專利名稱：：Pdcd7基因在早期判斷急性髓系白血病預(yù)后中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人類PDCD7基因的一種用途。
背景技術(shù)：
：人類PDCD7基因全長約16458bp，編碼485個(gè)氨基酸多肽鏈。PDCD7基因定位于15q22.31，與鼠ES18基因同源。ES18蛋白在糖皮質(zhì)激素及十字孢堿誘導(dǎo)的鼠胸腺瘤細(xì)胞(T細(xì)胞)凋亡過程中表達(dá)增加，且ES18過表達(dá)可促進(jìn)鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。目前未見PDCD7在白血病甚至疾病中的研究報(bào)道。急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia,AML)是一種異質(zhì)性髓細(xì)胞腫瘤，也稱急性非淋巴細(xì)胞性白血病，常進(jìn)展迅速，其特點(diǎn)是由造血干細(xì)胞惡變而形成的原始細(xì)胞克隆取代了正常骨髓造血。由于白血病細(xì)胞代替了正常血細(xì)胞，它們不具備正常血細(xì)胞的功能，由此導(dǎo)致貧血，血小板和粒細(xì)胞減少而引發(fā)一系列并發(fā)癥。若不經(jīng)過治療，存活期一般不超過半年。有的病例從診斷到死亡，甚至不過一周，死亡的主要原因是出血和感染。目前標(biāo)準(zhǔn)化療可以獲得約7080%的完全緩解(CompleteRemission,CR)率，但大部分CR后的患者終將復(fù)發(fā)，甚至一部分患者難以達(dá)到CR而成為難治性白血病，治療無效而死亡。目前對(duì)AML的預(yù)后判斷主要根據(jù)患者年齡、染色體核型等指標(biāo)。但即使是年齡、染色體核型等因素完全相同的患者，他們的預(yù)后也不盡相同。因此，為了獲得更好的治療效果，提高患者的存活率，需要早期判斷AML的預(yù)后指標(biāo)指導(dǎo)制定合適的治療方案。故尋找早期判斷預(yù)后的敏感性指標(biāo)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。但是，現(xiàn)階段有效的判斷指標(biāo)嚴(yán)重不足，從基因水平上研究尋找預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)已成為研究熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種人類PDCD7基因的用途。發(fā)明人通過成熟的熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PDCD7mRNA在急性髓系白血病細(xì)胞中均有表達(dá)。通過熒光定量PCR檢測(cè)了77例初次診斷并治療前的急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的PDCD7mRNA表達(dá)量，并設(shè)立缺鐵性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜患者為對(duì)照。將所測(cè)結(jié)果與臨床特征、治療反應(yīng)及隨訪結(jié)果分析比較，發(fā)現(xiàn)PDCD7mRNA表達(dá)量大于5%的患者，其復(fù)發(fā)、難治的比例顯著高于表達(dá)量小于5%的患者。PDCD7mRNA表達(dá)量大于5%患者的生存期也顯著縮短，隨訪1年時(shí)的總生存率僅有45X，而PDCD7mRNA表達(dá)量小于5%患者的總生存率高達(dá)80%。由此表明，PDCD7mRNA表達(dá)量的多少，與患者治療反應(yīng)和病情的發(fā)展密切相關(guān)表達(dá)量高，患者治療后易復(fù)發(fā)且治療難度大；表達(dá)量低則與之相反。可見，PDCD7mRNA的表達(dá)量可以作為判斷AML患者預(yù)后的指標(biāo)，為個(gè)體化治療方案的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。圖1是PDCD7mRNA表達(dá)水平與AML患者生存時(shí)間的關(guān)系圖；圖2為基因PCR產(chǎn)物的電泳圖，圖中，M為標(biāo)記帶，l為P-actin產(chǎn)物帶，2為PDCD7mRNA產(chǎn)物帶。圖3是cDNA相對(duì)濃度梯度-ACT關(guān)系圖。具體實(shí)施例方式選取南方醫(yī)院血液科2005年9月至2008年7月期間診治的初發(fā)AML患者77例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫分型及細(xì)胞遺傳學(xué)特征全部符合原發(fā)性AML診斷標(biāo)準(zhǔn)，記為病例組，其特征如表1所示；選取20例非惡性血液病患者為對(duì)照，診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)參照張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。病例組中，48例患者隨訪1年以上。表l病例組特征表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>77例中細(xì)胞表面抗原CD33、CD13共同表達(dá)47例，伴隨CD34表達(dá)55例，伴隨CD14、CDllb表達(dá)17例，伴隨淋系抗原表達(dá)(CD7、CD9、CD19、CD20)35例。完成染色體核型分析的有57例，染色體異常的17例，其中t(15;17)3例，t(8;21)3例，t(8;21)伴-X2例，t(8;21)伴-Y2例，t(2;17)1例，t(ll;17)1例，t(3;5)1例，+81例，+8伴19q22缺失1例，+101例，+211例。首次誘導(dǎo)化療方案均采用標(biāo)準(zhǔn)劑量DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)方案(M3患者予以全反式維甲酸聯(lián)合化療)，再次誘導(dǎo)未獲得CR者改用FLAG(氟達(dá)拉濱30mg/m2dl-5+阿糖胞苷lg/m2dl-5)、CAG(阿糖胞苷10mg/m2dl-14+阿克拉霉素10mg/m2dl-4)等方案，獲得CR后采用TA(吡柔比星20mg/m2dl-3+阿糖胞苷150mg/m2dl-7)、MA(米托蒽醌8mg/m2dl-3+阿糖胞苷150mg/m2dl-3)、DA、中劑量阿糖胞苷(2gdl_5)治療方案交替使用，有5例行自體干細(xì)胞移植，3例異基因干細(xì)胞移植。CR后治療療程中位數(shù)4(014)，隨訪中位時(shí)間374(3-1440)天。20例非惡性血液病患者骨髓為對(duì)照，其中9例為缺鐵性貧血，11例為特發(fā)性血小板減少性紫癜，男性和女性分別為5例和15例，中位年齡36歲(5-58歲)。依據(jù)治療反應(yīng)及生存時(shí)間不同，將AML患者分成首療程CR與NR組、1年內(nèi)存活與l年內(nèi)死亡組。排除M3型、診斷后首療程化療未完成，或化療l-2個(gè)療程后失訪的患者。故77例AML病例中，有52例列入療效分析，其中48例隨訪1年以上。使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選取的模型為兩組間比較Mann-WhitneyUtest;兩變量間相關(guān)分析Spearmanrankcorrelationanalysis;率的比較chi-squaretest;生存分析Kaplan-Meier曲線；單因素分析、多因素分析CoxRegression。表達(dá)量=2—ACTX100%。(CT值是熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù))實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)患者骨髓細(xì)胞PDCD7mRNA的表達(dá)量，結(jié)果如下表所示骨髓細(xì)胞PDCD7mRNA的表達(dá)量與AML亞型的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注*與非惡性血液病組比較P<0.05對(duì)照組中，PDCD7mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為1.74%(0.06-8.71)，AML組中為4.59%(0.06%-1738.77%)，兩組間統(tǒng)計(jì)分析差異顯著，P值為0.017。在26例首療程獲CR組中，PDCD7mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為2.05%(0.06%24.15%)，29例首療程N(yùn)R組中，PDCD7mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為9.28%(0.16%1738.77%)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果有顯著性差異，Z值為-2.470，P值為0.014。以PDCD7mRNA表達(dá)量5%為界評(píng)價(jià)表達(dá)水平高低在可評(píng)價(jià)的52例AML患者中有PDCD7mRNA高表達(dá)24例，低表達(dá)28例，其中48例患者隨訪至少1年，在高表達(dá)組22例中1年內(nèi)死亡12例(54.5%，死因?yàn)榘籽≡l(fā)耐藥10例，化療后感染2例)；但在低表達(dá)組26例中1年內(nèi)死亡僅有6例(23.1%，死因?yàn)榘籽≡l(fā)耐藥5例，化療后感染1例)。在高表達(dá)組的死亡率明顯高于低表達(dá)組(x2=5.035，P=0.025)，表明PDCD7基因表達(dá)量高的AML患者更容易死亡。PDCD7mRNA表達(dá)水平對(duì)AML患者生存時(shí)間的影響如圖l所示。通過計(jì)算表達(dá)量與患者1年內(nèi)死亡之間的敏感性和特異性，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量2—ACTX100%大于5%的患者可能在1年內(nèi)死亡，其敏感性55%，特異性67%。以上數(shù)據(jù)表明，PDCD7基因的表達(dá)量可以作為判斷AML患者預(yù)后的有效指標(biāo)，為個(gè)性化治療方案的設(shè)計(jì)、改善預(yù)后提供理論依據(jù)。PDCD7基因的表達(dá)量的一種檢測(cè)方法為提取患者單個(gè)骨髓細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;設(shè)計(jì)PCR引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AML患者PDCD7基因的mRNA的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)方案中，具體的實(shí)驗(yàn)步驟為1.提取患者骨髓總RNAa)抽取患者骨髓液25ml，添加肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞，EP管收集510X106個(gè)細(xì)胞，加入lmlTRIzol;b)加入O.2ml氯仿后蓋緊管蓋，劇烈振蕩30s，靜置5min后，4t:下12000rpm離心15minjc)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的EP管中，加入lml異丙醇并混勻，室溫放置5min后，4。C下12000rpm離心15min;d)棄上清，加入lml75%的乙醇洗滌，室溫放置5min后，4t:下12000rpm離心5min;e)棄上清，空氣干燥10min，加入無RNase的水20y1，反復(fù)抽吸使RNA溶解；2.總cDNA合成按TAKARA公司PrimeScriptTMMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系6試劑使用量5xPrimeScriptbuffer2jilPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5jxlOligodT0，random6primer0.5(xltotalRNA500ngDEPC水補(bǔ)足至lOpl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件，37。Clh40min，85。C4min，在PTC-200PCR儀上進(jìn)行。3.測(cè)定PDCD7基因表達(dá)量a)以上述cDNA為模板，用上游引物5'-GGAGCAGGAACTCAAAGCAG3'(SEQID1)和下游引物5'-CGCTGAAGATGATGCGTAAA-3'(SEQID2)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷192bp;選用P-actin作為內(nèi)參，用上游引物5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'(SEQID3)和下游引物5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG3'(SEQID4)，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷186bp，反應(yīng)條件為95。C、20s預(yù)變性，95。C、15s變性，60°C、31s退火延伸，共40個(gè)循環(huán)；b)計(jì)算基因的表達(dá)量，計(jì)算方法為2—actX100X，式中，-ACT=(PDCD7的CT值-P—actin的CT值)?；騊CR產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示。圖中，M為標(biāo)記帶，l為P-actin產(chǎn)物帶，2為PDCD7mRNA產(chǎn)物帶。由電泳圖可知，引物具有很好的特異性。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)cDNA稀釋成多個(gè)濃度梯度，對(duì)于每一個(gè)稀釋樣品，都同時(shí)進(jìn)行基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增，計(jì)算出各基因與內(nèi)參基因的平均CT值以及ACT值，通過cDNA的相對(duì)濃度梯度對(duì)ACT值作圖，其結(jié)果如圖3所示。圖中直線斜率均小于O.10，絕對(duì)值接近于0，表明目的基因和內(nèi)參基因的CT值差(ACT)幾乎不隨模板濃度變化而變化，目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致。通過檢測(cè)PDCD7mRNA基因的表達(dá)量，判斷AML患者的病情發(fā)展或預(yù)后，可以針對(duì)性的設(shè)計(jì)治療方案，減少治療中的盲目性，提高患者的治愈率。序列表〈110〉南方醫(yī)科大學(xué)〈120〉PDCD7基因在急性髓系白血病預(yù)后中的應(yīng)用〈130〉〈160>4〈170>PatentInversion3.37〈210>1〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1ggagcagg朋ctca朋gc3g〈210〉2〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉2cgctg朋gatgatgcgte朋<210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列<400>3cgggaaatcgtgcgtgac〈210>4〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400>4cEiggEuaggEuaggctgg朋g說明書6/6頁20201819權(quán)利要求PDCD7基因在早期判斷急性髓系白血病預(yù)后中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了PDCD7基因在早期判斷急性髓系白血病預(yù)后中的應(yīng)用指標(biāo)。通過熒光定量PCR檢測(cè)了77例初次診斷并治療前的急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的PDCD7mRNA表達(dá)量。將所測(cè)結(jié)果與臨床特征、治療反應(yīng)及隨訪結(jié)果分析比較，發(fā)現(xiàn)PDCD7mRNA表達(dá)量大于5％的患者，其復(fù)發(fā)、難治的比例顯著高于表達(dá)量小于5％的患者。PDCD7mRNA表達(dá)量大于5％患者的生存期也顯著縮短，隨訪1年時(shí)的總生存率為45％，而PDCD7mRNA表達(dá)量小于5％患者的總生存率為80％。PDCD7mRNA的表達(dá)量可以作為判斷AML患者預(yù)后的指標(biāo)，為個(gè)體化治療方案的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101781681SQ20091021419公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年12月25日優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日發(fā)明者孟凡義,黃走方申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)