專利名稱：禽流感病毒間接原位rt-pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽流感(avian influenza, AI)是由A型禽流感病毒引起的一種禽類從呼吸系統(tǒng) 到全身性嚴(yán)重?cái)⊙Y等多種癥狀的綜合傳染病，該病是一種毀滅性疾病，高致病性毒株發(fā) 病率和死亡率可達(dá)100%，廣泛分布于世界各地，在有記載的禽病史上，每一次嚴(yán)重的爆發(fā) 都給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，具有重大的公共衛(wèi)生意義。原位PCR是將PCR的高效率擴(kuò)增和原位雜交的細(xì)胞定位相互結(jié)合，從而在組織細(xì) 胞原位檢測(cè)微量拷貝的靶DNA或RNA序列，已被廣泛應(yīng)用于艾滋病、口蹄疫和藍(lán)耳病等十幾 種病毒的檢測(cè)中，取得了較為理想的結(jié)果。本研究采用的間接原位PCR方法，最早見于20 世紀(jì)90年代初，由于其較強(qiáng)的特異性，是目前應(yīng)用最廣的靶核酸序列原位擴(kuò)增技術(shù)。目前，禽流感的檢測(cè)已經(jīng)建立了許多方法，如雞胚病毒分離、血凝和血凝抑制試 驗(yàn)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、ELISA、RT-PCR、熒光RT-PCR和NASBA等，近年來還有學(xué)者對(duì)基因芯片等分子 診斷技術(shù)進(jìn)行了研究，但是對(duì)禽流感病毒(avianinfluenza virus,AIV)感染的細(xì)胞和組織 進(jìn)行原位PCR檢測(cè)的報(bào)道并不多見。本研究采用間接原位RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞涂片及動(dòng) 物組織中的禽流感病毒，為動(dòng)物組織中禽流感病毒的檢測(cè)和致病機(jī)理研究提供更為敏感、 特異和直觀的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性好、敏感性 高的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法。該方法可以在細(xì)胞涂片或組織切片中原位檢 測(cè)出特異性基因序列，同時(shí)判斷細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都有病毒存在。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，包括以 下步驟(1)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AIV NP基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，核苷酸序列
及長(zhǎng)度如下表
引物名稱引物序列擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp)P15，-AAGCGGAGGAAACACCAA C-3’270P25’-ATGTCAAAGGAAGGCACGAT-3，(2)利用上述的引物序列通過RT-PCR法制備探針，采用地高辛標(biāo)記；(3)樣品的采集和標(biāo)本的制備，將細(xì)胞或組織固定在玻片上，并作蛋白酶K消化預(yù) 處理；(4)原位RT-PCR反應(yīng)，在處理好的組織或細(xì)胞片上，加入反應(yīng)液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和兩
4次原位PCR擴(kuò)增；(5)RT PCR擴(kuò)增結(jié)束后，加入含有步驟(2)中制備的標(biāo)記探針的雜交液，進(jìn)行原位 雜交；(6)顯色處理，顯微鏡觀察結(jié)果。其中兩次原位PCR擴(kuò)增的體系相同，20uL的PCR反應(yīng)體系如下滅菌 DEPC 水6.7uL10 X Ex Taq Buffer (不含 Mg2+)2. OuLdNTPs (2. 5mmol/L)4. OuL上游引物Pl(10pmol/L)1. OuL下游引物P2(10pmol/L)1. OuLMg2+溶液(25mmol/L)4. OuLEx Taq DNA 聚合酶(5U/uL)1. 3uL。在所述步驟⑷中兩次原位PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系相同，其中在PCR儀中第一次原位 PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C 3mi n, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin, 54°C lmin, 72°C 80s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin, 1 個(gè)循環(huán)；第二次原位PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin, 55°C 50s, 72°C 70s, 25 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin, 1 個(gè)循環(huán)。所述步驟(3)中的標(biāo)本的制備為細(xì)胞涂片，固定過程采用4%多聚甲醛固定 lOmin。細(xì)胞涂片制備過程中，細(xì)胞固定采用多聚甲醛固定和PBS洗滌相結(jié)合的方法，所 述 PBS 為 8g NaCL, 0. 2g KCL, 1. 92g Na2HP04 12H20,0. 24g KH2P04,加 800mL DEPC 水，調(diào) PH 至7. 4，DEPC水定容至lOOOmL，高壓滅菌。細(xì)胞涂片預(yù)處理是將載玻片置于含有l(wèi)ug/mL蛋白酶K的0. lmol/ LTris-HCL (PH8. 0)中 37°C 作用 5min。另一種所述步驟(3)中的標(biāo)本的制備為組織切片。所述組織切片的預(yù)處理是將組織切片置于10ug/mL蛋白酶K的0. lmol/LTris HCL (PH 8. 0)中 37°C作用 15min,并在含有 0. 2mol/L 甘氨酸的 0. 2mol/LTris-HCL (PH7. 4)
中室溫沖洗5min。
在上述步驟(4)中進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下，15uL反轉(zhuǎn)錄體系組成為
滅菌DEPC水7. 7uL
5XAMV Buffer3. OuL
dNTPs(2. 5mmol/L)1. OuL
引物 P2(10pmol/L)1. OuL
AMV(5U/uL)1. 3uL
Rnasin(40U/uL)1. OuL。
在上面所述步驟(5)中加入的雜交液的配置過程為IOmL去離子甲酰胺，5mL 20 X SSC，4mL封閉貯存液，40 μ L 10% SDS，加DEPC水至 20mL,混勻后_20°C保存，用前加入鮭魚精DNA至終濃度為100 μ g/mL,加入標(biāo)記探針至終濃 度為 Iug/μ L0本發(fā)明的有益效果是首先，本發(fā)明采用了間接原位RT-PCR方法，原位雜交所用 的探針可特異性地檢出擴(kuò)增產(chǎn)物的靶序列，這樣即使擴(kuò)增產(chǎn)物中有非特異性序列成分，它 們也不會(huì)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，因而提高了原位RT-PCR的特異性，提高了試驗(yàn)結(jié)果的可信度。另 外本發(fā)明中提高了 PCR體系中一些PCR組分的濃度，關(guān)鍵是Mg2+濃度和聚合酶的用量，相應(yīng) 延長(zhǎng)PCR的變性、退火和延伸時(shí)間，循環(huán)次數(shù)不宜超過40個(gè)，以免過多循環(huán)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的 擴(kuò)散。具體來說將Mg2+濃度提高到5mmol/L，反轉(zhuǎn)錄酶的用量增加了三分之一，聚合酶的用 量也提高了近10倍，循環(huán)時(shí)間也比普通PCR的時(shí)間延長(zhǎng)了近一倍，循環(huán)次數(shù)分別設(shè)定為25 次和30次。另外，在第一次原位PCR的基礎(chǔ)上用相同的引物進(jìn)行了第二次原位PCR，且第一 次原位PCR的退火溫度較低，這樣就大大提高了本方法的敏感性和特異性。在標(biāo)本的制備方面，固定劑的固定時(shí)間很重要，時(shí)間太短，組織細(xì)胞固定不良，不 論是形態(tài)結(jié)構(gòu)還是核酸的保存都不理想；時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)減低靶核酸對(duì)探針的可及性，從 而使雜交信號(hào)減弱。本發(fā)明在多次的操作中發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞切片制作中IOmin的固定時(shí)間可以 達(dá)到很好的固定效果且對(duì)雜交信號(hào)的產(chǎn)生沒有太大影響。而固定劑的使用會(huì)影響探針對(duì)細(xì) 胞膜的通透性，從而降低探針與靶序列的結(jié)合率，使檢測(cè)的敏感性受限。在雜交時(shí)為了使探 針能有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通常采用酶作適當(dāng)消化。組織標(biāo)本經(jīng)蛋白酶消化后能增加通透性， 允許反應(yīng)試劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并暴露靶序列，用以擴(kuò)增。蛋白酶消化不足，則組織細(xì)胞的通透 性差，影響反應(yīng)試劑的進(jìn)入和靶序列的暴露，影響PCR反應(yīng)，以導(dǎo)致假陰性結(jié)果。反之，消化 過度會(huì)破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也會(huì)使PCR產(chǎn)物易于通過破裂的膜結(jié)構(gòu)向外彌散。一般 而言，組織固定得越充分，蛋白酶消化也要越強(qiáng)些。本發(fā)明在蛋白酶K的作用時(shí)間和濃度上 進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞切片中l(wèi)ug/uL蛋白酶K 37°C作用5mi n，可以達(dá)到良好的消化作用， 又不會(huì)影響組織形態(tài)，而組織切片則采用了稀酸和蛋白酶K相結(jié)合的預(yù)處理方法，10ug/mL 蛋白酶K 37°C作用15min可以達(dá)到良好的消化作用。由于甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑，因 此在蛋白酶K消化后用0. 2mol/L甘氨酸處理可以有效的終止消化反應(yīng)。另外在原位PCR 擴(kuò)增過程中，部分?jǐn)U增產(chǎn)物會(huì)彌散細(xì)胞外，為了避免背景過高或假陽性的結(jié)果，通常要輕輕 洗滌。但若洗滌過度，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物洗脫，使陽性信號(hào)減弱，因此本發(fā)明采用了 多聚甲醛固定和PBS洗滌相結(jié)合的方法。原位雜交方面，在雜交液中鮭魚精DNA的目的是除去未參與雜交體形成的過剩的探針，除去探針與組織之間形成的非特異性結(jié)合，包括那些與靶核酸相似的序列與探針之 間形成的含非互補(bǔ)堿基對(duì)的雜交體，從而減低背景。


圖1為細(xì)胞涂片的顯微鏡觀察結(jié)果，陽性細(xì)胞的胞漿、胞核被染成藍(lán)色(X40)；圖2為細(xì)胞涂片的顯微鏡觀察結(jié)果，陰性對(duì)照細(xì)胞核和細(xì)胞漿沒有顏色變化 (X40)；圖3為組織切片的顯微鏡觀察結(jié)果，肝有陽性細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿被染成藍(lán)色(χ40)；圖4為組織切片的顯微鏡觀察結(jié)果，陰性對(duì)照肝組織細(xì)胞核和細(xì)胞漿沒有顏色變 化(Χ40)。
具體實(shí)施例方式下面就具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述一、根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AIV NP基因的核苷酸序列，利用Prime Primer5. 0軟 件設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物有限公司合成，并將其分裝成10pmOl/UL，-2(TC保存?zhèn)溆?。?br> 苷酸序列及長(zhǎng)度如下表
名稱 引物序列 擴(kuò)增長(zhǎng)度 "pi 5’ AAGCGGAGG AAACAC CAAC 3’ 270 P2_5，ATGTCAAAG GAAGGCACG AT 3，__利用上述引物通PCR法制備檢測(cè)探針，并采用DIG-High Prime標(biāo)記。二、間接原位RT-PCR檢測(cè)禽流感病毒的具體過程如下1、載玻片及蓋玻片的準(zhǔn)備將新購(gòu)入的載玻片及蓋玻片浸泡于lmol/LHCL溶液過夜，自來水沖洗過夜，用蒸 餾水沖洗數(shù)次，用滅菌的DEPC水沖洗兩次，高壓滅菌。2、細(xì)胞涂片的制備a、雞胚成纖維細(xì)胞的制作和病毒接種(具體過程略)。b、細(xì)胞涂片的收集，分別于接毒后8_20h收集載玻片，用PBS沖洗IOs X 3次，4% 多聚甲醛固定lOmin，PBS浸泡5min。制備好的載玻片-20°C保存。C、細(xì)胞涂片前處理，將載玻片置于含有l(wèi)ug/mL蛋白酶K的0. Imol/ LTris-HCL (PH8. 0)中 37°C作用 5min，在含有 0. 2mol/L甘氨酸的 0. 2mol/LTris-HCL (PH7. 4) 中室溫沖洗5min，DEPC水沖洗5minX 2次，依次經(jīng)95%乙醇和100%乙醇各2min，風(fēng)干后 待用。3、石蠟組織切片的制備將病變器官組織脫水，通過浸蠟、包埋與固定、切片與展片等一系列過程后干燥保 存，并對(duì)組織切片進(jìn)行如下前處理將石蠟組織切片置于60°C熱模塊30min，置于二甲苯15min，100%乙醇、，100%乙 醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、各2mi n，DEPC水洗8min，0. 2mol/L HCL室溫 作用 1 Omin,DEPC 水洗 5min, 10ug/mL 蛋白酶 K 的 0. lmol/L Tris-HCL(PH8. 0)中 37°C作用 15min，在含有 0. 2mol/L 甘氨酸的 0. 2mol/L Tris-HCL (PH7. 4)中室溫沖洗 5min，DEPC 水沖 洗5min X 2次，依次經(jīng)50 %乙醇、75 %乙醇、95 %乙醇和100 %醇各2mi η,風(fēng)干后待用。4、原位 RT-PCR a、反轉(zhuǎn)錄15uL反轉(zhuǎn)錄體系組成滅菌 DEPC 水7. 7uL5 X AMV Buffer3. OuL
dNTPs(2. 5mmol/L) 引物 P2(10pmol/L) AMV(5U/uL) Rnasin(40U/uL)
1. OuL
1. OuL 1. 3uL 1. OuL
將15uL反轉(zhuǎn)錄溶液加到已風(fēng)干處理的載玻片上，覆以蓋玻片，封口膜密封，置于 42°C孵育80min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，小心用鑷子去掉封口膜，用PBS洗掉蓋玻片，PBS洗3min， 然后依次經(jīng)50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各2min脫水，風(fēng)干后待下一步PCR反應(yīng)。b、原位第一次PCR20uL PCR 反應(yīng)體系滅菌DEPC 水6. 7uLlOXEx Taq Buffer (不含 Mg2+) 2. OuLdNTPs (2. 5mmol/L)4. OuL上游引物Pl(10pmol/L)1. OuL下游引物P2(10pmol/L)1. OuLMg2+溶液(25mmol/L)4. OuLEx Taq DNA 聚合酶(5U/uL)1. 3uL混勻，將20uLPCR反應(yīng)液加入已風(fēng)干的載玻片上，覆以蓋玻片，指甲油密封，靜置 10mi n后，將玻片放入PCR儀，啟動(dòng)以下程序94°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin, 54°C lmin, 72°C 80s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin, 1 個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，用小刀小心去掉蓋玻片，PBS洗2min，然后依次經(jīng)過50%乙醇、75%乙 醇、95%乙醇、100%乙醇各2min，風(fēng)干后待用。c、原位第二次PCR20uL PCR 反應(yīng)體系滅菌 DEPC 水6.7uL10 X Ex Taq Buffer (不含 Mg2+) 2. OuLdNTPs (2. 5mmol/L)4. OuL上游引物Pl(10pmol/L)1. OuL下游引物P2(10pmol/L)1. OuLMg2+溶液(25mmol/L)4. OuLEx Taq DNA 聚合酶(5U/uL)1. 3uL混勻，將20uLPCR反應(yīng)液加入已風(fēng)干的載玻片上，覆以蓋玻片，指甲油密封，靜置 lOmin后，將玻片放入PCR儀，啟動(dòng)以下程序94°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin, 55°C 50s, 72°C 70s, 25 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，1 個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，用小刀小心去掉蓋玻片，4°C 4%多聚甲醛作用15mi n，PBS洗3minX2次，然后依次經(jīng)過50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各2min，風(fēng)干后待原位雜交檢 測(cè)。5、原位雜交在載玻片上加入15uL制備好的雜交液，覆以蓋玻片，指甲油密封，靜置lOmin后， 置于99°C作用lOmin，然后迅速冰浴3min，雜交箱中40°C雜交20h。雜交結(jié)束后，用小刀 小心去掉蓋玻片，用2父55(室溫洗滌3111111，2\55(，0. 1% SDS在60°C洗滌10minX2次， 0. 1XSSC，0. 1% SDS 室溫洗滌 10mi nX2 次，Buffer I 洗 10mi n, Buffer II 中孵育 30mi n，然后置于酶標(biāo)DIG抗體工作液中37°C濕盒孵育30min，Washing Buffer洗lOminX2， Bufferlll中平衡3min，置于NBT/BCIP顯色液中暗處顯色16h，DEPC水洗5min終止反應(yīng)。 片子經(jīng)95%乙醇、100%乙醇脫水各2min，二甲苯透明15minX3次，中性樹膠封片。倒置顯 微鏡觀察并成像。其中的原位雜交液為10mL去離子甲酰胺，5mL 20 X SSC，4mL封閉貯存液， 40uL10% SDS，加DEPC水至20mL，混勻后20°C保存。用前加入鮭魚精DNA至終濃度為 100 u L/mL,加入標(biāo)記探針至終濃度為1 P g/ P L。Buffer I :5. 8g 馬來酸，4. 38gNaCL 加水溶解，用 lOmol/L NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 7. 5，定 容至500mL，高壓滅菌。Buffer II 將探針標(biāo)記試劑盒中的封閉貯存液用Buffer I 10倍稀釋而成，現(xiàn)用 現(xiàn)配。酶標(biāo)DIG抗體工作液用Buffer II將anti_DIG_AP貯存液按1 5000倍稀釋， 現(xiàn)用現(xiàn)配。Bufferlll :50mL lmol/L Tris，2. 92gNaCL，5. 09gMgCL2，加 DEPC 水 400mL，調(diào)節(jié) PH 至9. 5，定容至500mL，高壓滅菌。Washing Buffer :5. 8g 馬來酸，4. 38gNaCL 加水溶解，用 lOmol/L NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 7. 5，定容至500mL，高壓滅菌，高壓滅菌后加入1. 5mLTween 20,室溫保存。6、檢測(cè)結(jié)果:細(xì)胞涂片在倒置顯微鏡中觀察結(jié)果，細(xì)胞涂片在接毒8h后即可觀察到陽性雜交 結(jié)果(圖1)，未接毒正常細(xì)胞雜交結(jié)果為陰性(圖2)；組織切片在倒置顯微鏡中觀察結(jié)果，雞攻毒11天的肝臟中觀察到陽性雜交結(jié)果 (圖3)，未攻毒的正常雞肝臟組織雜交結(jié)果為陰性(圖4)。由于禽流感病毒為RNA病毒，其復(fù)制方式是在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制后再進(jìn)入到細(xì)胞的細(xì) 胞漿，因此禽流感病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞后，其細(xì)胞核和細(xì)胞漿都會(huì)有病毒存在，從而雜 交反應(yīng)會(huì)在細(xì)胞核和細(xì)胞漿同時(shí)進(jìn)行，被病毒感染的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿都被染 成藍(lán)紫色。Perkins LE.等經(jīng)鼻內(nèi)途徑接種比較研究了 A/Chicken/HongKong/220/97 (H5N1) 株對(duì)雞的致病性，結(jié)果表明在2d時(shí)用免疫組化法在呼吸道上皮、肺、脾、肝、胸腺、羽毛囊、 腦、心臟、腎、法氏囊和胰腺等組織器官都可檢測(cè)到病毒核蛋白。本實(shí)施例由于實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所的 限制，只能利用現(xiàn)有的部分組織進(jìn)行組織切片的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示滴鼻飼養(yǎng)11天的雞的 肝臟中可以檢測(cè)到禽流感病毒的存在。雖然未能對(duì)禽流感病毒感染雞后不同時(shí)間點(diǎn)不同組 織器官的核酸分布情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究，但建立了一套在細(xì)胞涂片和組織切片中檢測(cè)禽流 感病毒的間接原位RT-PCR方法，將為后續(xù)的研究提供一種方便可靠的診斷方法。
SEQUENCE L I ST I NG<110>中華人民共和國(guó)珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法<130><160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1). . (19)<223>上游引物<400>1aagcggaggaaacaccaac 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1). . (20)<223>下游引物<400>2atgtcaaaggaaggcacgat 20
權(quán)利要求
一種禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AIV NP基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，核苷酸序列及長(zhǎng)度如下表(2)利用上述的引物序列通過RT-PCR法制備探針，采用地高辛標(biāo)記；(3)樣品的采集和標(biāo)本的制備，將細(xì)胞或組織固定在玻片上，并作蛋白酶K消化預(yù)處理；(4)原位RT-PCR反應(yīng)，在處理好的組織或細(xì)胞片上，加入反應(yīng)液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和兩次原位PCR擴(kuò)增；(5)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，加入含有步驟(2)中制備的標(biāo)記探針的雜交液，進(jìn)行原位雜交；(6)顯色處理，顯微鏡觀察結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在所述 步驟(4)中20uL的PCR反應(yīng)體系如下滅菌DEPC水6. 7uL10X Ex Taq Buffer2. OuL2. 5mmol/L dNTPs4. OuLlOpmol/L 上游引物 PI1. OuLlOpmol/L 下游引物 P21. OuL25mmol/L Mg2+溶液4. OuL5U/uL Ex Taq DNA 聚合酶1. 3uL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所 述步驟(4)中，第一次原位PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin，54°C lmin，72°C 80s，30 個(gè)循環(huán)； 72 °C 10min，l 個(gè)循環(huán); 第二次原位PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C lmin，55°C 50s,72°C 70s，25 個(gè)循環(huán)； 72°C 10min，l 個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在所述 步驟(4)中進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下，15uL反轉(zhuǎn)錄體系組成為滅菌DEPC水7. 7uL5XAMV Buffer3. OuL`2. 5mmol/L dNTPs lOpmol/L 引物 P2 5U/uL AMV `1. OuL`1. OuL 1. 3uL 40U/uL Rnasin1. OuL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步 驟(3)中的標(biāo)本的制備為細(xì)胞涂片，固定過程采用4%多聚甲醛固定lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，細(xì)胞 固定過程采用多聚甲醛固定和PBS洗滌相結(jié)合的方法，所述PBS是由8g NaCL,0. 2g KCL， 1. 92g Na^POi '12H20,0. 24g K^POi，加 800mL DEPC水，調(diào) PH至 7. 4，DEPC水定容至 lOOOmL， 高壓滅菌制得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，細(xì)胞涂 片預(yù)處理是將載玻片置于含有l(wèi)ug/mL蛋白酶K的PH8. 00. lmol/L Tris-HCL中37°C作用 5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步 驟(3)中的標(biāo)本的制備為組織切片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述組 織切片的預(yù)處理是將組織切片置于含有10ug/mL蛋白酶K的PH 8. 00. lmol/L Tris-HCL中 37°C作用15min，并在含有0. 2mol/L甘氨酸的PH7. 40. 2mol/L Tris-HCL中室溫沖洗5min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在所述 步驟(5)中加入的雜交液的配置過程為在10mL去離子甲酰胺，5mL 20X SSC，4mL封閉貯存液，40 y L 10% SDS中，加DEPC水至 20mL,混勻后_20°C保存，用前加入鮭魚精DNA至終濃度為100 u g/mL,加入標(biāo)記探針至終濃 度為 lug/uLo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性好、敏感性高的禽流感病毒間接原位RT-PCR檢測(cè)方法，從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列，通過比對(duì)選取NP基因中較為保守的片段，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，運(yùn)用RT-PCR法合成檢測(cè)所用的標(biāo)記探針，然后在經(jīng)前處理后的細(xì)胞涂片和石蠟切片上用上述引物進(jìn)行原位RT-PCR，再與地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，對(duì)細(xì)胞和組織中的禽流感病毒進(jìn)行檢測(cè)和定位。研究結(jié)果表明，本方法能檢測(cè)出約1pg/uL質(zhì)粒的DNA，并能特異性地在細(xì)胞涂片和石蠟組織切片中檢測(cè)和定位禽流感病毒，且成纖維細(xì)胞感染病毒8h后即可檢測(cè)到陽性信號(hào)，具有良好的特異性和較高的敏感性，為動(dòng)物組織中禽流感病毒的檢測(cè)定位和致病機(jī)理研究提供了敏感、特異和更為直觀的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101818209SQ20091021405
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者廖明, 廖秀云, 徐海聶, 楊素, 沙才華, 陳博文 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局