專利名稱：：一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種重組人單純皰疹病毒I蛋白和以它作為抗原的檢測試劑盒及其制備疫苗的應用。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)，呈球形，基因組為一線性DNA分子，由共價連接的長片段(L)和短片段(S)組成。30多種不同蛋白組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白(如衣殼蛋白、囊膜蛋白)，保護HSV的DNA，在HSV的致病作用和誘導機體免疫應答中起重要作用。病人是傳染源，主要通過直接密切接觸和性接觸傳播。HSV經(jīng)口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破損皮膚等多種途徑侵入機體。人感染非常普遍，感染率達80%90%，常見的臨床表現(xiàn)是粘膜或皮膚局部集聚的皰疹，偶而也可發(fā)生嚴重的全身性疾病，累及內(nèi)臟。HSV還可通過胎盤感染，影響胚胎細胞有絲分裂，易發(fā)生流產(chǎn)、造成胎兒畸形、智力低下等先天性疾病。約40X60X的新生兒在通過HSV感染的產(chǎn)道時可被感染，出現(xiàn)高熱、呼吸困難和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，其中60%70%受染新生兒可因此而死亡，幸存者中后遺癥可達95%。此外一些調(diào)查研究表明HSV可能與唇癌、外陰癌及子宮頸癌有關(guān)(KriebsJM.Understandingherpessimplexvirus-transmission,diagnosis,andconsiderationsinpregnancymanagement.JMidwiferyWomensHealth.2008May_Jun;53(3):202-8)。建立HSV感染的快速、準確檢測方法是預防HSV感染的關(guān)鍵所在。人單純皰疹病毒分為I型和II型，目前皰疹病毒感染診斷方法有病毒分離(TanchevS，ShentovB.Herpessimplexvirusinfectioninpregnancyandtransmissiontoneonatal.AkushGinekol(Sofiia).2005;44(6):31-5.)、PCR法(KimberlinDW.Diagnosisofherpessimplexvirusintheeraofpolymerasechainreaction.PediatrInfectDisJ.2006S印；25(9):841-2.)和血清學檢查(EingBR，LippeltL，LorentzenEU，etal.Evaluationofconfirmatorystrategiesfordetectionoftype—specificantibodiesagainstherpessimplexvirustype2.JournalofCIinicalMicrobiology.2002，40(2):407_413;StrickL，WaldA.Type-specifictestingforherpessimplexvirus[J].ExpertRevMolDiagn，2004，4(4):443-453;MartinsTB，WelchRJ，HillHR，LitwinCM.ComparisonofaMultiplexedHSVType-specificIgMSerologyAssaytoELISA，ImmunoblotandWesternBlot.ClinVaccineImmunol.2008Nov19.)。血清學檢查簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用。在全球范圍內(nèi)，目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下，通過接種疫苗預防病毒感染成為一種重要的醫(yī)學干預手段。同時，HSV疫苗的研制也是進行HSV研究的重要領(lǐng)域之一。具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇的HSV蛋白抗原，在HSV的診斷和疫苗研制領(lǐng)域具有重要的實際應用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG的基因片段，它的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，它的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，是由下述方法制備的a、人工合成引物P1:5'ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCG3'P2:5'ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGG3'b、以人單純皰疹病毒培養(yǎng)物為模板，PCR擴增，獲得基因片段HSVIgG;c、將基因片段HSVIgG插入表達載體pET-28a中，獲質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG;d、質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG轉(zhuǎn)染埃希氏大腸桿菌BL21(DE3)中；f、細菌破碎，蛋白純化，得重組蛋白HSVIgG。本發(fā)明又一個目的是提供一種重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體檢測試劑盒，是以HSVIgG為抗原，標記物為膠體金的IgM抗體膠體金檢測試劑盒或標記物為辣根過氧化物酶的IgM抗體酶聯(lián)檢測試劑盒；所述的一種重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體膠體金檢測試劑盒，是由以下方法制備的1)取l.Og的HAuCl4.H20溶解于100ml純化水中，配成1%氯金酸溶液；取1%氯金酸溶液1ml加入100ml沸水中，加入1%檸檬酸三鈉2ml，繼續(xù)煮沸30min，合成膠體金；2)取6ml合成的膠體金溶液，在400-700nm處進行掃描檢驗；取合成的約30nm膠體金406ml，用0.1MK2C03調(diào)ra至7，量取5mg/mlHSVIgG2.65ml用PH8.2的20mMTris-Cl稀釋至40ml，邊攪拌邊加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，量取1%BSA40ml，邊攪拌邊加入，繼續(xù)攪拌lOmin，3000r/min4。C離心10min，去沉淀，上清重新平衡后(調(diào)至ffl至7)，12000r/minfC離心45min，去上清，重復2次；用質(zhì)控血清對膠體金復合物進行檢驗，檢驗合格后，HSVIgG膠體金復合物在原液至稀釋一倍之間、噴金量為25.0iil/cm包被載金墊，然后在37t:、相對濕度30%以下通風干燥16-22小時后切割；3)預切割NC膜(來源上海金標公司；型號HF12002)，粘貼背板，用濃度2.Omg/ml包被抗人IgM抗體，劃線量為1.OiU/cm;和按包被濃度為5.Omg/ml、包被量為1.OiU/cm兔抗單純皰疹病毒I型抗體劃線包被于NC膜上，在37t:、相對濕度30%以下的條件下干燥1.0小時。4)撕掉包被檢測線和質(zhì)控線的帶背板NC膜檢測線端的紙膜，將HSVIgG膠體金結(jié)合物墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，交叉約lmm，壓實，將裁好的載樣墊粘貼在HSVIgG膠體金結(jié)合物墊的下端，壓實，將裁好的吸水墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，將貼好的檢測板兩端裁切去掉lcm，用切條機切成4mm寬，封裝。本發(fā)明又一個目的是一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG在制備人單純皰疹病毒I疫苗的應用。本發(fā)明通過計算機分析人單純皰疹病毒I的全部氨基酸序列篩選出人單純皰疹病毒I的型特異性蛋白gG的優(yōu)勢抗原表位，包括人單純皰疹病毒gG從N-末端第295位到4第502位的208個氨基酸。其中，gG目的肽段DNA序列是gG第883位到第1506位核苷酸。根據(jù)目的片段的DNA序列，即HSVI的gG上目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點，設(shè)計了PCR引物P1，P2;用于擴增gG第883位到第1506位核苷酸。引物Pl和P2分別帶有NdeI和XhoI的酶切位點，并共同對應于gG上述片段的5'末端3'末端。生產(chǎn)了一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，其核苷酸系列序列如SEQIDNo.l所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，簡稱HSVIgG，能夠避免由于蛋白質(zhì)抗原純度低或特異性差造成假陽性而降低檢測特異性等問題，為人單純皰疹病毒感染的檢測提供更為特異、準確的原料。利用本發(fā)明一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG為抗原，制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好地滿足了人皰疹病毒感染臨床診斷的需要，作為疫苗接種，可以預防病毒感染。圖1表達質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG的構(gòu)建流程圖。圖2PCR擴增產(chǎn)物HSVIgG的凝膠電泳圖，HSV為HSVIgG。圖3誘導后菌體12%SDS-PAGE電泳圖，其中M表示Marker,1表示目的蛋白。具體實施例方式實施例一一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG的制備1.人單純皰疹病毒I蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆人工合成引物序列如下PI:ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCGP2:ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGG以上引物由華美生物技術(shù)有限公司合成；以人單純皰疹病毒培養(yǎng)物(中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所贈)為模板，以引物PI和P2擴增得到目的基因重組片段gG。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如附圖1所示。切割含目的DNA條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱TAKARAMiniBESTPlasmidpurification)回收目的基因HSVIgG，操作按產(chǎn)品說明書進行。2.表達載體pET-28a-HSVI的構(gòu)建及鑒定pET-28a載體(購自華美生物技術(shù)有限公司)與PCR擴增產(chǎn)物gG目的DNA片段經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切，產(chǎn)物純化(采用TAKARAMiniBESTPlasmidpurification試劑盒，購自六合通_北京TAKARA公司)后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37。C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落，堿裂解法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增，對有擴增產(chǎn)物的重組子質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶Ndel和EcoRI雙酶切、鑒定，其中有3個重組子為陽性重組子。從3個陽性重組子中選一個陽性重組子送賽百勝公司測序鑒定，結(jié)果表明該質(zhì)粒上確實插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質(zhì)粒命名為表達質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG。3.—種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG的工程菌的構(gòu)建將表達質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG用化學轉(zhuǎn)化法((美)J.薩姆布魯克(Jos印hSambrook)，(美)D.W.拉塞爾(DavidW.Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實驗指南.科學出版社，2002.)轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)菌株(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37t:倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導表達5小時，誘導后的菌體用12%SDS-PAGE分析(同上文獻)，結(jié)果如附圖3所示，表達人單純皰疹病毒蛋白的菌株即為所需的工程菌株用8%甘油-70"保存。4.—種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG的表達純化誘導培養(yǎng)已構(gòu)建的表達的一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG大腸埃希氏菌CGMCCNo.株菌，用IPTG誘導表達5小時，離心收集菌體，以1:10(W/V)加入菌體裂解液(50mmpH8.0Tris-Cl，50mmNaCl，50%甘油)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30分鐘，經(jīng)超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒，超聲80次)、組氨酸親和柱(GlutathioneS印harose4B柱料50ml裝柱，400mlPBS緩沖液平衡過柱，流速5ml/min;超聲離心后的上清液用200mlPBS稀釋后上樣，流速3ml/min;400mlPBS緩沖液洗柱，流速5ml/min;250ml洗脫緩沖液洗脫，流速3ml/min，紫外檢測儀280nm檢測，收集洗脫峰)和離子交換柱層析(100mlChelatingS印haroseFF裝柱，300ml200mm的NiCl2過柱，流速5ml/min;500ml平衡緩沖液洗注，流速10ml/min;將組氨酸親和柱純化收集液上柱，流速3ml/min，500ml平衡緩沖液洗注，流速5ml/min;用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測儀280nm檢測吸收值，收集洗脫峰；SDS-PAGE電泳檢測純化組分)得到純化的重組蛋白。5.重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgGWestern-blot驗證為驗證一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG蛋白質(zhì)與抗HSVI抗血清反應性及重組目的基因獲得表達并具有抗原性，用Western-blot法進行了測試。陽性血清為10份兔抗HSVI抗體陽性血清(購自北京百安天地醫(yī)藥科技有限公司)和30份人抗HSVI抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。陰性血清為10份對照正常兔血清和30份人抗HSVI抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。結(jié)果如表1。表1HSVIgGWestern-blot驗證結(jié)果血清樣品總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)陽性檢出率陰性檢出率兔抗HSVI抗體陽性血清10100100%0對照正常兔血清100100100%人抗HSVI抗體陽性血清30300100%0人抗HSVI抗體陰性血清300300100%結(jié)果顯示，用HSVI病毒培養(yǎng)物免疫兔子所得的10份兔抗HSVI抗體陽性血清和630份人抗HSVI抗體陽性血清全部與表達抗原產(chǎn)生陽性反應，10份對照正常兔血清和30份人抗HSVI抗體陰性血清與表達抗原均產(chǎn)生陰性反應。結(jié)果提示重組目的基因獲得表達，HSVIgG與全病毒蛋白質(zhì)有明顯的交叉反應性，并具有很強的特異性，具有實際應用意義。實施例二、重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體膠體金檢測試劑盒的制備和性能檢定1.重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體膠體金檢測試劑盒的制備將以上制得的HSVIgG用作試劑盒標記抗原，用膠體金法測定HSVIIgM抗體。(1)試劑盒原理本發(fā)明根據(jù)免疫捕獲法原理，用抗人IgM抗體包被硝酸纖維素膜，膠體金標記基因工程重組單純皰疹病毒I型(HSVI)抗原為示蹤物。使用時加入待檢血清，如樣品中含有抗HSV1特異性IgM抗體，則可與膜表面的抗人IgM抗體結(jié)合形成復合物，該復合物與膠體金標記的HSVI抗原結(jié)合而呈現(xiàn)紫紅色條帶。(2)試劑盒性能優(yōu)化以陽性和陰性質(zhì)控品(收集多家醫(yī)院經(jīng)臨床驗證的抗人單純皰疹病毒I型IgM抗體陽性、陰性血清，用意大利SORIN公司提供的抗單純皰疹病毒I型IgM抗體酶聯(lián)試劑盒進行復檢篩選，得到的抗單純皰疹病毒I型IgM陽性、陰性血清建立為企業(yè)內(nèi)部陽性和陰性質(zhì)控品)為測試樣品，采用方陣滴定確定最佳抗人IgM和HSVIgG抗原膠體金(HSVl-Ag.G)結(jié)合物的工作濃度，結(jié)果如表2，由結(jié)果得出，抗人IgM(抗人鏈)抗體劃線包被濃度為2.0mg/ml、HSVI-HSVIgG復合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊。表2最佳抗人IgM和HSVIgG_Ag.G結(jié)合物工作濃度的選擇HSVIgG-Ag.G復合物抗人IgM濃度(mg/ml)抗HSVI-IgM陰性.;/::HSVI-IgM弱陽性抗HSV-IIgM陽性濃縮原液1.0—±+2.0一+++3.0+++4.0±+++1/2稀釋1.0—++2.0一+++3.0一+++4.0—+++1/4稀釋1,0一2.0—3.0++7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>-:陰性反應(無檢測線)；±:可疑陽性(檢測線隱約可見)；+:陽性反應(出現(xiàn)檢測線)；++:較強陽性反應(檢測線清晰)；+++強陽性反應(檢測線顏色深)(以下解釋同)在已確定抗人IgM抗體劃線包被濃度為2.0mg/ml、HSVIgG_Ag.G復合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊的基礎(chǔ)上，以內(nèi)部質(zhì)控陽性和陰性質(zhì)控品(來源和標準同上)為測試樣品，滴定選擇最佳抗人IgM抗體劃線量(噴金量為20iil/cm)為1.OiU/cm。結(jié)果見表3。表3最佳抗人IgM抗體劃線量的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>_:陰性反應；±:可疑陽性；+:陽性反應；++:較強陽性反應；+++強陽性反應在已確定抗人IgM抗體劃線濃度為2.Omg/ml，劃線量為1.OiU/cm和HSVIgG抗原膠體金復合物噴點濃度為濃縮原液到稀釋一倍之間的基礎(chǔ)上，以內(nèi)部質(zhì)控陽性和陰性質(zhì)控品(來源和標準同上)為測試樣品，采用方陣滴定選擇最佳膠體金結(jié)合物噴金量為25.OiU/cm。結(jié)果見表4。表4最佳HSVIgG抗原膠體金復合物噴金量的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>_:陰性反應；±:可疑陽性；+:陽性反應；++:較強陽性反應；+++強陽性反應在已確定抗原膠體金復合物包被量的基礎(chǔ)上來選擇質(zhì)控線兔抗單純皰疹病毒HSVIgG型抗體的包被濃度。兔抗單純皰疹病毒HSVIgG型抗體包被量為1.0iil/cm，包被濃度為5.0mg/ml。結(jié)果見表5。表5質(zhì)控線兔抗單純皰疹病毒I型抗體包被濃度的選擇<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>±:質(zhì)控線隱約可見；+:出現(xiàn)質(zhì)控線；++:質(zhì)控線清晰；+++:質(zhì)控線清晰粗大抗人ii鏈劃線包被后，分別用下述緩沖系統(tǒng)進行封閉，比較封閉效果，結(jié)果表明含PEG，。。的封閉系統(tǒng)封閉后靈敏度和特異性都有所下降，其他封閉和不封閉的結(jié)果沒有區(qū)別，所以選擇不封閉硝酸纖維素膜。結(jié)果見表6。表6不同封閉系統(tǒng)的反應板比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>_:陰性反應；±:可疑陽性；+:陽性反應；++:較強陽性反應；+++強陽性反應(3)試劑盒的制備1)取1.0g的HAuCl4.H20溶解于100ml純化水中，配成1%氯金酸溶液；取1ml的1%氯金酸溶液入100ml沸水中，加入2ml、l%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸30min，合成膠體金；2)取6ml合成的膠體金溶液，在400-700nm處進行掃描檢驗；取合成的約30nm膠體金406ml，用0.1MK2C03調(diào)PH至7，量取5mg/mlHSVIgG抗原2.65ml，用PH8.2的20mMTris-Cl稀釋至40ml，邊攪拌邊加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌lOmin，量取1%BSA40ml，邊攪拌邊加入前述溶液，繼續(xù)攪拌10min，3000r/min4"C離心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min4t:離心45min，去上清，重復2次；用內(nèi)部質(zhì)控血清對膠體金復合物進行檢驗，檢驗合格后，按前述確定的濃度、噴金量包被HSVIgG抗原膠體金復合物，然后在37t:、相對濕30%以下通風干燥16-22小時(過夜)后切割。3)預切割NC膜，粘貼背板，按前面確定的濃度和劃線量包被鼠抗人IgM(抗人ii鏈)抗體和兔抗單純皰疹病毒I型抗體劃線包被于NC膜上，在37°C、相對濕度30%以下的條件下干燥1.0小時。4)撕掉包被檢測線和質(zhì)控線的NC膜(帶背板)檢測線端的紙膜，將抗原膠體金結(jié)合物墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，交叉約lmm，壓實，將裁好的載樣墊粘貼在抗原膠體金結(jié)合物墊的下端，壓實，將裁好的吸水墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，將貼好的檢測板兩端裁切去掉lcm，用切條機切成4mm寬。抽取18條，用內(nèi)部質(zhì)控血清檢測半成品檢測卡。5)將每個檢測卡單獨封裝，每個獨立包裝為1人份，20人份封裝成1盒。抽樣檢驗。各緩沖液配方如下1)抗人IgM抗體包被緩沖液配方20mMTris-Cl緩沖液(pH8.2)見表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2)兔抗單純皰疹病毒I型抗體包被緩沖液配方20mMTris-Cl緩沖液(pH8.2)見表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3)抗原膠體金復合物包被緩沖液配方20mMTBS緩沖液(pH8.2)見表9C表9<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(4)試劑盒使用操作方法1)打開檢測卡的鋁箔袋包裝，取出檢測卡。2)將檢測卡傾斜成加樣孔端低于另一端不少于1.Ocm。3)取lOOiU待檢血清加入到圓形樣品孔中，室溫(15t>察并記錄結(jié)果。4)檢驗結(jié)果判定陽性判讀窗口出現(xiàn)兩條紫紅色線條帶(檢測線和質(zhì)控線位置)；陰性判讀窗口僅出現(xiàn)一條紫紅色線條帶(檢測線和質(zhì)控線位置)。無效判讀窗口質(zhì)控線位置無紫紅色線條帶。2.試劑盒性能檢測實驗(1)特異性(準確性)測定按前述實驗確定的膠體金捕獲測定方法，檢測幾種其他血清物質(zhì)，觀察反應特異性。結(jié)果顯示，使用本發(fā)明試劑盒檢測15份陰性血清(臨床已確定)，符合率為100%;檢測50份類風濕因子陽性血清標本、50份丙型肝炎陽性血清標本、50份梅毒陽性血清標本等，無一陽性，表明類風濕因子等基本不會造成試劑盒的假陽性，特異性很好。(2)靈敏度(特異性)測定按前述實驗確定的膠體金捕獲測定方法，檢測本試劑盒的靈敏性。使用本發(fā)明試劑盒檢測15份陽性血清(臨床已確定)，符合率為100%。(3)與國內(nèi)外同類產(chǎn)品的比較試驗本發(fā)明試劑盒與意大利SORIN公司試劑盒檢測260份血清樣本的比較實驗結(jié)果如表10。表10與意大利S0RIN抗皰疹病毒I型IgM抗體試劑盒的比較測試結(jié)果重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體膠體金檢測試劑盒意大利SORIN酶S關(guān)試劑盒檢測結(jié)果合計陽性陰性陽性49150陰性420620合計53207260檢測總符合率(49+206)/260=98.1%，初步表明本試劑盒達到進口試劑盒的標準。實施例三重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體酶聯(lián)檢測試劑盒的性能檢定將實施例一制得的HSVIgG蛋白用作試劑盒酶標抗原制備的底物，用ELISA法測定HSVlIgM抗體。1該試劑盒原理和組分如下1)試劑盒原理本品系用抗人IgM包被的微孔板，辣根過氧化物酶(HRP)標記基因工程HSVIgG抗原為示蹤物，TMB顯色系統(tǒng)，應用捕獲法原理檢測人血清或血槳中的抗單純皰疹病毒IgM抗體。2)試劑盒主要組成成分預包被板、酶結(jié)合物、陰性對照、陽性對照、濃縮洗液(20X)、底物液A、底物液B、中止液。2試劑盒性能檢定特異性(準確性)測定按捕獲ELISA測定方法，檢測幾種其他血清物質(zhì)，觀察反應特異性。結(jié)果顯示，使用本發(fā)明試劑盒檢測15份陰性血清(臨床已確定)，符合率為100%;檢測50份類風濕因子陽性血清標本、50份丙型肝炎陽性血清標本、50份梅毒陽性血清標本等，無一陽性，表明類風濕因子等基本不會造成試劑盒的假陽性，特異性很好。靈敏度(特異性)測定按捕獲ELISA測定方法，檢測本試劑盒的靈敏性。使用本發(fā)明試劑盒檢測15份陽性血清(臨床已確定)，符合率為100%。精密性測定按捕獲ELISA測定方法，檢測本試劑盒的精密性。使用本試劑盒對2份抗HSV1強陽性血清、1份陽性血清、1份陰性血清以及試劑盒的陽性對照、陰性對照進行每板雙孔，共10板的檢測，結(jié)果如表11，可見試劑盒的重復性良好，對不同血清檢測的CV均低于15%。表ll試劑盒的精密性血清平均0D最大0D最小0Dcv(%)強陽性13.8234.1283.0912.613<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>caacateccccgctgttctcgttcctcactgcctcccccgccctggacaccctcttcgtcgtcagcaccgtcatccacaccttetcgtttttgtgtettggtgcgatggcgacacacctgtgtggcggttggtccagacgcgggcgacgcacacaccctegcgtgcgttecgtgtgcctgccgtccgaacgcggg〈210>2〈211>205〈212>PRT〈213>單純皰疹病毒I(Herpessimplexvirus,HSV)〈400>2LeuGinThrThrGlyArgProSerHisGluAlaPro■540600615GinProGin1AsnMetThrGinLeuThrThrProGluGluGluGluGluGlyGlyAspProAlaPheProArgProValValProGluThrSerLeuAlaThrArgLeuValProThrAlaSerProAlaHisThrLeuSerCysGlyGlyTrpArgTyrValCys5Thr20Asp35Glu50Gly65Leu80Pro95Arg110Pro125Pro140Leu155Phe170Ser185Leu200GlyHisGluThrAlaSerProThrGinAspLeuArgProThrThrThrProGluGlyArgAspGluAspProAspLysThrThrArgHisThrThrLeuCyslieArgGlySerGluAspPrpAlaThrValProProLeuProPheGleArgArg10Ser25Met40Gly55Leu70Glu85Asn100Pro115Thr130Leu145Val160Ala175Arg190Gly205ProProAspProLysThrAlaSerlieGlyGluGinSerAspLysAsnSerProThrSerPheValMetlielieLysGlySerPheSerThrAlaThrlieGlyHisProProAlaGlyArgLeuValHisThrHisProSer15Ser30Leu45Leu60Gly75Asp90Arg105Thr120Pro135Thr150lie165Leu180Val1951權(quán)利要求一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG的基因片段，其特征在于它的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.—種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，其特征在于它的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，是由下述方法制備的a、人工合成引物P1:ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCGP2:ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGGb、以人單純皰疹病毒培養(yǎng)物為模板，PCR擴增，獲得基因片段HSVIgG;c、將基因片段HSVIgG插入表達載體pET-28a中，獲質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG;d、質(zhì)粒pET-28a-HSVIgG轉(zhuǎn)染埃希氏大腸桿菌BL21(DE3)中；f、細菌破碎，蛋白純化，得重組蛋白HSVIgG。4.一種重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體檢測試劑盒，其特征在于是以HSVIgG為抗原，標記物為膠體金的IgM抗體膠體金檢測試劑盒或標記物為辣根過氧化物酶的IgM抗體酶聯(lián)檢測試劑盒。5.—種重組人單純皰疹病毒I蛋白IgM抗體膠體金檢測試劑盒，是由以下方法制備的1)取l.Og的HAuCl4.H20溶解于100ml純化水中，配成1%氯金酸溶液；取1%氯金酸溶液1ml加入100ml沸水中，加入1%檸檬酸三鈉2ml，繼續(xù)煮沸30min，合成膠體金；2)取6ml合成的膠體金溶液，在400-700nm處進行掃描檢驗；取合成的約30nm膠體金406ml，用0.1MK2C03調(diào)PH至7，量取5mg/mlHSVIgG2.65ml用PH8.2的20mMTris-Cl稀釋至40ml，邊攪拌邊加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌lOmin，量取1%BSA40ml，邊攪拌邊加入，繼續(xù)攪拌10min，3000r/min4。C離心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min4°C離心45min，去上清，重復2次；用質(zhì)控血清對膠體金復合物進行檢驗，檢驗合格后，HSVIgG膠體金復合物在原液至稀釋一倍之間、噴金量為25.OiU/cm包被載金墊，然后在37t:、相對濕度30%以下通風干燥16-22小時后切割；3)預切割NC膜，粘貼背板，濃度2.Omg/ml、劃線量為1.0y1/cm包被抗人IgM抗體和按包被濃度為5.Omg/ml、包被量為1.0ii1/cm兔抗單純皰疹病毒I型抗體劃線包被于NC膜上，在37"、相對濕度30%以下的條件下干燥1.0小時；4)撕掉包被檢測線和質(zhì)控線的帶背板NC膜檢測線端的紙膜，將HSVIgG膠體金結(jié)合物墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，交叉約lmm，壓實，將裁好的載樣墊粘貼在HSVIgG膠體金結(jié)合物墊的下端，壓實，將裁好的吸水墊粘貼在NC膜的質(zhì)控線端，將貼好的檢測板兩端裁切去掉lcm，用切條機切成4mm寬，封裝。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG在制備人單純皰疹病毒I疫苗的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG及其應用，本發(fā)明通過計算機分析人單純皰疹病毒I的全部氨基酸序列，篩選出了人單純皰疹病毒I的型特異性蛋白gG的優(yōu)勢抗原表位，采用基因工程方法生產(chǎn)的重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG，簡稱HSVIgG，能夠避免由于蛋白質(zhì)抗原純度低或特異性差造成假陽性而降低檢測特異性等問題，為人單純皰疹病毒感染的檢測提供更為特異、準確的原料，利用本發(fā)明一種重組人單純皰疹病毒I蛋白HSVIgG為抗原，制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，很好地滿足了人皰疹病毒感染臨床診斷的需要，作為疫苗接種，可以預防病毒感染。文檔編號C12N15/70GK101705233SQ20091021788公開日2010年5月12日申請日期2009年11月20日優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日發(fā)明者于庭,于艷輝,劉秀敏,包洪,常靜,滕春燕,肖霞,高藝航申請人:吉林大學