專利名稱：：一種具有降解四溴雙酚a能力的蒼白桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌及其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：溴代阻燃劑(BFRs)由于其具有較高的持久性、親脂性、環(huán)境穩(wěn)定性、難降解性和生物放大作用等特性，容易在人和動(dòng)物體內(nèi)累積，并能夠通過食物鏈傳遞，使處于高位營養(yǎng)級(jí)的生物受到毒害，最終導(dǎo)致對(duì)人體健康的危害。國外已經(jīng)開始關(guān)注溴代阻燃劑在自然界中的降解，已有研究表明不同的溴代阻燃劑可以在一定的條件下光降解或生物降解，利用從環(huán)境中篩選的優(yōu)勢(shì)微生物能有效地去除環(huán)境中的溴代阻燃劑。四溴雙酚A是一種典型的溴代阻燃劑。四溴雙酚A的生物降解特性已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。而蒼白桿菌屬是由Holmes等在1988年建立的新屬。細(xì)菌染色為革蘭氏陰性，專性好氧，接觸酶陽性，不水解明膠，能利用各種氨基酸、有機(jī)酸和碳水化合物為碳源。至今尚未篩選出蒼白桿菌屬中具有降解四溴雙酚A的菌株。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌。本發(fā)明的另一目的在于提供所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌，名稱為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T，于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM209246;所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌具有如下的形態(tài)和生理生化特性該蒼白桿菌菌體的形態(tài)特性a.采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，所篩選的蒼白桿菌的細(xì)胞染色為革蘭氏陰性，桿狀，菌體大小為0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛；b.菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為12mm;c.主要的生理生化特征專性好氧，嚴(yán)格呼吸代謝，接觸酶、氧化酶陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，不水解明膠，在半固體LB培養(yǎng)基上穿剌接種運(yùn)動(dòng)陰性。所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌的16SrDNA序列如SEQID:No.1所示。所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌應(yīng)用于修復(fù)環(huán)境，所述的蒼白桿菌可降解環(huán)境中，如大氣、水體和土壤中的四溴雙酚A。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明首次從廣東省貴嶼地區(qū)土壤中篩選到具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌。3(2)本發(fā)明的蒼白桿菌降解四溴雙酚A的能力強(qiáng)，底物濃度為2mg/L條件下降解84h，降解率可達(dá)96.2%。圖1是本發(fā)明的蒼白桿菌T在電子顯微鏡下的形態(tài)圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1本發(fā)明所述的具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌從廣東省貴嶼鎮(zhèn)電子垃圾高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)的污泥中進(jìn)行分離、純化而得。其分離純化方法如下所用的馴化培養(yǎng)基為無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/U(K2HP044.35，KH2P041.70，NH4N032.10，MgS040.20，MnS040.05，F(xiàn)eS047H200.01，CaCl2*2H200.03)。首先將3g污泥加入含四溴雙酚A10mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，37°C馴化7天后，以5%接種量移入含四溴雙酚A20mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基接著馴化一周，以此類推逐步提高四溴雙酚A的濃度進(jìn)行馴化，四溴雙酚A的使用濃度分別為30mg/L、40mg/L、50mg/L。馴化結(jié)束后以5%的接種量接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3.Og/L，蛋白胨10.Og/L，NaCl5.0g/L，pH7.4-7.6)培養(yǎng)12h，取0.1ml菌懸液(稀釋10—110—7)涂布在以四溴雙酚A為唯一碳源的固體瓊脂平板(K2HP044.35g/L，KH2P041.70g/L，NH4N032.10g/L，MgS040.20g/L，MnS040.05g/L，F(xiàn)eS047H200.01g/L，CaCl22H200.03g/L，瓊脂粉1.80g/L，四溴雙酚AlOmg/L)直到平板上出現(xiàn)單一的純菌落為純菌。挑選生長速度快、邊緣規(guī)則的菌落。將挑選得到的菌落進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果如下(1)菌體的形態(tài)特性a.采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，所篩選的蒼白桿菌的細(xì)胞染色為革蘭氏陰性；在電子顯微鏡下觀察，其形態(tài)為桿狀，菌體大小為0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛，如圖l所示；b.菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為12mm;c.主要的生理生化特征專性好氧，嚴(yán)格呼吸代謝，接觸酶、氧化酶陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，不水解明膠，在半固體LB培養(yǎng)基上穿剌接種運(yùn)動(dòng)陰性。上述結(jié)果表明本發(fā)明所篩選的細(xì)菌與蒼白桿菌屬的生理生化特性很相似。(2)采用DNA提取方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌的16SrDNA通用引物擴(kuò)增其16SrDNA基因，測(cè)序結(jié)果如下(SEQID:No.1):tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagcaatacgagcggcagacgg60gtgagt朋cgcgtggg朋tctecccatcacteggg朋t朋ctcaggg朋3cttgtgct朋120taccctatacgaccgagaggtgaaagatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatta180gctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatga240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaata300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggt3Cggt朋CCgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggtgggctagcgttgttcggatttactgggcgt■3朋gCgC3Cgtaggcgggctgggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgcctttgatactgttagtcttgagtetgg3卿ggtg3gtggaattccgElgtgt卿gg600tgaaattcgtagatettcgg3gg^C3CC3gtggcg朋ggcgggctcactggtgcattac660tgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagca3朋C3gg3ttagataccctgggtagtccac720gccgtaatcgatg朋tgttegccgttggggagtttactcttcggtggcgc3gCt朋CgC3780ttaaacattccgcctggggagtecggtcgcctc朋3gg朋ttg3Cggggg840cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg朋gc朋cgcgcag朋ccttaccagcc900cttgacatcccgatcgcggttegtgg卿cactttccttcagttcggctggatcggagac960aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgcaacga1020gcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactct朋ggggactgccggtg1080ateagccgag3gg朋ggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggcte1140cacacgtgct3C朋tggtggtgacagtgggC3gCg3gC3Cgcgagtgtgagctaatctcc12003朋3gCC3tCtcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatg朋gttgg朋tcgcte1260gteatcgcggatcagcatgccgcggtg^tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1320cacaccatgggagttggttttecccg33ggcgctgtgcta3CCgC33gg3ggcacgcgac1380cacggtagggtcagcgatctggcgtg卿tCgg朋CC3朋gttttegggggc1432將長為1432bp的16SrRNA基因序列與Genbank中已登錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)菌株與Ochrobactrumsp.CGL-x有最高的同源性達(dá)98.1%，其中與最相似的模式菌株OchrobactrumintermodiumCCUG2469T的同源性為96.2%。綜合上述的生理生化特性、16SrRNA基因序列結(jié)果，本發(fā)明所篩選的細(xì)菌應(yīng)歸屬蒼白桿菌屬，且為該屬的一個(gè)新種，命名為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T。所述菌株于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM209246。實(shí)施例2本發(fā)明篩選得到的蒼白桿菌T對(duì)四溴雙酚A具有降解能力在1L的去離子水中加入K2HP044.35g，KH2P041.70g，NH4N032.10g，MgS040.20g，MnS040.05g，F(xiàn)eS047H200.Olg，CaCl22H200.03g，100ml/瓶分裝在250ml的搖瓶中，12rC條件下滅菌30min后取出，在無菌條件下加入四溴雙酚A，四溴雙酚A的濃度依次為2mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L禾P25mg/L。將斜面保存的蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)中，在30°C，220r/min的搖床中活化菌體15h，以5%的接種量接入含四溴雙酚A的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，3(TC下降解，采用液相色譜測(cè)定降解率，液相色譜條件為80%甲醇，18%水，2%乙酸，流速為lml/min，四溴雙酚A的檢測(cè)波長為210nm。在四溴雙酚A不同初始濃度時(shí)降解84h后測(cè)定降解率，結(jié)果如表1所示表1不同初始濃度的四溴雙酚A的降解率5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表l中可以看出，本發(fā)明篩選得到蒼白桿菌T對(duì)四溴雙酚A的降解能力強(qiáng)，最高可達(dá)96.2%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING〈110〉中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所〈120>—種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌及其應(yīng)用〈130>1〈160>1〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>1432〈212>DNA〈213>蒼白桿菌(Ochrobact進(jìn)sp.)〈400〉1tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagc朋tecgagcggc卿cgg60gtgElgt朋CgcgtgggaatctecccatcacCtC3ggg朋3cttgtgctaa120taccctatacg3CCg卿ggtg朋3gatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatte180gctagttggtggggte朋ggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctg卿gg3tg3240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg￡lggC￡lgC￡lgtgggg朋te300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggtgaagateatgacggteaccgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggt朋tecg朋gggggctegcgttgttcggatttactgggcgt4803朋gCgC3Cgteggcgggct朋t朋gtC3ggggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgcctttgatactgttegtcttgagtetggEl卿ggtgElgtggaattccgElgtgt卿gg600tgaaattcgtagatettcgg3gg朋C3CC3gtggcg朋ggcgggctcactggtgcattac660tgacgctgaggtgcg皿agcgtggggagca3^C3ggattagateccctgggtegtccac720gccgtaatcgatgaatgttagccgttggggagtttectcttcggtggcgcagcteacgca780tte^cattccgcctggggagtecggtcgc^gattea^ctca皿gg^ttgacggggg840cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcc900cttgacatcccgatcgcggttegtggagacactttccttcagttcggctggatcggagac960aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacga1020gcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggggactgccggtg1080ateagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggcte1140cacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagcacgcgagtgtgagctaatctcc1200aaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgcta1260gtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtecacaccgcccgt1320cacaccatgggagttggttttacccgaaggcgctgtgcteaccgcaaggaggcacgcgac1380cacggtegggtragcgatctggcgtg皿gtcgg皿cca皿gttttegggggc143權(quán)利要求一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)，其特征在于所述蒼白桿菌的名稱為蒼白桿菌T，于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM209246。2.權(quán)利要求1所述的具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌在修復(fù)環(huán)境中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌在修復(fù)環(huán)境中的應(yīng)用，其特征在于所述蒼白桿菌降解大氣、水體或土壤中的四溴雙酚A。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌及其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對(duì)電子垃圾高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)的污泥進(jìn)行分離，得到一株對(duì)四溴雙酚A具有良好降解能力的蒼白桿菌，將此蒼白桿菌命名為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T，于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM209246。本發(fā)明分離得到的蒼白桿菌T降解環(huán)境中四溴雙酚A的能力強(qiáng)，降解率可達(dá)96.2％，可將其應(yīng)用于降解環(huán)境中四溴雙酚A，達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的。文檔編號(hào)C12R1/20GK101717740SQ20091021374公開日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年12月11日優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日發(fā)明者安太成,李桂英,祖蕾申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所