專利名稱：：飼料中牛羊源成分檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種飼料中牛羊源成份檢測(cè)方法，同時(shí)還提供了相應(yīng)的試劑盒，屬于牲畜飼料成分檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：羊搔癢病和瘋牛病致病因子相同，均由朊蛋白(Prion)引起。流行病學(xué)調(diào)查證明，用患有瘋牛病和羊搔癢病的牛、羊等動(dòng)物的肉和骨頭制成的肉骨粉喂養(yǎng)動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致瘋牛病和羊搔癢病的傳播，是引起牛腦海綿狀病(BSE)發(fā)生的最初的原因。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于飼料中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法的報(bào)道主要有顯微鏡檢、紅外光譜、普通PCR、ELISA等，但這些方法存在檢測(cè)量小、易產(chǎn)生假陽(yáng)性、要求檢驗(yàn)人員有豐富的操作經(jīng)驗(yàn)等缺點(diǎn)，因此迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的方法，熒光定量PCR法正是一種可以滿足這些要求的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種飼料中牛羊源成分檢測(cè)的試劑盒，用于牲畜飼料中牛羊源成分檢測(cè)。本發(fā)明還提供了上述試劑盒的制備方法，建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確率高的適用于飼料中牛羊源成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。本發(fā)明飼料中牛羊源成分檢測(cè)試劑盒，具體構(gòu)成如下1、牛PCR反應(yīng)液750ii12、羊PCR反應(yīng)液750iil3、通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液750ii14、陽(yáng)性對(duì)照110iil5、陰性對(duì)照110iil本試劑盒適用于ABI、Bio-Rad、SLAN等基于Taqman技術(shù)原理設(shè)計(jì)的熒光PCR檢測(cè)儀。本發(fā)明試劑盒的制備方法，包括以下步驟1牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液通過(guò)NCBI檢索牛、羊(綿羊和山羊)、豬、馬、狗、魚、雞、鴨、鵝等動(dòng)物以及小麥、大豆、玉米、高粱、向日葵等植物的線粒體DNA序列，經(jīng)過(guò)DNAMAN生物軟件進(jìn)行同源性分析。依據(jù)同源性分析結(jié)果，最終選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內(nèi)保守，種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測(cè)的靶序列；選擇牛羊線粒體16SrRNA上高度同源保守區(qū)域作為牛羊通用檢測(cè)的耙序列。3個(gè)耙序列長(zhǎng)度分別是90bp、106bp和90bp，序列如下(1)牛特異mtl2SrRNA:GTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATA(2)羊特異mtl2SrRNA:CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAGACTTATACATGCAAGCATCCACGCCCCGGTGAGTAACGCCCTTCGAATCACACAGGACTAAAAGGAGCAGGTATCAAGCAC(3)牛羊通用mtl6SrRNA:GATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGAT依據(jù)耙序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物和探針。探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)，引物和探針序列如下牛BRTF5'-GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3'BRTR5'-TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3'ProbeB5'_CATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG-3，-羊ORTF5，-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3，ORTR5'-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3'ProbeO5'-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3'通用檢測(cè)16SRTF5'-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3，16SRTR5'-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3，Probe165'-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3'PCR反應(yīng)液經(jīng)條件優(yōu)化后組成為0.06U/ulExTaq、3mMdNTPMixture、1XExTaqbuffer、0.3mMForwardPrimer、0.3mMReversePrimer、0.2mMProbe，2陽(yáng)性對(duì)照由于熒光定量引物擴(kuò)增序列很短，只有100bp左右，不方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此設(shè)計(jì)能將這些短片段包括在內(nèi)的較長(zhǎng)片段的3對(duì)重疊引物，進(jìn)一步將這些片段拼接在一起，然后與載體連接。對(duì)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定，濃度為1.OX1013COpieS/ml，IO倍系列稀釋。以濃度為109、108、107、106、105、104COpieS/ml的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。重疊引物序列如下牛12SrRNAB0WF15'-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3'B0WF25'-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3'羊12SrRNAB0WF25'-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3'B0WR25'-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3'通用檢測(cè)16SrRNA16SF5'-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3'16SR5'-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3'3陰性對(duì)照用經(jīng)高壓滅菌的雙重蒸餾水做為陰性對(duì)照。本發(fā)明的使用方法包括以下步驟1.提取飼料DNA2.根據(jù)檢測(cè)目的，取相應(yīng)檢測(cè)PCR反應(yīng)液23ii1、飼料DNA2(25ii1體系)混于一反應(yīng)管中混勻；反應(yīng)管可在2『C放置3小時(shí)。同種方法準(zhǔn)備陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管。3.將反應(yīng)管離心數(shù)秒，取出置全自動(dòng)熒光PCR儀上。4.先95°CIOS，然后再按95°C5秒一60°C40秒，循環(huán)40次。5.質(zhì)量控制如試劑質(zhì)量完好且操作正確，相應(yīng)的結(jié)果應(yīng)當(dāng)滿足下表?xiàng)l件。對(duì)照品質(zhì)控耍求Pll性對(duì)照結(jié)果Ct《35判斷為陽(yáng)性陰性對(duì)照結(jié)果Ct〉35判斷為陰性檢測(cè)結(jié)果應(yīng)達(dá)到上表要求的標(biāo)準(zhǔn)，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，應(yīng)檢查儀器、試劑、擴(kuò)增條件等方面的誤差。每次檢測(cè)中應(yīng)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照品。以下實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的有效性與可行性實(shí)驗(yàn)例1牛/羊/通用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別用牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，得到牛特異擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1和2)、羊特異擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3和4)以及牛羊通用擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5和6)。3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.998和0.998，都大于0.99。實(shí)驗(yàn)例2牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)使用牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液，分別對(duì)采集到的包括牛、山羊、綿羊、鹿、馬、驢、豬、貓、狗、兔、魚、雞、鴨、鵝、鴿子共15種不同動(dòng)物和小麥、玉米、大豆、高粱、向日葵、花生共6種不同植物來(lái)源的DNA進(jìn)行檢測(cè)，按照相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)，記錄擴(kuò)增情況。結(jié)果只有模板為?；蚪M的反應(yīng)管有良好的擴(kuò)增曲線，其他物種均擴(kuò)增失敗，說(shuō)明特異檢測(cè)牛源成分的實(shí)時(shí)定量引物和探針特異性好。擴(kuò)增結(jié)果如圖7同種方法驗(yàn)證羊源成分檢測(cè)實(shí)時(shí)定量引物和探針以及牛羊源成分同時(shí)檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量引物和探針的特異性。結(jié)果表明特異性強(qiáng)。結(jié)果如圖7、8和9實(shí)驗(yàn)例3牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)靈敏性實(shí)驗(yàn)購(gòu)買牛羊肉骨，然后按照肉骨粉加工工藝進(jìn)行處理分別將各種動(dòng)物肉質(zhì)切成薄片，133t:，3bar，20min。烘干后，用研缽研磨成干粉，過(guò)80目篩，4t:封口保存?zhèn)溆?。將牛肉骨粉與玉米粉按不同比例混合，得到牛肉骨粉含量為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的6份模擬飼料，每份質(zhì)量為100克。同種方法制備6份含羊肉骨粉的模擬飼料和6份含牛羊兩種肉骨粉的模擬飼料(兩種肉骨粉等量混合)。將制備的18個(gè)飼料樣品，再選取4個(gè)陰性樣品(純玉米粉)，共22份隨機(jī)編號(hào)，在不告知檢測(cè)人樣品中牛骨粉、羊骨粉含量的情況下，用本實(shí)驗(yàn)建立方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄檢測(cè)結(jié)果(Ct值大于35為陰性)。結(jié)果顯示，肉骨粉含量X).1%時(shí)檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際相符。說(shuō)明本方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)O.1%。檢測(cè)結(jié)果見表l表1模擬飼料檢測(cè)結(jié)果7編號(hào)實(shí)際含量牛探針檢測(cè)結(jié)果羊探針牛羊通用探針15%牛+5%羊+++210%牛++30.025%牛+0.025%羊4010%羊++62.5%牛+2.5%羊+++70.05%牛+80.1%羊++91%牛++100.5%牛+0.5%羊+++110.5%牛++125%牛++130.05%羊+140150.25%牛+0.25%羊十++160171%羊++180190.05%牛+0.05%羊+200.5%羊++215%羊++220.1%牛+—+實(shí)驗(yàn)例4牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)以濃度為10\l08、107cOpieS/mL的3個(gè)重組質(zhì)粒為模板，以牛引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，每個(gè)濃度重復(fù)3次，記錄Ct值，2周后，再進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，記錄Ct值，分析兩次實(shí)驗(yàn)的Ct值。將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量方法的可重復(fù)性。同種方法進(jìn)行羊重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和牛羊通用重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5X，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)羊源成分具8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>l三組熒光定量引物和探針設(shè)計(jì)成功，得到理想的擴(kuò)增曲線，成功建立了相關(guān)系數(shù)均大于0.99的牛羊特異檢測(cè)和通用檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2建立了特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好的牛羊源成分實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)牛羊基因組的檢測(cè)靈敏度分別為0.08ng和0.06ng，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中變異系數(shù)CV均低于5%;3成功設(shè)計(jì)了動(dòng)植物18SrRNA內(nèi)源保守引物和探針，可以檢測(cè)反應(yīng)體系是否存在抑制性因素，避免假陰性結(jié)果；4對(duì)深加工飼料DNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，可以更好的提取出飼料DNA;5牛羊肉骨按照歐盟標(biāo)準(zhǔn)(133t:，3bar，20min)處理后配成不同濃度的模擬飼料，使用本研究建立檢測(cè)方法進(jìn)行盲檢，結(jié)果顯示本方法對(duì)牛源和羊源成分的檢測(cè)靈敏度都可以達(dá)到0.1%，符合國(guó)際檢測(cè)要求的標(biāo)準(zhǔn)；本發(fā)明的積極效果在于建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確率高，適用于飼料中牛羊源成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。圖1為牛特異擴(kuò)增曲線圖；圖2為牛特標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為羊特異擴(kuò)增曲線圖；圖4為羊特標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為牛羊通用擴(kuò)增曲線圖；圖6為牛羊標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖7為牛引物和探針特異性曲線圖；圖8為羊引物和探針特異性曲線圖；圖9為通用引物和探針的特異性曲線具體實(shí)施方式實(shí)施例1飼料中牛羊源成分檢測(cè)試劑盒，具體構(gòu)成如下1)牛PCR反應(yīng)液750iil;2)羊PCR反應(yīng)液750ill;3)通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液750iU;4)陽(yáng)性對(duì)照l(shuí)lOiU;5)陰性對(duì)照110iU。實(shí)施例2試劑盒的制備方法，包括以下步驟1牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液通過(guò)NCBI檢索牛、羊(綿羊和山羊)、豬、馬、狗、魚、雞、鴨、鵝等動(dòng)物以及小麥、大豆、玉米、高粱、向日葵等植物的線粒體DNA序列，經(jīng)過(guò)DNAMAN生物軟件進(jìn)行同源性分析。依據(jù)同源性分析結(jié)果，最終選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內(nèi)保守，種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測(cè)的靶序列；選擇牛羊線粒體16SrRNA上高度同源保守區(qū)域作為牛羊通用檢測(cè)的耙序列。3個(gè)耙序列長(zhǎng)度分別是90bp、106bp和90bp，序列如下(4)牛特異mtl2SrRNA:GTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATA(5)羊特異mtl2SrRNA:CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAGACTTATACATGCAAGCATCCACGCCCCGGTGAGTAACGCCCTTCGAATCACACAGGACTAAAAGGAGCAGGTATCAAGCAC(6)牛羊通用mtl6SrRNA:GATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGAT依據(jù)靶序列，用Primer3軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物和探針。探針5'端標(biāo)記FAM熒光端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)，引物和探針序列如下牛GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3'TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3'CATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG-3'-0118]0119]0120]0121]0122]0123]0124]0125]0126]0127]0128]基團(tuán)，30129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]0142]服TF5'服TR5，ProbeB5，羊ORTF5，ORTR5，ProbeO5，通用檢測(cè)16SRTF16SRTRProbe16-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3'-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3'-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3'5'-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3，5'-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3'5'-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3'PCR反應(yīng)液經(jīng)條件優(yōu)化后組成為0.06U/ulExTaq、3mMdNTPMixture、1XExTaqbuffer、0.3mMForwardPrimer、0.3mMReversePrimer、0.2mMProbe，0143]2陽(yáng)性對(duì)照0144]由于熒光定量引物擴(kuò)增序列很短，只有100bp左右，不方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此設(shè)計(jì)能將這些短片段包括在內(nèi)的較長(zhǎng)片段的3對(duì)重疊引物，重疊引物序列如下0145]牛12SrRNA0146]B0WF15'-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3'0147]B0WF25'-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3'0148]羊12SrRNA0149]B0WF25'-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3'0150]B0WR25'-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3'0巧1]通用檢測(cè)1116SrRNA16SF5'-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3'16SR5'-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3，牛12SrRNA、羊12SrRNA和通用16SrRNA的PCR擴(kuò)增體系均為50ul，0.1U/ulExtaq、5ul10XExTaqbuffer、4uldNTP、lul引物Fl/F2、lul模板，反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min、94。C變性30sec、6rC退火30sec、72。C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸lOmin.。擴(kuò)增后膠回收PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行2次拼接PCR即可將牛12SrRNA、羊12SrRNA和牛羊通用16SrRNA3條片段連接在一起。第一次拼接PCR將牛12SrRNA和羊12SrRNA拼接在一起，此片段命名為A，反應(yīng)體系為50ul，0.1U/ulExtaq、5ul10XExTaqbuffer、4uldNTP、lul引物B0WF1/F2、lul牛12SrRNA、lul羊12SrRNA，反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min，94。C變性30sec，61。C退火30sec，72t:延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10min，第二次拼接PCR實(shí)驗(yàn)重疊引物B0WF1和16SR將上一步得到的片段A和牛羊通用mtl6SrRNA拼接在一起，得到最終的全長(zhǎng)DNA。反應(yīng)體系為50ul，0.1U/ulExtaq、5ul10XExTaqbuffer、4uldNTP、lul引物B0WF1/F2、lull6SrRNA、lul片段A，反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min，94。C變性30sec，59。C退火30sec，72t:延伸2min，30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，膠回收PCR產(chǎn)物，將其連接到pGEM-TEasy載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定后，測(cè)定濃度為1.0X1013copies/ml，10倍系列稀釋。以濃度為109、108、107、106、105、104copies/ml的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。3陰性對(duì)照用經(jīng)高壓滅菌的雙重蒸餾水做為陰性對(duì)照。序列表〈110〉吉林大學(xué)〈120〉飼料中牛羊源成分檢測(cè)方法及試劑盒方法及試劑盒〈130〉飼料中牛羊源成分檢測(cè)〈160>1〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>90〈212>DNA〈213〉Bovine〈220〉〈221〉牛檢測(cè)上游引物BRTF序列〈222〉(1)(23)〈220〉〈221〉牛檢測(cè)探針ProbeB序列〈222>(26).(59)〈220〉〈221〉牛檢測(cè)下游引物BRTR序列反向互補(bǔ)序列〈222>(65).(90)〈400>1gtcaccctcctcaaatagattcagtgcatctaaccctatttaaacgcactagctacatga60g3gg3gac朋gtcgt朋c朋ggteagcate90〈210>1〈211>106〈212>DNA〈213>0vissp.〈220〉〈221〉羊檢測(cè)上游引物ORTF序列〈222〉(1)(25)〈220〉〈221〉羊檢測(cè)探針Probe0序列〈222>(38)..(60)〈220〉〈221〉羊檢測(cè)下游引物BRTO序列反向互補(bǔ)序列〈222>(82)..(106)〈400>1cagccttcctgttaactttcaatagacttatacatgcaagcatccacgccccggtgagta60acgcccttcg朋tcac3C3ggacte朋3gg3gcaggtetc朋gcac106〈210>1〈211>90〈212>DNA〈213>Bovineand0vissp〈220〉〈221〉通用檢測(cè)上游引物16SRTF序列〈222〉(1)(22)〈220〉〈221〉通用檢測(cè)探針Probel6序列〈222>(33)..(62)〈220〉〈221〉通用檢測(cè)下游引物16SRTR反向互補(bǔ)序列〈222>(68)..(90)〈400>1gatc朋cgg33c朋gtteccctegggateacagcgc朋tcctettc肌gagtccatetcg60acaatagggtttacgacctcgatgttggat90權(quán)利要求一種飼料中牛羊源成分檢測(cè)試劑盒，具體構(gòu)成如下1)牛PCR反應(yīng)液750μl；2)羊PCR反應(yīng)液750μl；3)通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液750μl；4)陽(yáng)性對(duì)照110μl；5)陰性對(duì)照110μl。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)牛/羊/通用檢測(cè)PCR反應(yīng)液通過(guò)NCBI檢索牛、羊、豬、馬、狗、魚、雞、鴨、鵝等動(dòng)物以及小麥、大豆、玉米、高粱、向日葵等植物的線粒體DNA序列，經(jīng)過(guò)DNAMAN生物軟件進(jìn)行同源性分析；依據(jù)同源性分析結(jié)果，選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內(nèi)保守，種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測(cè)的靶序列；選擇牛羊線粒體16SrRNA上高度同源保守區(qū)域作為牛羊通用檢測(cè)的靶序列；3個(gè)耙序列長(zhǎng)度分別是90bp、106bp和90bp，序列如下牛特異mtl2SrRNA:GTAACAAGGTAAGCATA羊特異mtl2SrRNACACACAGGACTAAAAGGAGCAGGTATCAAGCAC牛羊通用mtl6SrRNA:CGACCTCGATGTTGGAT依據(jù)靶序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物和探針；探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)，引物和探針序列如下牛BRTF5'-GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3'服TR5，-TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3，ProbeB5'-CATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG_3，-羊ORTF5'-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3'ORTR5，-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3，ProbeO5'-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3'通用檢測(cè)16SRTF5'-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3，16SRTR5'-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3'Probe165'-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3'PCR反應(yīng)液經(jīng)條件優(yōu)化后組成為0.06U/ulExTaq、3mMd證Mixture、1XExTaqbuffer、0.3mMForwardPrimer、0.3mMReversePrimer、0.2mMProbe;2)陽(yáng)性對(duì)照以濃度為109、108、107、106、105、104copies/ml的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品;重疊引物序列如下牛12SrRNAB0WF15'-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3'B0WF25'-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3'羊12SrRNABOWF25'-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3'BOWR25'-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3'通用檢測(cè)16SrRNA16SF5'-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3'16SR5'-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3，3)陰性對(duì)照用經(jīng)高壓滅菌的雙重蒸餾水做為陰性對(duì)照。全文摘要本發(fā)明提供一種飼料中牛羊源成分檢測(cè)試劑盒，同時(shí)還提供了相應(yīng)的試劑盒，用于牲畜飼料中牛羊源成分檢測(cè)。本發(fā)明建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確率高，適用于飼料中牛羊源成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101775436SQ20091021808公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2009年12月23日優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日發(fā)明者任林柱,張明軍,張英,李小平,李莉,歐陽(yáng)紅生,王鐵東,逄大欣,鄭文文,高飛申請(qǐng)人:吉林大學(xué)