專利名稱：甲型h1n1流感病毒的環(huán)介導等溫擴增檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于甲型Hmi流感病毒核酸快速檢測方法 及檢測產品。
背景技術：
流行性感冒簡稱流感，是由甲型、乙型、丙型三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染 病。其中，甲型流感病毒的宿主最廣、危害最大，人、禽、畜都是甲型流感病毒的宿主。根據 其表面結構(血凝素H和神經氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可分成許 多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現的血凝素有16個亞型(H1-H16)，神經氨酸酶有9個亞型 (N1-N9)。2009年從墨西哥爆發(fā)并蔓延到全球多個國家的人感染甲型Hmi流感疫情，是由 于一種新變異的甲型Hmi流感病毒引發(fā)的，被世界衛(wèi)生組織稱為“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi) 生事件”，已達到了最高的6級警告標準。今年流行的甲型Hmi流感是甲型流感病毒中的一個亞型，已經蔓延到世界許多 國家，不足一個月，全球確診的甲型Hmi流感病例已突破萬例，我國也出現了多例輸入性 流感病例。給人類生命安全造成了一定危害，包括我國政府在內的世界各國都采取了積極 有效的防控措施，以防止疾病的迅速蔓延。面對突然爆發(fā)的流行性疾病，開展對疾病預防、 診斷、致病機理以及治療研究是相關領域關注和研究的重點。甲型流感病毒是RNA病毒，傳統的基因檢測技術有Northern雜交、Southern雜交、 Western blotting、PCR等，這些檢測方法不僅費時費力，而且特異性差。在過去的十幾年 中，實時熒光定量PCR已經發(fā)展成為一種重要的基因檢測技術，具有高靈敏度和特異性，但 是需要昂貴的儀器及專業(yè)人員的操作。環(huán)介導恒溫核酸擴增(loop-mediated isothermal amplication of nucleic acid,簡稱LAMP)技術利用Bst脫氧核苷酸聚合酶和根據不同靶序列設計的兩對特殊的內、 外引物，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應。該技術是在PCR基礎 上創(chuàng)建的一種理想的手段。環(huán)介導恒溫核酸擴增技術其特點是①只需一恒定溫度就能擴 增反應。不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性；②高特異性應用六個區(qū)段，四 條引物，并且這六個區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP法擴增的特異性很高，可以根據是 否擴增判斷目標基因的存在與否，即能夠進行細菌或病毒的定性檢測；③快速、高效擴增 擴增在不到Ih即可完成，且產率高。若在引物上再進一步改進，可大大提高其擴增效率，擴 增時間在原來的基礎上減少；④靈敏度高擴增模板可達10拷貝亦或更少，檢測線性范圍 5個數量級；而且，研究人員或檢測人員實際操作非常簡便。LAMP法是一種簡便、快速、高 度特異性的基因擴增法。而且不需要特殊的試劑和儀器設備，因此可以建立起總成本低廉 的檢測體系。該方法適用于現場檢測和大量樣品高通量檢測，在臨床疾病診斷，基因芯片開 發(fā)及食品衛(wèi)生質量檢驗等領域具有廣闊的應用前景。通過將恒溫基因擴增技術與PCR技術 (包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發(fā)現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優(yōu)于PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速 檢測，且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術。近年來興起的DNA納米技術是以DNA堿基嚴格互補配對的特性為原理，主要應用 于分子的組裝，產生有功能的組裝聚集物。DNA納米技術包括基因芯片之外，還有一種是 將DNA結合到納米顆粒上構成納米顆?；蛱结?，通過與靶DNA之間的互補實現納米顆粒 的組裝，這已成為一種新型的DNA檢測系統。Mirkin等運用金納米顆粒基因探針與合成 靶雜交，形成透射電鏡下明顯的聚集體，可判斷合成靶存在與否(Chad A. Mirkin, R. L. L.， Robert C. Mucic &James J. Storhoff Nature 1996，382，607-609)。Wang 等制備金納米顆 粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探針，在玻片上目視化檢測HBV DNA的多聚酶鏈反應產物 (Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV andHCV based on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J Med Virol, 2003,70 :2052211)。習東等應用!^304 (核)/Au (殼)納米顆粒HBVDNA基因探針，通過尼龍 膜上斑點雜交或液相中雜交研究其在檢測HBV DNA中的應用(Dong Xia,X. L. ,Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli LiudJournal of Nanjing Medical University 2007, 21,207-212)。但上述檢測技術都存在各自的缺點，如Mirkin的技術需要復雜昂貴的透射 電鏡，Wang需要昂貴的進口玻片，且需要長時間的預雜交、雜交洗滌過程，習東的檢測時需 要長時間的復雜的預雜交、雜交、洗膜銀染過程，沒有技術優(yōu)點耗時費力，且都處于試驗研 究階段，沒有產品化。所以仍然需要尋找快速、靈敏、低成本、操作簡易的核酸檢測工具。為配合這一研 究，研究了能迅速準確檢測甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器的檢測方法及開 發(fā)了其試劑盒，對于早期大規(guī)模篩查及有效地控制疾病的迅速傳播具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有甲型Hmi流感病毒檢測技術及產品存在的問題和不 足，提供一種用于快速檢測甲型Hmi流感病毒(2009年流行的新變種)的方法以及試劑
品.O本發(fā)明所述的一種采用環(huán)介導恒溫核酸擴增技術對甲型Hmi流感病毒進行檢測 的方法，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400 μ 1病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復震 蕩，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37°C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心
15分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使 沉淀干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉錄及LAMP擴增
采用的逆轉錄及環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應體系，包括10倍環(huán)介導恒溫核酸緩 沖液、dNTP溶液、RNA酶抑制劑、鎂離子、Bst酶、反轉錄酶、上游外引物和下游外引物、上游 內引物和下游內引物，以及病毒樣品RNA ；其中，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游外引物含 有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游內引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所 示的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的下游內引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷 酸序列；環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應程序63°C水浴60分鐘；3)單鏈化所得的LAMP反應產物a)向2)所得的反應產物中加入1 μ 1濃度為8U/μ 1的限制性內切酶TspR I，并 在63°C條件下水浴2小時；b)將a)所得產物在98°C條件下水浴5分鐘后，迅速置于冰上10分鐘；4)采用核酸納米金生物傳感器對經單鏈化處理的環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應產 物的檢測及結果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃 纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并 與膠體金偶聯形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記 并與鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線，該寡核 苷酸探針包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探 針形成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列；將步驟3所得的經單鏈化處理的環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應產物分別滴加入所 述的甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測線和質控線的情況進行結果 分析檢測線和質控線同時出現紅色，表明被檢樣品為陽性；質控線出現紅色，而檢測線未 出現紅色，表明被檢樣品為陰性。根據本發(fā)明所述的檢測方法，所述的核酸納米金生物傳感器中，質控線與檢測線 相距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分 彼此重疊l_5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。本發(fā)明所述的一種用于檢測甲型Him流感病毒的試劑盒，其包括環(huán)介導恒溫核酸擴增反應試劑，其包含10倍LAMP緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA 酶抑制劑、上游外引物、上游內引物、下游外引物、下游內引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內引物含有如SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列，下游外引 物含有如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列，下游內引物含有如SEQ ID N0. 4所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/μ 1和逆轉錄酶5U/μ 1以體積比1 1混合組成；以及 核酸納米金生物傳感器。所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上 的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探 針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID Ν0. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成 質控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端 的寡核苷酸探針形成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列。根據本發(fā)明所述的試劑盒，所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的外引物與內引物 之間的濃度比為1 1 1 10，優(yōu)選為1 4。在該濃度比下，由外引物引導的起步擴增 過程能夠有效的促進由內引物引導的具有重復擴增區(qū)段結構的核酸擴增產物的生成；同時 在該濃度比條件下，引物二聚體的產生能夠得到有效抑制，從而使LAMP擴增反應效率達到 最大。根據本發(fā)明所述的試劑盒，所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游內引物和下 游內引物的序列中都含有一段9nt限制性內切酶TspR I酶切位點序列，其中，上游內引物 中的酶切位點序列是5-GACACTGGA-3，下游內引物中的酶切位點序列是5-GACACTGTC-3。在 LAMP的擴增過程中，酶切位點序列被引入到擴增產物中。LAMP擴增產物經酶切消化后，其 重復結構的長鏈將被切割成長度為140bp左右的產物。單鏈化處理該產物所得的寡聚核苷 酸鏈能夠有效地與生物傳感器中的探針發(fā)生配對反應，從而達到檢測的目標。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明將表面合成化學、生物化學及物理化學有機結合起來， 解決目視化基因檢測技術設計與制造中的關鍵技術，利用一對經特殊設計的LAMP內引物 通過LAMP擴增過程將一段酶切位點序列引入到擴增產物中，然后使用限制性內切酶TspR I消化擴增產物并通過物理驟冷的辦法獲得大量長度為140bp左右的單鏈DNA產物，由于采 用了環(huán)介導恒溫核酸擴增(LAMP)技術并結合核酸納米金生物傳感器，使得所述的檢測方 法和試劑盒特異性高、檢測迅速。病毒RNA只需要在恒溫條件進行逆轉錄和LAMP擴增后， 即可獲得大量的目標DNA，整個擴增過程僅需1小時。將上述產物經單鏈化處理后滴于納米 金生物傳感器的加樣孔中，約10分鐘后即可通過觀察檢測線及質控線來判斷結果，不需要 專業(yè)的技術人員及昂貴的儀器設備，配合使用商用RNA提取試劑盒，本發(fā)明可以滿足基層 及時、戶外、迅速的甲型流感病毒(2009流行)檢測要求。


圖1顯示納米金生物傳感器檢測樣品的結果，自左至右分別為A/ws/33 (HlNl)樣 品、A/hongkong/8/68(H3N2)樣品、A/P2/8/34 (HlNl)樣品、B 型、甲型 HlNl 流感病毒樣品。
具體實施例方式實施例一針對甲型Hmi流感病毒的LAMP引物及探針的設計在NCBI http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/Database/request, cgi中 查找出所有甲型流感病毒的PA基因片段序列，通過多重比對找出甲型流感病毒的保守區(qū) 段。采用I^rimerExplorer在其保守片段上設計引物和探針。通過對甲型Hmi (2009流行)的PA基因片段序列，采用ft·imerExpIorer設計引 物和探針。將所設計的引物與探針與所有病毒序列進行比對，找出變異性最強的引物和探 針。上述甲型Hmi (2009年流行)的全長PA基因序列來源于NCBI (> gi | 238914637 gbIGQ244322. 11 Influenza A virus(A/Guangdong/05/2009(HlNl)) segment 3 polymerasePA(PA) gene, completecds)設計結果為甲型Hmi流感病毒的引物和特異性探針上游外引物TACAGCAGAAGTGTCCCASEQ ID NO. 1下游外引物CCTTCCTTTTATAATGAACCCASEQ ID NO. 3上游內引物SEQID NO. 2CACAGGATGCATTGAGCAAGGGACACTGGAGCTACTGAA TACATAATGAAGGGA下游內引物SEQID NO. 4GGATGACTTTCAGCTGATCCCAGACACTGTCTACAGGTTT GTTTTCCGTCTT探針1 :5-ThioMC6-D-TGGTCCTACATTTGCTTATCAT SEQ ID NO. 5探針2 Biοtin-5-AAAAAAAAAAATGATAAGCAAATGTAGGACCA SEQ ID N0. 6探針3 :TTTTTTTTTTTCATCAATCAATCTTTTTCACTTT-3-Biotin SEQ ID NO. 7引物、探針及模板DNA三者之間的關系為探針1位于上下游引物之間與所測樣品 中模板DNA特異性互補，探針3覆蓋上下游引物之間的部分序列，探針1與探針2特異性互 補。實施例二本發(fā)明所述的用于檢測甲型流感病毒的核酸納米金生物傳感器的制備1.納米金(膠體金)的制備在500ML的圓底燒瓶中加入100ml 0. 01 %的HAuCL4溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰； 向上述溶液中加入anl 檸檬酸鈉，溶液20s內變?yōu)樗{色，60s后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸 lOmin，停止加熱繼續(xù)攪拌15min ；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度
值鑒定。2.金標寡核苷酸探針的制備用100 μ 1去離子水溶解10D DNA-探針1，加入到5 倍體積濃縮的膠體金溶液中，4°C 24小時；10%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl 和1 %的SDS，分別至終濃度0. IM和0. 01 %，4°C過夜，12000轉/分鐘離心30分鐘，棄上清， 沉淀用100μ 1含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新懸浮，制成懸浮液。3.金標墊的制備將本發(fā)明制備的金標寡核苷酸探針涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個小時，制成金 標墊，備用。4.生物素標記探針與鏈霉親和素的偶聯及偶聯物的固定鏈霉親和素可以與生物素通過親水鍵和范德華力相結合并形成穩(wěn)定且難斷裂的 鍵，因此本發(fā)明采用生物素標記的DNA探針與鏈霉親和素混合反應，采用劃膜噴金儀涂于 硝酸纖維素膜上。例如，用10 μ 1去離子水溶解10D生物素標記的DNA-探針2，加入5 μ 1 (2mg/ml) 鏈和親霉素，室溫下反應1小時后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上，37°C干燥 兩個小時。DNA-探針3采用同樣方法固定于質控線上。5.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡在雜交液(0.16% TritonX-100,0. 2M Tris,0. 2M 氯化鈉，pH 8. 0) 中4個小時后，37 °C烘干備用。
6.核酸納米金生物傳感器的組裝將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標記寡核苷酸探 針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經切割成寬4mm后即得 到本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器。實施例三本發(fā)明所述的用于檢測甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器的 試劑盒的制備及檢測方法甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器的試劑盒包括如下成分LAMP反應試劑，甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器；其中所述的LAMP反應試劑包括10倍RT-PCR緩沖液150 μ l、dNTP溶液150 μ 1、鎂 離子150 μ 1、酶混合液60 μ 1、RNA酶抑制劑30 μ 1、上游外引物30 μ 1、下游外引物30 μ 1、 上游內引物30μ1、下游內引物30μ1 ；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，上游內引物含有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，下游內引物含有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/ μ 1和逆轉錄酶5U/ μ 1以體積比1 1混合組成。檢測甲型Hmi流感病毒LAMP反應液的配制試劑使用量μ IOX 緩沖液5dNTP 混合液(IOmM) 2MgC12(50mM)2RNA酶抑制劑1酶混合液2上游外引物(10 μ Μ)1下游外引物(10 μ Μ)1上游內引物(10 μ Μ)4下游內引物(10 μ Μ)4RNA 提取液4DEPC 7jC6總體積50 μ 1確立如下的反應條件63°C水浴60分鐘。反應結束后將上述檢測甲型Hmi流感病毒的LAMP產物中加入1 μ 1濃度為8U/ μ 1的限制性內切酶TspR I，置于63°C水浴2小時；水浴結束后將酶切反應產物98°C水浴 5分鐘后迅速置于冰上10分鐘。最后將經過如上單鏈化處理所得的產物滴于甲型Hmi流 感病毒核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，約10分鐘即可進行結果判斷。實施例四本發(fā)明所述的檢測甲型流感病毒的方法的實驗1、毒株及其來源A/ws/33 (HlNl), A/hongkong/8/68 (H3N2)由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提 供；A/PR/8/34(HlNl)，B型為臨床分離毒株由廣州呼吸疾病研究所提供；甲型Hmi由美國 疾病控制及預防中心(⑶C)提供。以上毒株信息可通過http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/FLU/Database/select, cgi ？ go = 1 查找。
2、病毒RNA提取a) 200-400 μ 1樣本加入0.5ml Trizol (咽拭子來源或病毒培養(yǎng)液)，反復震蕩，抽 吸以利于細胞裂解，室溫下孵化5分鐘。b)加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心 15分鐘，取上清液，轉移至另一 1.5ml EP管。c)加入0. Iml的異丙醇，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15分鐘，去掉
上清液，將管倒置在吸水紙上，稍微風干。d)加入0. 5ml的75%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌RNA，4°C 7500rpm下離心5 分鐘，倒置于吸水紙上，除去上清液后室溫下靜置5分鐘。e)用DEPC (焦碳酸二乙酯)水2Oul溶解RNA。f)測定 RNA 濃度及 A^O/A^O。3、逆轉錄及LAMP擴增1)取出試劑盒(見實施例三)，于4°C解凍，各試劑于用前1000轉/分鐘低速離心 1分鐘待用。2)按下列組份配制LAMP反應液(反應液配制應在冰上進行)。檢測甲型流感病
毒LAMP反應液的配制試劑使用量μ 1IOX 緩沖液5dNTP 混合液(IOmM)2MgC12(50mM)2RNA酶抑制劑1酶混合液2上游外引物(10 μ Μ)1下游外引物(10 μ Μ)1上游內引物(10 μ Μ)4下游內引物(10 μ Μ)4RNA 提取液4DEPC 水6總體積50 μ 13) LAMP反應水浴程序設置63 °C 水浴 60 分鐘。4.檢測及結果判定將上述LAMP產物中加入1μ 1濃度為8U/μ 1的限制性內切酶T1SpR I，置于63°C 水浴2小時；水浴結束后將酶切反應產物98°C水浴5分鐘后迅速置于冰上10分鐘。最后將 經過如上單鏈化處理所得的產物滴于納米金生物傳感器的樣品墊上，約10分鐘通過觀察T 線和C線的出現情況即可判斷結果。質量控制標準1)C線(質控線)出現紅色的線證明納米金生物傳感器有效。2)T線(檢測線)出現紅色的線與否，是陽性陰性判別的標準。
結果判定標準1)C線出現紅色的線，同時T線出現紅色的線，說明被檢樣品為陽性；2)C線出現紅色的線，同時T線沒有出現紅色的線，說明被檢樣品為陰性3)C線沒有出現紅色的線，說明納米生物傳感器失效。A/ws/33 (HlNl)，A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/PR/8/34 (HlNl)、B 型流感病毒，經核 酸納米金生物傳感器檢測只有c線出現紅色的線而τ線沒有出現紅色的線；甲型Hmi流感 病毒經甲型Hmi核酸納米金生物傳感器檢測τ線、c線均出現紅色的線(圖1)。試驗結果 均符合預期期望。根據上述檢測方法，可以設計出相應的檢測試劑盒。該用于檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒包括環(huán)介導恒溫核酸擴增反應試劑，其 包含10倍LAMP緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游外引物、上游內引物、下游外 引物、下游內引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內引物含 有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列， 下游內引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/μ 1和逆 轉錄酶5υ/μ 1以體積比1 1混合組成；以及核酸納米金生物傳感器。該試劑盒中，用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的外引物與內引物之間的濃度比為 1 1 1 10，優(yōu)選為1 4。優(yōu)選地，所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游內引物和下游內引物的序列中 都含有一段9nt限制性內切酶TspR I酶切位點序列，其中，上游內引物中的酶切位點序列 是5-GACACTGGA-3，下游內引物中的酶切位點序列是5-GACACTGTC-3。序列表(SEQUENCELISTING)<110>中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院<120>甲型Hmi流感病毒的環(huán)介導等溫擴增檢測方法及試劑盒<130><160>7<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1tacagcagaa gtgtccca18<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2ccttcctttt ataatgaacc ca 22<210>3
<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>3cacaggatgc attgagcaag ggacactgga gctactgaat acataatgaa ggga 54<210>4<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>4ggatgacttt cagctgatcc cagacactgt ctacaggttt gttttccgtc tt52<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5tggtcctaca tttgcttatc at22<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>6gaggggggag gtgataagca aatgtaggac ca32<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>7tttttttttt tcatcaatca atctttttca cttt 3權利要求
1. 一種采用環(huán)介導恒溫核酸擴增技術對甲型Hmi流感病毒進行檢測的方法，其特征 在于，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400μ 1病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復震蕩，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37 °C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0.Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15 分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使沉淀 干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉錄及環(huán)介導恒溫核酸擴增采用的逆轉錄及環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應體系，包括10倍環(huán)介導恒溫核酸緩沖 液、dNTP溶液、RNA酶抑制劑、鎂離子、Bst酶、反轉錄酶、上游外引物和下游外引物、上游內 引物和下游內引物，以及病毒樣品RNA ；其中，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游外引物含有 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的上游內引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示 的核苷酸序列，環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的下游內引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸 序列；環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應程序63°C水浴60分鐘；3)單鏈化所得的環(huán)介導恒溫核酸反應產物a)向2)所得的反應產物中加入1μ 1濃度為SU/μΙ的限制性內切酶TspR I，并在63°C 條件下水浴2小時；b)將a)所得產物在98°C條件下水浴5分鐘后，迅速置于冰上10分鐘；4)采用核酸納米金生物傳感器對經單鏈化處理的環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應產物的 檢測及結果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID N0. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與 鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列；將步驟3所得的經單鏈化處理的環(huán)介導恒溫核酸擴增的反應產物分別滴加入所述的 甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測線和質控線的情況進行結果分析 檢測線和質控線同時出現紅色，表明被檢樣品為陽性；質控線出現紅色，而檢測線未出現紅 色，表明被檢樣品為陰性。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的核酸納米金生物傳感器中，質 控線與檢測線相距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水 紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。
3.一種用于檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒，其特征在于，包括環(huán)介導恒溫核酸擴增反應試劑，其包含10倍環(huán)介導恒溫核酸緩沖液、鎂離子、酶混合液、限制性內切酶TspRI、RNA酶抑制劑、 上游外引物、上游內引物、下游外引物、下游內引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，下游內引物 含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/ μ 1和逆轉錄酶5U/ μ 以體積比1 1混合組成；以及核酸納米金生物傳感器；所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與 鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的 外引物與內引物之間的濃度比為1 1 1 10。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的 外引物與內引物之間的濃度比為1 4。
6.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導恒溫核酸擴增反應的 上游內引物和下游內引物的序列中都含有一段9nt限制性內切酶TspR I酶切位點序列， 其中，上游內引物中的酶切位點序列是5-GACACTGGA-3，下游內引物中的酶切位點序列是 5-GACACTGTC-3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用環(huán)介導恒溫核酸擴增(LAMP)技術對甲型H1N1流感病毒進行檢測的方法。該檢測方法包括病毒RNA提?。荒孓D錄及LAMP擴增；LAMP擴增產物單鏈化；采用核酸納米金生物傳感器對LAMP擴增產物的檢測。本發(fā)明還提供了用于檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒。本發(fā)明利用經特殊設計的LAMP內引物通過LAMP擴增過程將一段酶切位點序列引入到擴增產物中，然后使用限制性內切酶TspR I消化擴增產物并通過物理驟冷的辦法獲得大量長度為140bp左右的單鏈DNA產物，由于采用了特定引物的環(huán)介導恒溫核酸擴增技術并結合含有特定探針的核酸納米金生物傳感器，使得所述的檢測方法和試劑盒特異性高、檢測迅速。
文檔編號C12R1/93GK102108418SQ20091021416
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權日2009年12月25日
發(fā)明者劉杰, 曾令文, 趙昌路, 頓博影 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院