專利名稱：提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法及用該方法所產(chǎn)生的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高植物非生物脅迫耐受性和/或植物生物量的方法，更具體地說， 本發(fā)明涉及表達外源非生物脅迫_耐受性基因的植物。
背景技術(shù)：
非生物脅迫(也稱為“環(huán)境脅迫”)條件例如高鹽、干旱、洪澇、亞適溫度和有毒化 學物質(zhì)污染，嚴重損害農(nóng)作物。大多數(shù)植物有保護它們自己不受這些條件影響的進化策略。 然而，如果這些脅迫條件太嚴重并且持續(xù)太久，則對植物的發(fā)育、生長和大多數(shù)作物的產(chǎn)量 影響巨大。此外，大多數(shù)作物對非生物脅迫(ABS)十分敏感，因而為了經(jīng)濟作物的產(chǎn)量就需 要提供最適合的生長條件。連續(xù)處于脅迫而引起植物代謝的重大改變，將最終導致細胞死 亡和產(chǎn)量下降。因此，縱有廣泛深入研究和采用復雜的和強化的作物保護措施，非生物脅迫 條件造成的損失每年仍然以10億美元計(1，2)。開發(fā)脅迫耐受性植物至少是解決或調(diào)解某些這類問題的可能的策略。然而，用于 開發(fā)新的耐受ABS的植物品系的傳統(tǒng)植物育種策略，因其緩慢、耗時和結(jié)果難料，所以效率 相對低下。此外，有限的脅迫耐受性的種質(zhì)資源和遠緣植物種間雜交的不相容性是傳統(tǒng)育 種中遇到的重大難題。另外，導致ABS耐受性的細胞過程本質(zhì)上是復雜的而且包括細胞適 應(yīng)的多種機制和許多代謝途徑(4-7)。旨在使轉(zhuǎn)基因作物具有非生物脅迫耐受性的遺傳工程研究，在現(xiàn)有技術(shù)中已 有描述。Apse 禾口 Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13 :146_150，2002)、Quesada 等
(Plant Physiol. 130 :951_963，2002)、Holmstrom 等(Nature 379 :683_684，1996)、Xu 等(Plant PhysiolllO :249-257，1996)、Pilon-Smits 和 Ebskamp (Plant Physiol 107 125-130,1995)和 Tarczynski 等(Science 259 :508_510，1993)的許多研究全都試圖獲得 脅迫耐受性的植物。此外，一些美國專利和專利申請也描述了與脅迫耐受性相關(guān)的多核苷酸及其在獲 得脅迫耐受性植物中的應(yīng)用。美國專利號5，296，462和5，356，816描述了用編碼參與擬南 芥(Arabidopsis thaliana)冷適應(yīng)的蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，因而能促進轉(zhuǎn)化植物的冷 耐受性。美國專利號6，670，528描述了用編碼與脅迫效應(yīng)元件結(jié)合的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn) 化植物，因而能促進轉(zhuǎn)化植物對非生物脅迫的耐受性。美國專利號6，720，477描述了用編碼信號轉(zhuǎn)導脅迫相關(guān)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化植 物，因而能夠提高轉(zhuǎn)化植物對非生物脅迫的耐受性。
美國申請順序號09/938842和10/342224描述了非生物脅迫相關(guān)基因及其在賦予 植物對非生物脅迫的耐受性中的應(yīng)用。美國申請順序號10/231035描述了植物過量表達鉬輔因子硫化酶，因而提高其對 非生物脅迫的耐受性。雖然上述研究至少部分成功地獲得了脅迫耐受性植物，但仍需脅迫耐受性基因以 獲得廣泛耐受非生物脅迫條件的植物。在將本發(fā)明付諸實施時，發(fā)明人通過生物信息學和實驗室研究業(yè)已證實了一些新 的非生物脅迫耐受性基因，這些新基因能提高植物的非生物脅迫耐受性和/或生物量。

發(fā)明內(nèi)容
按照本發(fā)明的一方面，提供提高植物對非生物脅迫的耐受性的方法。該方法包括 在植物中表達外源多核苷酸，該外源多核苷酸與選自SEQ ID N0:l-18的多核苷酸至少有 90%同源。按照本發(fā)明的另一方面，提供提高植物對非生物脅迫的耐受性的方法。該方法包 括在植物中表達其外源多肽，該外源多肽包括選自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列。按照本發(fā)明的又一方面，提供提高植物生物量的方法。該方法包括在植物中表達 外源多核苷酸，該外源多核苷酸與選自SEQ ID NO :1-18的多核苷酸至少有90%同源。按照本發(fā)明的再一方面，提供提高植物生物量的方法。該方法包括在植物中表達 外源多肽，該外源多肽包括選自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列。按照本發(fā)明的再又一方面，提供包含外源多核苷酸的植物細胞，該多核苷酸與選 自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸至少有90%同源。按照本發(fā)明的再另一方面，提供包含外源多核苷酸的植物細胞，該外源多核苷酸 編碼包括選自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列的多肽。按照本發(fā)明的再另一方面，提供核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與選自SEQ ID NO 1-18的核苷酸序列至少有90%同源的多核苷酸和能夠在宿主細胞內(nèi)指導所述多核苷 酸轉(zhuǎn)錄的啟動子。按照本發(fā)明的再另一方面，提供核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括編碼包含選自SEQ ID NO :39-92的氨基酸序列的多肽的多核苷酸和能夠在宿主細胞內(nèi)指導所述多核苷酸轉(zhuǎn)錄 的啟動子。按照本發(fā)明的還又一方面，提供分離的多肽，該多肽所含的氨基酸序列與選自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸編碼的氨基酸序列至少有90%同源。按照本發(fā)明的另一方面，提供分離的多肽，該多肽包括選自SEQID NO :39_92的氨
基酸序列。按照下述的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的進一步特征，通過下述步驟來實現(xiàn)表達(i) 用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化植物的細胞；(ii)從所述細胞產(chǎn)生成熟植株；(iii)在適合所述成熟 植株中表達所述外源多核苷酸的條件下，栽培所述成熟植株。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，轉(zhuǎn)化是通過將核酸構(gòu)建體導入植物細胞 中來實現(xiàn)的，該構(gòu)建體包括外源多核苷酸和至少一個能夠在植物細胞內(nèi)指導外源多核苷酸 轉(zhuǎn)錄的啟動子。
按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述至少一個啟動子是組成型啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述組成型啟動子是CaMV 35S啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述組成型啟動子是At6669啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述至少一個啟動子是誘導型啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述誘導型啟動子是非生物脅迫誘導型 啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述至少一個啟動子是組織特異性啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述表達是通過用包括外源多核苷酸的 病毒感染植物來實現(xiàn)的。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述病毒是無毒病毒。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述非生物脅迫選自高鹽、失水、低溫、 高溫、重金屬毒性、無氧生活、營養(yǎng)缺乏、營養(yǎng)過剩、大氣污染和UV輻射。按照所達優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述植物是雙子葉植物。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述植物是單子葉植物。按照所述優(yōu)選實施方案的再進一步特征，所述植物細胞成為植物的一部分。本發(fā)明通過提供利用新的非生物脅迫耐受性基因提高植物非生物脅迫耐受性和/ 或生物量的方法，成功地克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。


本文僅通過實施例并參考附圖描述本發(fā)明，下面具體地參考附圖的細節(jié)，須強調(diào) 的是，所給出的具體細節(jié)僅僅作為實例，用于說明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且提 供這些詳細資料是為了提供所認為的對本發(fā)明的原理和構(gòu)思最有用最容易理解的描述。在 這方面，并沒有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更為詳細的說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細節(jié)，從 附圖獲取的說明，使得在實踐中如何使本發(fā)明的所述幾種形式具體化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言顯而易見的。圖1是說明從核酸序列數(shù)據(jù)庫中鑒定推定植物脅迫耐受性基因的流程圖。圖2a_b是說明開花期的T2轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟植株用At6669啟動子表達外源螢 光素酶轉(zhuǎn)基因的照片。相同植物在正常光照條件下(圖2a)和在暗處(圖2b)。在花組織 和根組織中觀察到證明螢光素酶表達的強發(fā)光。圖3說明在正常條件或脅迫條件下(分別用0或100M NaCl溶液灌溉)生長的轉(zhuǎn) 基因T1擬南芥(A.thaliana)植物的平均鮮重。用推定脅迫耐受性基因，或者用螢光素酶 報道基因(對照)轉(zhuǎn)化植物，所述基因處于At6669啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。按照單向ANOVA T檢驗，平均值士SD沒有顯著性差異。圖4a說明在正常條件或脅迫條件下(分別用0或100M NaCl溶液灌溉)生長的 轉(zhuǎn)基因T2擬南芥植物的平均鮮重。用本發(fā)明推定脅迫耐受性基因，或者用螢光素酶報道基 因(對照)轉(zhuǎn)化植物，所述基因處于35S啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。按照單向ANOVA T檢驗，平 均值士 SD沒有顯著性差異。圖4b說明在正常條件或脅迫條件下(分別用0或100M NaCl溶液灌溉)生長的
6轉(zhuǎn)基因T2擬南芥植物的平均鮮重。用本發(fā)明的推定脅迫耐受性基因，或者用螢光素酶報道 基因(對照)轉(zhuǎn)化植物，所述基因處于At6669啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。按照單向ANOVA T檢 驗，平均值士SD沒有顯著性差異。圖5說明在鹽脅迫條件下(用IOOmM NaCl溶液灌溉)生長的轉(zhuǎn)基因Tl擬南芥植 物與在正常條件下(只用水灌溉)生長的類似植物比較的相對鮮重(％ )。用本發(fā)明推定 脅迫耐受性基因，或者用螢光素酶報道基因(對照)轉(zhuǎn)化植物，所述基因處于At6669啟動 子的轉(zhuǎn)錄控制下。
具體實施例方式本發(fā)明是涉及利用新的非生物脅迫耐受性基因提高植物非生物脅迫耐受性和/ 或生物量的方法，并且涉及顯示出提高了對脅迫條件的耐受性和/或提高了累積生物量的 植物。參考附圖及附加說明可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不受下述描述或

中成分的構(gòu)建和安排細節(jié)的限制。本發(fā)明可以有其他實施方案，或者說可用各種 方法實踐或完成本發(fā)明。同樣，應(yīng)該理解，本文所用的用語和術(shù)語是用來描述而非限制。當將本發(fā)明付諸實施時，發(fā)明人應(yīng)用生物信息學技術(shù)鑒定了編碼推定非生物-脅 迫耐受性(ABST)蛋白的多核苷酸序列(實施例1)。分離所選擇的序列(實施例2)，克隆 到表達載體中(實施例3-4)，再導入擬南芥植物中(實施例5)。這些在鹽脅迫條件下或者 在正常條件下生長的植物，與沒有攜帶外源ABST基因的類似植物比較，都表現(xiàn)出顯著更高 的生物量(實施例6)。因此，按照本發(fā)明的一個方面，提供提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或植物 生物量的方法。該方法包括在植物中表達外源多核苷酸，該外源多核苷酸與選自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸至少有70%同源，優(yōu)選至少有80%同源，更優(yōu)選至少有85%同源，最優(yōu) 選至少有90%同源?；蛘撸景l(fā)明的外源多核苷酸編碼具有選自SEQ ID N0:39-92的氨基 酸序列的多肽。本文所用的術(shù)語“非生物脅迫”是指對植物的代謝、生長、繁殖和/或生存力的任 何負面影響。因此，非生物脅迫能夠被諸如以下的亞適環(huán)境生長條件所誘導高鹽、失水、洪 澇、低溫或高溫、重金屬毒性、無氧生活、營養(yǎng)缺乏、大氣污染或UV輻射。本文所用的術(shù)語“非生物脅迫耐受性”是指植物承受非生物脅迫時，其代謝、生長、 繁殖力和/或生存力無重大改變的能力。適用本發(fā)明方法的植物可以是任何單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉 米、小麥、大麥(barely)、黑麥、燕麥、水稻、大豆、花生、豌豆、小扁豆和苜蓿、棉花、油菜籽、 雙低油菜(canola)、胡椒、向日葵、馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、桉樹、樹木、觀賞植物、多年生 牧草、飼料作物。本文所用的術(shù)語“外源多核苷酸”是指在植物中不會自然表達的核酸序列，但是當 將其導入植物中會以穩(wěn)定或瞬時的方式產(chǎn)生至少一種多肽產(chǎn)物。在植物中表達本發(fā)明的外源多核苷酸，可通過下述方法付諸實施首先用外源多 核苷酸轉(zhuǎn)化植物的一種或多種細胞，其次從轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生成熟植株，最后在適合所述成熟
7植株中表達所述外源多核苷酸的條件下，栽培所述成熟植株。優(yōu)選轉(zhuǎn)化是通過將核酸構(gòu)建體導入植物細胞中來實現(xiàn)，該構(gòu)建體包含本發(fā)明的外 源多核苷酸和至少一個能在植物細胞內(nèi)指導外源多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子。下文將提供適合 的轉(zhuǎn)化方法的進一步詳細說明。本文所用的術(shù)語“啟動子”是指基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的DNA區(qū)，RNA聚合酶與之 結(jié)合后啟動RNA的轉(zhuǎn)錄。啟動子控制基因在何處(例如植物的哪一部分、動物的哪一器官 等等)和/或何時(例如生物體一生的哪一階段或狀態(tài))表達。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可采用任何合適的啟動子序列。優(yōu)選啟動子是組成型啟動 子、組織特異性啟動子或非生物脅迫誘導型啟動子。合適的組成型啟動子包括例如CaMV 35S啟動子(SEQ ID NO 19 ；Odell等，Nature 313:810-812,1985)；擬南芥 At6669 啟動子(SEQ IDNO 20)；玉米 Ubi 1 (Christensen 等， Plant Sol. Biol. 18 :675-689，1992)；水稻肌動蛋白(McElroy 等，Plant Cell 2:163-171， 1990) ；pEMU(Last 等，Theor. Appl. Genet. 81 :581_588，1991)；合成的 Super MAS(Ni 等， The Plant Journal 7 :661_76，1995)。其它組成型啟動子包括在以下美國專利號中的那些 啟動子5，659，026,5, 608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680、 5，268，463 和 5，608，142。合適的組織特異性啟動子包括但不限于由例如以下文獻所描述的葉特異性啟動 子Yamamoto 等，Plant J. 12 :255_265，1997 ；Kwon 等，Plant Physiol. 105 :357_67，1994 ； Yamamoto等，Plant Cell Physiol 35 :773_778，1994 ;Gotor等，Plant J. 3 :509_18，1993 ； Orozco 等，Plant Mol. Biol. 23 :1129_1138，1993 ；Matsuoka 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 9586-9590,1993。合適的非生物脅迫誘導型啟動子包括但不限于鹽誘導型啟動子，例如 RD29A(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331_340，1993)；干旱誘導型啟動 子，例如玉米 rabl7 基因啟動子(Pla 等，PlantMol. Biol. 21 :259_266，1993)、玉米 rab28 基因啟動子(Busk 等，Plant J. 11 1285-1295，1997)和玉米 Ivr2 基因啟動子(Pelleschi 等，Plant Mol. Biol. 39 =373-380,1999)；熱誘導型啟動子，例如番茄的熱番茄hsp80_啟動 子(美國專利號5，187，267)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還優(yōu)選適當?shù)倪x擇標記和/或復制起點。優(yōu)選所用的核酸構(gòu) 建體是穿梭載體，它在大腸桿菌(E. coli)能復制(其中構(gòu)建體包含適當?shù)倪x擇標記和復制 起點)并且與細胞增殖同步。按照本發(fā)明的構(gòu)建體可以是例如質(zhì)粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、 噬菌體、病毒或人工染色體。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用來穩(wěn)定地或瞬時地轉(zhuǎn)化植物細胞。在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化中，本 發(fā)明的外源多核苷酸整合到植物基因組中，因此具有穩(wěn)定遺傳的性狀。在瞬時轉(zhuǎn)化中，外源 多核苷酸由轉(zhuǎn)化的細胞表達但未整合到基因組中，因此具有瞬時性狀。有多種將外源基因?qū)雴巫尤~植物或雙子葉植物中的方法(Potrykus，I.， Annu. Rev. Plant. Physiol. ， Plant. Mol. Biol. (1991)42 205-225 ；Shimamoto 等， Nature (1989) 338 274-276)。使外源DNA穩(wěn)定整合到植物基因組DNA中的主要方法包括以下兩種主要方法(i) 土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移Klee 等(1987) Annu. Rev. PlantPhysiol. 38 467-486 ;Klee 禾口 Roger, CellCulture and Somatic CellGenetics of Plants,第 6 卷， Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J.禾口 Vasil,L.K.編著，Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)第 2-25 頁；Gatenby, Plant Biotechnology, Kung, S.禾口 Arntzen，C. J.編著，Butterworth Publishers,Boston,Mass. (1989)，第 93—112 頁。(ii) ^^ DNAjgA :Paszkowski Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,第 6 卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J.禾口 Vasil, L. K.編著，Academic Publishers, San Diego, Calif. , (1989)，第 52-68 頁；包括原生質(zhì) 體直接攝取 DNA 的方法，Toriyama, K.等(1988) Bio/Technology 6:1072-1074。植物細 胞短時電擊誘導的 DNA 攝入Zhang 等，Plant Cell Rep. (1988)7:379-384。Fromm 等， Nature (1986) 319 :791_793。通過粒子轟擊將DNA注入植物細胞或組織中，Klein等，Bio/ Technology (1988) 6 :559_563 ；McCabe 等，Bio/Technology (1988) 6 :923_926 ；Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79 206-209 ；采用微量加液器系統(tǒng)Neuhaus 等，Theor. Appl. Genet. (1987)75 :30_36 ；Neuhaus 禾口 Spangenberg，Physiol. Plant. (1990)79 :213_217 ； glass fibers or silicon carbide whisker transformation of cell cultures-embryos or callus tissue (玻璃纖維或金剛砂晶須轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)物、胚或愈傷組織)，美國專利號 5, 464, 765 nJ^by the direct incubation of DNAwith germinating pollen(DNA與萌發(fā)花 粉直接f桴育)，DeWet 等，Experimental Manipulation of Ovule Tissue, Chapman,G. P.禾口 Mantel 1, S. H.禾口 Daniels，W.編著，Longman, London, (1985)，第 197—209 頁；Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986) 83 :715_719。土壤桿菌系統(tǒng)包括采用質(zhì)粒載體，其含有整合到植物基因組DNA中的確定DNA片 段。植物組織的接種方法隨植物種和土壤桿菌傳遞系統(tǒng)而變化。廣泛應(yīng)用的方法是葉圓片 法，可用任何組織的外植體來進行，它為啟動整株植物分化提供良好來源。Horsch等，Plant MolecularBiology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1988),第 1-9 頁。一種補充的方法是用土壤桿菌傳遞系統(tǒng)與真空滲入相結(jié)合。土壤桿菌系統(tǒng)在創(chuàng)造轉(zhuǎn)基 因雙子葉植物方面特別有前途。有多種直接轉(zhuǎn)移DNA進入植物細胞的方法。電穿孔法，就是將原生質(zhì)體短時暴露 于強電場。微量注射法，就是用極細的微量加液器將DNA直接機械注入細胞內(nèi)。微粒轟擊 法，就是使DNA吸附在微粒上例如硫酸鎂晶體或鎢粒子上，然后用物理方法將微粒加速使 其進入細胞或植物組織內(nèi)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后，進行植物繁殖。最常用的方法是用種子進行植物繁殖。然而由于雜 合性，作物缺乏均一性，因此用種子繁殖再生有缺陷，因為植物是按照孟德爾定律控制的遺 傳變異產(chǎn)生種子?；旧?，每粒種子在遺傳上都是不同的，每粒種子的生長都會有其獨特的 性狀。因此，優(yōu)選產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物，致使再生的植物有親本轉(zhuǎn)基因植物的相同性狀和特征。因 此，優(yōu)選用微型繁殖法(micropropagation)再生轉(zhuǎn)化植物，它能快速地、一致地繁殖轉(zhuǎn)化 植物。微型繁殖法是用從所選擇的親本植物或栽培品種切下的一塊組織來培育新一代 植物的方法。這個方法能大量繁殖具有表達融合蛋白的優(yōu)選組織的植物，所產(chǎn)生的新一代 植物在遺傳上與原始植物完全相同，且有其全部特征。微型繁殖法能在短期內(nèi)大量生產(chǎn)優(yōu) 質(zhì)的植物材料、快速繁殖所選擇的保持原始轉(zhuǎn)基因植物或原始轉(zhuǎn)化植物特征的栽培品種。克隆植物的優(yōu)點在于植物繁殖的速度，所產(chǎn)生植物的品質(zhì)一致。微型繁殖法是多階段方法，各階段間需要改變培養(yǎng)基或生長條件。因此，微型繁殖 法包括四個基本階段第一階段，初始組織培養(yǎng)；第二階段，組織培養(yǎng)物擴增；第三階段，分 化和植株形成；第四階段，溫室栽培和鍛練。在第一階段，初始組織培養(yǎng)，建立組織培養(yǎng)物 并保證無污染。在第二階段，初始組織培養(yǎng)物擴增直至組織樣本的數(shù)量足以滿足生產(chǎn)要求。 在第三階段，使第二階段長出的組織樣本分裂，直到長成單個小植株。在第四階段，將轉(zhuǎn)化 小植株轉(zhuǎn)入溫室進行鍛練，在此植株對光的耐受性逐漸提高，以便它能在自然環(huán)境中生長。優(yōu)選如上所述所產(chǎn)生的成熟轉(zhuǎn)化植物根據(jù)非生物脅迫耐受性作進一步選擇。因 此，將轉(zhuǎn)化植物和未轉(zhuǎn)化(野生型)植物暴露在非生物脅迫條件下，例如失水、亞適溫度、營 養(yǎng)缺乏或優(yōu)選鹽脅迫條件下。鹽脅迫可以多種方式實現(xiàn)，例如給植物灌溉高滲溶液、在高滲 生長溶液(例如Hoagland溶液)中水培法栽培植物或者在高滲培養(yǎng)基(例如MS培養(yǎng)基)中 培育植物。由于不同植物對鹽的耐受性極其不同，因此灌溉水、生長溶液或生長培養(yǎng)基中的 鹽濃度優(yōu)選按照特定的植物的栽培品種或變種的特殊特征進行調(diào)節(jié)，以便對植物的生理學 和/或形態(tài)學施以溫和或適度的影響(關(guān)于適當濃度的指南請參見Bernstein和Kafkafi， Root Growth Under Salinity Stress :Plant Roots,The Hidden Half,第三版,Waisel Y, Eshel A 禾口 Kafkafi U.(編著)Marcel Dekker Inc.，NewYork，2002 及其中的參考文獻)。 隨后，時時監(jiān)測暴露于脅迫條件下的植物直至野生型植物出現(xiàn)重大的生理學和/或形態(tài)學 影響。接著，沒有表現(xiàn)出重大生理學和/或形態(tài)學影響的轉(zhuǎn)化植物，或者表現(xiàn)出生物量高于 野生型的轉(zhuǎn)化植物則被鑒定為非生物脅迫耐受性植物。雖然現(xiàn)在優(yōu)選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化作用，但是葉細胞、分生組織細胞或整株植物的瞬時轉(zhuǎn) 化也受本發(fā)明重視。瞬時轉(zhuǎn)化可用上述任何一種直接DNA轉(zhuǎn)移方法，或用修飾植物病毒的病毒感染來 實現(xiàn)。在轉(zhuǎn)化植物宿主中表明有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。用植物病毒轉(zhuǎn)化植物 在以下文獻中有描述美國專利號4，855，237 (BGV)、EP-A 67，553 (TMV)、日本公開申請?zhí)?63-14693 (TMV) ,EPA194, 809 (BV) ,EPA 278, 667 (BV)；和 Gluzman，Y.等，Communicationsin Molecular Biology :Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,第 172-189頁(1988)。在W087/06261中描述了在許多宿主(包括植物)中表達外源DNA所 用的假病毒顆粒。優(yōu)選本發(fā)明的病毒是無毒的因而不能引致嚴重癥狀例如降低生長速率、花葉、環(huán) 斑、卷葉、黃葉、條紋、長痘、長瘤和陷斑。合適的無毒病毒可以是天然存在的無毒病毒或 人工減毒的病毒。病毒的減毒可用本領(lǐng)域通曉的方法來實施，包括但不限于亞致死加熱、 化學處理或定點誘變技術(shù)，例如 Kurihara 禾口 Watanabe (Molecular PlantPathology 4 259-269，2003)、Gal-on 等(1992)、Atreya 等(1992)和 Huet 等(1994)所描述的。合適的病毒株可從現(xiàn)有的資源取得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type culture Collection，ATCC)或從感染植物中分離。從感染植物組織中分離病 毒可用本領(lǐng)域通曉的技術(shù)進行，例如由Foster和Tatlor編著，‘‘Plant Virology Protocols :From Virus Isolation toTransgenic Resistance(Methods in Molecular Biology (Humana卩1~)，第81卷)〃，Humana Press，1998。簡而言之，將認為含有高濃度合適病毒的感染植物的組織，優(yōu)選嫩葉和花瓣，在緩沖液(例如磷酸緩沖液)中研磨獲得病毒 感染液，其可在后續(xù)接種中使用。植物RNA病毒的構(gòu)建，將非病毒外源多核苷酸序列導入植物中并使其表達，已為 上述和下述文獻所證實Dawson，W. 0.等，Virology (1989) 172 :285_292 ；Takamatsu 等， EMBO J. (1987)6 :307_311 ；French 等，Science (1986) 231 1294-1297 ；Takamatsu 等，F(xiàn)EBS Letters(1990)269 :73_76。當病毒是DNA病毒時，可對病毒本身進行適當修飾，或者，為了便于構(gòu)建所需的含 有外源DNA的病毒載體，可將病毒首先克隆到細菌質(zhì)粒上。然后，從質(zhì)粒切下病毒。如果病 毒是DNA病毒，則可將細菌的復制起點與病毒DNA連接，再由細菌復制。該DNA的轉(zhuǎn)錄和翻 譯將產(chǎn)生外殼蛋白，將病毒DNA包入其中。如果病毒是RNA病毒，通常進行cDNA克隆，再插 入質(zhì)粒中。然后用該質(zhì)粒進行所有的構(gòu)建。然后，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的病毒序列，翻譯病毒基因 產(chǎn)生外殼蛋白，給病毒RNA包衣殼，產(chǎn)生RNA病毒。植物RNA病毒的構(gòu)建，將非病毒外源多核苷酸序列(例如在本發(fā)明構(gòu)建體中所包 括的那些序列)導入植物中并使其表達，已為上述文獻以及美國專利號5，316，931所證實。在一個實施方案中，提供植物病毒多核苷酸，其中在病毒多核苷酸中缺失了天然 外殼蛋白的編碼序列，插入了非天然植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然啟動子、優(yōu)選非 天然外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，其能在植物宿主內(nèi)表達，包裝重組植物病毒多 核苷酸，確保宿主被重組植物病毒多核苷酸系統(tǒng)感染。另一方面，外殼蛋白基因可以因插入 其中的非天然多核苷酸序列所失活，因此產(chǎn)生蛋白。重組植物病毒多核苷酸可含有一個或 多個另外的非天然亞基因組啟動子。每個非天然亞基因組啟動子能在植物宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄或表 達相鄰基因或多核苷酸序列，但不能彼此重組，也不能與天然亞基因組啟動子重組。如果包 括不止一個多核苷酸序列，那么非天然(外源)多核苷酸序列可以鄰近在天然植物病毒亞 基因組啟動子或天然和非天然植物病毒亞基因組啟動子插入。在寄主植物中，非天然多核 苷酸序列在亞基因組啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄或表達，產(chǎn)生所需產(chǎn)物。在第二個實施方案中，提供重組植物病毒多核苷酸，如同在第一個實施方案中一 樣，只是將天然外殼蛋白編碼序列置于一個非天然外殼蛋白亞基因組啟動子鄰近位置而不 是置于非天然外殼蛋白編碼序列鄰近位置。在第三個實施方案中，提供重組植物病毒多核苷酸，其中天然外殼蛋白基因鄰近 其亞基因組啟動子，在所述病毒多核苷酸中插入了一個或多個非天然亞基因組啟動子。所 插入的非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄或表達相鄰基因，但不能彼此重組， 也不能與天然亞基因組啟動子重組。非天然多核苷酸序列可以鄰近在非天然亞基因組植物 病毒啟動子插入，以便在寄主植物中，所述序列在亞基因組啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄或表達，產(chǎn) 生所需產(chǎn)物。在第四個實施方案中，提供重組植物病毒多核苷酸，如同在第三個實施方案中一 樣，只是天然外殼蛋白編碼序列被非天然外殼蛋白編碼序列所置換。病毒載體被由重組植物病毒多核苷酸編碼的外殼蛋白包入衣殼內(nèi)，產(chǎn)生重組植物 病毒。重組植物病毒多核苷酸或重組植物病毒常常用來感染合適的寄主植物。重組植物病 毒多核苷酸能在宿主內(nèi)復制、在宿主內(nèi)系統(tǒng)分布、在宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄或表達外源基因(外源多 核苷酸)，產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
11
給植物接種病毒的技術(shù)可在以下文獻中找到Foster和Taylor編著，"Plant Virology Protocols :From Virus Isolation to TransgenicResistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr),第 81 卷) “,Humana Press,1998 ；Maramorosh 禾口 Koprowski 編著，“Methods inVirology“,第 7 卷,Academic Press,New Yorkl967_1984 ； Hill, S Α. “ Methods in Plant Virology “ , Blackwell, Oxford,1984 ；ffalkey, D.G. Α. “ Applied Plant Virology “ , Wiley, New York,1985 ；Kado 禾口 Agrawa 編 著，“Principles and Techniques in Plant Virology" , Van Nostrand-Reinhold, New York。除上所述，也可以將本發(fā)明的多核苷酸引入葉綠體基因組中，從而能使葉綠體表達。將外源多核苷酸序列引入葉綠體基因組中的技術(shù)是已知的。該技術(shù)包括下述程 序。首先，化學處理植物細胞以減少每個細胞葉綠體的數(shù)目至大約一個。然后，用粒子轟擊 將外源多核苷酸導入細胞中，旨在將至少一個外源多核苷酸分子導入葉綠體中。選擇外源 多核苷酸以便通過同源重組整合到葉綠體基因組，這由葉綠體所固有的酶容易實現(xiàn)。最后， 除了目標基因外，外源多核苷酸還包括至少一段源自葉綠體基因組的多核苷酸序列。此外， 外源多核苷酸包括選擇標記，其用作通過序貫選擇程序確保選擇后全部或幾乎全部的葉綠 體基因組拷貝包括外源多核苷酸。有關(guān)該技術(shù)更詳細的內(nèi)容參見美國專利號4，945，050和 5，693，507，所述專利通過引用結(jié)合到本文中。因此，多肽可由葉綠體的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)產(chǎn) 生并且可以整合到葉綠體內(nèi)膜中。由于植物非生物脅迫耐受性可以包括多個起相加作用或協(xié)同作用的基因(參見 例如Quesda等，Plant Physiol. 130 :951_063，2002)，本發(fā)明也提出在一種寄主植物中表 達多種外源多核苷酸，從而獲得優(yōu)良的非生物脅迫耐受性。在一種寄主植物中表達多種外源多核苷酸，可通過將多個核酸構(gòu)建體共同導入一 個植物細胞中來實現(xiàn)，每個核酸構(gòu)建體都包括不同的外源多核苷酸?？捎帽疚纳鲜龇椒▽?轉(zhuǎn)化細胞再生成為成熟植株?；蛘?，在一種寄主植物中表達多種外源多核苷酸，也可通過將一個包括多個不同 的外源多核苷酸的核酸構(gòu)建體共同導入一個植物細胞中來實現(xiàn)?？梢栽O(shè)計具有一個啟動子 序列的構(gòu)建體，該啟動子序列能夠轉(zhuǎn)錄包括所有不同外源多核苷酸序列的多順反子信使。 為了能共同翻譯由多順反子信使編碼的不同多肽，多核苷酸序列可以通過內(nèi)部核糖體進入 位點(IRES)序列相互連接，該核糖體進入位點序列促進位于IRES序列下游的多核苷酸序 列的翻譯。在這種情況下，所轉(zhuǎn)錄的編碼上述不同多肽的多順反子RNA分子，自加帽的5’ 端起開始翻譯，而且自多順反子RNA分子的兩個內(nèi)部IRES序列開始翻譯，從而在細胞內(nèi)產(chǎn) 生所有不同的多肽?；蛘?，構(gòu)建體可以包括幾個啟動子序列，每個啟動子序列都與不同的外 源多核苷酸序列連接。使用上文所述方法，可以將用包括多種不同的外源多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物 細胞再生成為成熟植株?；蛘撸谝环N寄主植物中表達多種外源多核苷酸，可以通過將不同的核酸構(gòu)建體 導入多種植物中來實現(xiàn)，其中所述不同的核酸構(gòu)建體包括不同的外源多核苷酸。然后，可以 采用常規(guī)植物育種技術(shù)，讓再生的轉(zhuǎn)化植物雜交，從所產(chǎn)生的子代中選出具有優(yōu)良的非生
12物脅迫耐受性和/生物量性狀的子代。因此，本申請?zhí)峁├眯碌姆巧锩{迫耐受性基因安全、經(jīng)濟有效地提高各種經(jīng) 濟作物的非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，通過以下非限制性的實施例，本發(fā)明的其它目的、優(yōu) 勢和新的特征，是顯而易見的。另外，本文上述的和在所附權(quán)利要求部分中要求保護的本發(fā) 明的各個不同的實施方案和各個不同的方面，都可以在以下實施例中找到實驗支持。實施例下面參考以下實施例以及上文的描述，以非限制性的方式說明本發(fā)明。一般而言，本文所用的命名法和本發(fā)明中所用的實驗室程序包括分子技術(shù)、生 物化學技術(shù)、微生物學技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中都有詳細的解釋。參見 例如‘‘Molecular Cloning :Alaboratory Manual ‘‘ Sambrook 等(1989) ； ‘‘ Current Protocols in MolecularBiology “第 I-III 卷 Ausubel，R. M.編著(1994) ；Ausubel 等，“CurrentProtocoIs in Molecular Biology“ , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning ", Johnffiley&Sons, New York(1988) ；Watson 等， “Recombinant DNA “，Scientific American Books, New York ；Birren 等(編著) "GenomeAnalysis :A Laboratory Manual Series “,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)； 美國專利號 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和 5，272，057 中所述的 方法；“Cell Biology =ALaboratory Handbook “，第 I-III 卷 Cellis, J. E.編著 (1994) ；〃 CurrentProtocols in Immunology"，第 I-III 卷，Coligan J. Ε.編著(1994)； Stites 等(編著)，“Basic and Clinical Immunology “(第 8 版)，Appleton&Lange, Norwalk, CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (編著)，“Selected Methods inCellular Immunology “ , W. H. Freeman and Co. , New York(1980)；通用的免疫測定在專利文獻 和科學文獻中有全面的描述，參見例如美國專利號3，791,932,3,839, 153,3,850, 752、 3，850，578,3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533, 3，996，345,4, 034，074,4, 098，876,4, 879，219,5, 011，771 和 5，281，521 ； “ Oligonucleo tideSynthesis “ Gait, Μ. J. Hlr (1984) ； “ Nucleic Acid Hybridization " Hames, B. D.禾口 Higgins S. J.編著，(1985) ； “ Transcription and Translation “ Hames, B. D.和 Higgins S.J.編著，(1984) ； “ Animal Cell Culture “ Freshney, R. I.編著 (1986) ；〃 Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ；〃 APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.，(1984)；禾口" Methodsin Enzymology“，第 1-317卷， Academic Press ； “ PCR Protocols :A GuideTo Methods And Applications" ,Academic Press,San Diego,CA(1990) ；Marshak " Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ；IjfWSiSilK^iS 過引用全部結(jié)合到本文中。通過本文件還可以提供其他的一般性參考文獻。相信其中這些 程序是本領(lǐng)域眾所周知的，只是為方便讀者而提供。除非另有定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù) 人員所理解的含義相同。雖然在本發(fā)明的實踐或檢驗中可應(yīng)用與本文描述的類似或等同的 方法與材料，但是下文還是說明了合適的方法與材料。
實施例1鑒定推定非生物脅迫耐受性基因推定非生物脅迫耐受性(ABST)基因選自番茄表達序列標簽(EST)和cDNA的NCBI 數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫序列是用LEADS 軟件(Compugen)聚類和裝配的。聚類導致超過20，000 個聚類，每一聚類都代表不同的基因。通過匯集包括在含每個聚類的序列記錄中的全部關(guān) 鍵詞，匯編了每個聚類的表達概況。然后篩選包括來源于文庫的多核苷酸的聚類，該文庫用 與ABST有關(guān)的關(guān)鍵詞確認。將所選聚類進一步過濾，排除任何每個聚類包括超過100EST 的聚類和/或任何少于50%序列用ABST相關(guān)關(guān)鍵詞注釋的聚類?，F(xiàn)有技術(shù)ABST植物基因可從下述出版物確認=Quesada等(PlantPhysiol. 130 951-963,2002) ；Apse禾口Blumwald(Curr Opin Biotechnol. 13 146-150，2002) ；Rontein等 (Metab Eng 4 =49-56,2002)；及其中的參考文獻。運用BLAST程序，將已知的植物ABST基因 與聚類的番茄核酸序列進行比對。e-分值小于5的番茄序列被鑒定為ABST直向同源物。通 過使用關(guān)鍵詞“root (根)”、“crown gall (冠癭)'V'nutrient (營養(yǎng)物)”、“callus (愈傷組 織)”、“disease (病害)”、“pathogen (病原體)”、“elicitor (激發(fā)子)”和“pseudomonas (假 單胞桿菌)”，可搜索聚類的番茄序列記錄，鑒定出另外的現(xiàn)有技術(shù)番茄ABST基因。最后，將所有經(jīng)鑒定的現(xiàn)有技術(shù)ABST基因與如上所述選擇的番茄基因聚類輸出 組匹配(運用BLAST軟件進行序列比對)。結(jié)果，在與現(xiàn)有技術(shù)ABST基因匹配的聚類輸出 組中所選出的基因的大約40%被證實是已知的ABST基因，表明所選聚類的其余基因能夠 潛在提高植物的非生物脅迫耐受性。運用Vector NTI 程序組(suite) (InforMax, U. K.)第 6 版(HastingSoftware, Inc :www. Renerunner. com/)，根據(jù)ORF (可讀框)的存在，對所選出的多核苷酸序列(表la) 進行分析。使用Blast (www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/)，將每個這樣的多核苷酸序列中所 鑒定的ORF與Genbank數(shù)據(jù)庫序列進行比較；將表現(xiàn)出與一個或多個Genbank序列有最高 同源性的ORF作圖，以鑒定ATG起始密碼子。然后，將該ORF的ATG起始密碼子位置與經(jīng)鑒 定的多核苷酸序列的ATG起始密碼子位置進行比較，以證實本文所述的18個序列中的每個 序列都包括全長ORF和ATG起始密碼子(因而鑒定為“推定ABST基因”)。表 Ia推定ABST基因
ABST No.SEQ ID No.1132536410511612719822924102611
1權(quán)利要求
一種提高植物對非生物脅迫的耐受性的方法，該方法包括在植物中表達外源多核苷酸，該外源多核苷酸編碼的多肽與選自SEQ IDNO1 17或18編碼的氨基酸序列至少有80％同源，因而能提高植物對非生物脅迫的耐受性。
2.一種提高植物生物量的方法，該方法包括在植物中表達外源多核苷酸，該外源多核 苷酸編碼的多肽與選自SEQ ID NO :1-17或18編碼的氨基酸序列至少有80%同源，因而能 提高植物的生物量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達通過下述步驟來實現(xiàn)(a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細胞；(b)從所述細胞產(chǎn)生成熟植株；(c)在適合所述成熟植株中表達所述外源多核苷酸的條件下，栽培所述成熟植株。
4.一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包括編碼與選自SEQ ID N0:l-17或18編碼的氨基 酸序列至少有80%同源的多肽的多核苷酸和能夠在宿主細胞中指導所述多核苷酸轉(zhuǎn)錄的 啟動子。
5.一種分離的多肽，所述多肽包含與選自SEQ ID N0:l-17或18編碼的氨基酸序列至 少有80%同源的氨基酸序列。
6.一種植物細胞，所述植物細胞包含編碼與選自SEQ ID N0:l-17或18編碼的氨基酸 序列至少有80%同源的多肽的外源多核苷酸。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述表達通過下述步驟來實現(xiàn)(a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細胞；(b)從所述細胞產(chǎn)生成熟植株；和(c)在適合所述成熟植株中表達所述外源多核苷酸的條件下，栽培所述成熟植株。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述轉(zhuǎn)化是通過將核酸構(gòu)建體導入所述植物細胞中來實 現(xiàn)，該核酸構(gòu)建體包括所述外源多核苷酸和至少一個能夠在所述植物細胞中指導所述外 源多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子。
9.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一個啟動子是組成型 啟動子。
10.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子是CaMV 35S啟動子。
11.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子是At6669啟動子。
12.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一個啟動子是誘導型 啟動了。
13.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述誘導型啟動子是非生物脅 迫誘導型啟動子。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述表達是通過用包括所述外源多核苷酸的病毒感染 所述植物來實現(xiàn)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述病毒是無毒病毒。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述非生物脅迫選自高鹽、失水、低溫、高溫、重金屬毒性、 無氧生活、營養(yǎng)缺乏、營養(yǎng)過剩、大氣污染和紫外輻射。
17.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
18.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述植物是單子葉植物。
19.權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述宿主細胞是植物細胞。
20.權(quán)利要求1或2的方法、權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求4的分離的多肽或權(quán) 利要求5的植物細胞，其中所述氨基酸序列選自SEQ ID N0:39-92。
全文摘要
本發(fā)明提供了提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法及用該方法所產(chǎn)生的植物。本發(fā)明提供了提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或增加植物的生物量的多核苷酸序列及其使用方法。
文檔編號C12N15/82GK101942449SQ20091021713
公開日2011年1月12日 申請日期2004年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者E·戈蘭, G·羅南, H·卡奇, R·梅斯納 申請人:伊沃基因有限公司