以表達質(zhì)粒DNA為目標的大腸桿菌工程菌的發(fā)酵工藝不需要考慮其蛋白表達產(chǎn)物的影響因素，而僅需為細菌的大量增殖和內(nèi)含質(zhì)粒的高效擴增提供最適的發(fā)酵條件，因此運用于蛋白發(fā)酵的培養(yǎng)基不一定適用于質(zhì)粒DNA的發(fā)酵工藝。此后不斷有學(xué)者進行這方面的研究，如根據(jù)化學(xué)計量模式(stoichiometricmodel)的方法重新對培養(yǎng)基配方進行設(shè)計和優(yōu)化。在發(fā)酵策略方面，為了提高細菌發(fā)酵密度，與重組蛋白工程菌發(fā)酵工藝相似，現(xiàn)有的質(zhì)粒DNA發(fā)酵工藝普遍采用補料-分批發(fā)酵(fed-batch)的方法進行，即在發(fā)酵過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳源、氮源等營養(yǎng)成分衰竭時，通過限制性流加補料的方式提高菌體生長密度和目標產(chǎn)物的表達總量。到目前為止，現(xiàn)有文獻公開的質(zhì)粒DNA工程菌發(fā)酵工藝目標主要以提高質(zhì)?？偖a(chǎn)量或單位體積質(zhì)粒產(chǎn)量為目標。而良好的質(zhì)粒DNA發(fā)酵工藝除了能生產(chǎn)較高的質(zhì)粒DNA總量外，還應(yīng)能提高單位菌量的質(zhì)粒DNA含量，即質(zhì)粒DNA的比含量。質(zhì)粒DNA比含量的提高不僅減輕下游的純化負擔(dān)，還可減少試劑的消耗，節(jié)約成本。如現(xiàn)有的大規(guī)模質(zhì)粒純化制備是主要以發(fā)酵獲得的工程菌在堿裂解法的基礎(chǔ)上以色譜純化技術(shù)純化而得。由于一定的菌量對應(yīng)一定比例的堿裂解試劑，因此提高質(zhì)粒DNA比含量則意味著相同消耗量的堿裂解試劑可以得到更高含量質(zhì)粒原液，而且由于相應(yīng)降低了質(zhì)粒提取液中的宿主DNA、RNA、蛋白以及內(nèi)毒素的比例，意味減輕了下游分子篩排阻層析和離子交換色譜純化的負擔(dān)。已知增加質(zhì)粒DNA比含量的方法主要通過"饑餓效應(yīng)"，即通過非細菌菌體增殖的最適條件下，如碳源或氮源缺乏、較低的生長溫度、偏酸或偏堿的ra值和限制溶氧量等，菌體將減少RNA和蛋白質(zhì)的合成，而是趨向于將營養(yǎng)底物轉(zhuǎn)化成質(zhì)粒，從而提高菌體質(zhì)粒拷貝數(shù)。除了通過"饑餓效應(yīng)"提高質(zhì)粒DNA比含量外，現(xiàn)有發(fā)酵工藝的研究文獻并沒有通過培養(yǎng)基組分的優(yōu)化配置提高質(zhì)粒DNA比含量的方法。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的運用于質(zhì)粒DNA工程菌高密度表達的培養(yǎng)基雖然可以達到較高的菌體密度和質(zhì)?？偭康哪繕?，但質(zhì)粒DNA比含量普遍較低(質(zhì)粒DNA比含量小于1.6mg/g濕菌)。利用現(xiàn)有的培養(yǎng)基配方，即使在發(fā)酵工藝中用到"饑餓效應(yīng)"的策略后質(zhì)粒DNA比含量有了一定程度提高，但結(jié)果仍不令人滿意。為了有利于質(zhì)粒DNA的純化，有必要開發(fā)出一種適用于工程菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)且能顯著提高質(zhì)粒DNA比含量的培養(yǎng)基。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可以明顯提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質(zhì)粒DNA的合成效率，提高質(zhì)粒DNA比含量，對發(fā)酵培養(yǎng)基不同營養(yǎng)組分配比之間進行優(yōu)化的一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的是通過以下措施來達到的，本發(fā)明的培養(yǎng)基每升包含有下列配比組分酵母提取物(yeastextract)5.OOg/L甘油(glycerol)7.75ml/L硫酸銨((NH4)2S04)3.0g/L磷酸氫二鈉(Na2HP04)6.0g/L磷酸二氫鉀(KH2P04)3.0g/L檸檬酸(citricacid)1.7g/L硫酸鎂(MgS04)1.2g/L其中，酵母提取物(yeastextract)由英國0X0ID公司提供，產(chǎn)品型號LP0021。培養(yǎng)基用IMol/LNaOH等堿性溶液調(diào)pH值至7.0。在使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行質(zhì)粒DNA發(fā)酵時，按上述配比組分配制的培養(yǎng)基，在分批發(fā)酵(batchfermentation)模式下可單獨用于質(zhì)粒DNA工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)?？蛇\用"饑餓效應(yīng)"策略，如降低發(fā)酵溫度、限制溶氧值來進一步提高質(zhì)粒DNA比含量。在使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行質(zhì)粒DNA發(fā)酵時，按上述配比組分配制的培養(yǎng)基，在補料-分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)模式下，與補料培養(yǎng)基聯(lián)用，可用于高密度質(zhì)粒DNA工程菌發(fā)酵培養(yǎng)。可運用"饑餓效應(yīng)"策略，如降低發(fā)酵溫度、限制溶氧值來進一步提高質(zhì)粒DNA比含量。本發(fā)明的培養(yǎng)基能顯著提高質(zhì)粒DNA比含量水平，從而有利于下游質(zhì)粒DNA純化，提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質(zhì)粒DNA的合成效率，可減少試劑的消耗，節(jié)約成本。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1:不同培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵結(jié)果比較(l)實驗材料真核表達質(zhì)粒pcDNAS2S由解放軍458醫(yī)院肝病研究所構(gòu)建；宿主菌DH5a由拜迪公司保存；質(zhì)粒pcDNAS2S轉(zhuǎn)化DH5a，獲得工程菌DH5a/pS2S，拜迪公司保存；酵母提取物(YeastExtract)由英國0X0ID公司提供，產(chǎn)品型號LP0021、胰蛋白胨(Tryptone)購自0X0ID公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購自QIAGEN公司；紫外可見分光光度計，日本日立公司UV-300型。甘油(glycerol)、氯化鈉(NaCl)、葡萄糖(glucose)、擰檬酸(citricacid)、硫酸銨((朋4)2504)、硫酸鎂(MgS0》、磷酸鹽(Na2HP04、KH2P04)、氨芐西林(ampicillin，AMP)等，均為國產(chǎn)分析純。(2)實驗過程按表1配制培養(yǎng)基，分裝至三角錐瓶中(20ml/瓶)，滅菌后添加AMP至100yg/ml。于LB培養(yǎng)基中加入瓊脂(15g/L)，鋪平皿，接種工程菌，于37t:培養(yǎng)過夜。挑單個菌落，接種于5mlLB(含AMP100yg/ml)中，37。C振蕩培養(yǎng)至A6。。為0.6時，分別取菌液200ul接種到各培養(yǎng)基中按預(yù)設(shè)的培養(yǎng)參數(shù)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后分析收菌量(濕菌重)、質(zhì)粒含量(mg/L)，并計算質(zhì)粒含量對菌量的比值。表1培養(yǎng)基配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注配方I來源饒桂榮等。治療性雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗工程菌的中試發(fā)酵工藝研究，中國生物制品學(xué)雜志2007年2月第20巻第2期，第110-113頁。配方II來源MichaelK.etal.GrowthMediumSelectionandItsEconomiclmpactonPlasmidDNAProduction.JournalOfBioscienceAndBioengineering，Vol104(6)，490-497，2007.配方III來源Kevin0.etal.StrategiesforhightitreplasmidDNAproductioninEscherichiacoliDH5a，ProcessBiochemistry42，1039—1049，2007(3)實驗結(jié)果實驗結(jié)果見表2:表2DH5a/pS2S工程菌在不同配方培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表2可以看出，在不同的溫度、搖瓶速度的情況下，利用本發(fā)明配方配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)表達的質(zhì)粒DNA比含量都明顯高于其他配方的結(jié)果。實施例2:按照本發(fā)明配方配制的培養(yǎng)基大規(guī)模發(fā)酵工藝研究實驗(1)發(fā)酵采用fed-batch模式，發(fā)酵罐50L(德國B.Braun公司產(chǎn)品)，發(fā)酵培養(yǎng)基按具體實施例配方表1配制，配40L，發(fā)酵罐原位滅菌后備用。補料培養(yǎng)基配方如下YeastExtract100g/l，Glycerol400ml/L。共配IOL，滅菌備用。(2)實驗過程如下①搖瓶培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為本發(fā)明的培養(yǎng)基，用凍存菌種接種于搖瓶培養(yǎng)基中，37t:劇烈振蕩16hr至對數(shù)生長期(A6。。為0.8)。取400ml菌液接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，開始進行fed-batch模式的發(fā)酵培養(yǎng)②batch階段接種后首先為batch階段。在batch階段，溫度控制在35t:;通過補加10X濃氨水溶液控制pH值在7.0;d02控制在30X左右，開始階段攪拌速度設(shè)為200rpm，通氣量為40L/min。當(dāng)d02水平低于閾值28%時，攪拌速度增加10rpm以促使d02控制在30%，在batch階段攪拌速度最高值設(shè)為400rpm。在batch階段后期由于氧供應(yīng)不足d02將會下降，最低至2%左右。batchphase末期營養(yǎng)組分將消耗盡，此時工程菌代謝將趨于停止，故d02值將在短期內(nèi)躍升，當(dāng)d02達到15%時。發(fā)酵開始進入fed階段。③在fed階段，發(fā)酵溫度升至37°C;d02值依然控制在30%左右，當(dāng)d02值低于30%時攪拌速度以lOrpm的增幅增加，直至達到最高轉(zhuǎn)速(800rpm);在fed階段，當(dāng)d02值高于50%、pH值高于7.2時表明生長限制性的碳源缺失，此時按預(yù)設(shè)的補料速度進行補料(補料值為4mL/min)，直到d02值低于50%或pH值低于7.2時停止補料；在fed階段，通氣量保存不變，當(dāng)攪拌速度達到最高轉(zhuǎn)數(shù)時，d02因供氧矛盾而趨于下降，當(dāng)d02趨于零值時停止發(fā)酵。④在發(fā)酵過程中，每隔lh取樣，檢測菌密度、濕菌量和質(zhì)粒含量，并計算質(zhì)粒含量對菌量的比值。其中，質(zhì)粒抽提采用QIAGEN質(zhì)粒小量抽提試劑盒按操作說明進行。菌密度的測定采用紫外分光光度計測定600nm波長的A值。質(zhì)粒含量采用紫外分光光度計測定260nm波長的A值確定。質(zhì)粒純度的測定采用紫外分光光度計測定260nm、280nm波長的吸收比值確定(符合質(zhì)量標準的比值應(yīng)在1.75-1.85之間)，并進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描，并分析超螺旋質(zhì)粒的比例(符合質(zhì)量標準的超螺旋比值應(yīng)>90%)。實驗結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，利用本發(fā)明培養(yǎng)基的發(fā)酵工藝可制得大量的合符質(zhì)量標準的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA比含量可達到2.4，已超過現(xiàn)有文獻(饒桂榮等。治療性雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗工程菌的中試發(fā)酵工藝研究，中國生物制品學(xué)雜志2007年2月第20巻第2期，第110-113頁)報道的檢測結(jié)果。表3利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行DH5a/pS2S工程菌進行補料_分批(fed-batch)發(fā)酵的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基，其特征是每升包含有下列配比組分酵母提取物不是5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸銨3.0g/L，磷酸氫二鈉6.0g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L，檸檬酸1.7g/L，硫酸鎂1.2g/L，培養(yǎng)基用1Mol/LNaOH等堿性溶液調(diào)pH值至7.0。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基，其特征是在分批發(fā)酵模式下單獨用于質(zhì)粒DNA工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基，其特征是在補料_分批發(fā)酵模式下，與補料培養(yǎng)基聯(lián)用，可用于質(zhì)粒DNA工程菌發(fā)酵培養(yǎng)。酵母提取物不是甘油硫酸銨磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀檸檬酸硫酸鎂全文摘要本發(fā)明一種提高質(zhì)粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養(yǎng)基屬于生物領(lǐng)域，本發(fā)明的培養(yǎng)基每升包含有下列配比組分酵母提取物5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸銨3.0g/L，磷酸氫二鈉6.0g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L，檸檬酸1.7g/L，硫酸鎂1.2g/L，培養(yǎng)基用1mol/LNaOH等堿性溶液調(diào)pH值至7.0。本發(fā)明的培養(yǎng)基能顯著提高質(zhì)粒DNA比含量水平，從而有利于下游質(zhì)粒DNA純化，提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質(zhì)粒DNA的合成效率，可減少試劑的消耗，節(jié)約成本。文檔編號C12N1/20GK101768560SQ20091021372公開日2010年7月7日申請日期2009年12月2日優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日發(fā)明者丘力功,王燦頂,蔡小杰,趙亮,韋劍申請人:廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司