專利名稱：：奶山羊ghrhr基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以奶山羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：羊奶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不含過敏原，營(yíng)養(yǎng)成分均衡，易消化吸收，與人乳蛋白質(zhì)組成相似；羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的三分之一，羊奶中的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)，尤其是鈣、磷、維生素及微量元素的含量比牛奶略高，且更利于人體吸收，在國(guó)際營(yíng)養(yǎng)界被譽(yù)為"奶中之王"。羊奶由于有膻與味喝牛奶相比，羊奶的人較少。隨著高科技應(yīng)用于生物制藥、食品加工，脫膻技術(shù)的應(yīng)用給羊奶界蓬勃發(fā)展帶來可能。雖然奶山羊是我國(guó)主要的奶畜之一，但是我國(guó)羊奶的生產(chǎn)同發(fā)達(dá)國(guó)家相比差距巨大，主要是因?yàn)槲覈?guó)優(yōu)秀奶山羊品種種源不足和種群遺傳品質(zhì)較差。傳統(tǒng)的育種方法應(yīng)用測(cè)試動(dòng)物的表現(xiàn)型和其親代、祖代及其它親屬在小的動(dòng)物模型中的遺傳信息，設(shè)想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個(gè)基因?qū)π誀钣邢鄬?duì)較小的貢獻(xiàn)，因此對(duì)性狀的估計(jì)不可避免有些偏差。分子遺傳標(biāo)記是近年來現(xiàn)代遺傳學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，新的方法正在不斷涌現(xiàn)，已定位的標(biāo)記基因數(shù)目與日倶增。這將為數(shù)量遺傳學(xué)提供分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)的先進(jìn)的有效的方法。分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對(duì)遺傳標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，使之能夠同時(shí)利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個(gè)階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標(biāo)記對(duì)數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個(gè)階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個(gè)基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時(shí)才被稱為單核苷酸多態(tài)性。目前，主要采用幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs:DNA序列測(cè)定方法、PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(MolecularBeacons)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，(l)DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；(2)PCR-SSCP3與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；(3)AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；(4)TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(MolecularBeacons)都是在熒光能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResornanceEnergTransfer，F(xiàn)RET)基礎(chǔ)上建立起來的，利用熒光標(biāo)記及儀器達(dá)到檢測(cè)目的。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)則是利用測(cè)序過程中可釋放的焦磷酸和酶類產(chǎn)生熒光，是不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳、不依賴DNA的熒光標(biāo)記技術(shù)，很可能成為未來的主流技術(shù)。(5)RFLP-PCR方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后引入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無特殊性要求。生長(zhǎng)激素釋放激素受體(Growthhormone-releasinghormonerec印tor，GHRHR)是一種膜聯(lián)合受體，與G蛋白偶聯(lián)激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，從而誘發(fā)蛋白激酶A通路的活性，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)激素的分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳等性狀。在動(dòng)物的下丘腦、腎臟、胎盤都發(fā)現(xiàn)有GHRHR基因的表達(dá)，GHRHR在正常的生長(zhǎng)調(diào)控中起著關(guān)鍵性的作用，但它不能單獨(dú)發(fā)揮作用，一方面GHRHR通過與GHRH結(jié)合調(diào)控生長(zhǎng)激素(GH)的分泌和合成，另一方面它作為一個(gè)發(fā)育因子在垂體促生長(zhǎng)細(xì)胞增殖中起著特異作用。目前，對(duì)于GHRHR基因的研究多在人類、小鼠及牛上，主要在前腦發(fā)育、動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中做出了大量的研究。關(guān)于動(dòng)物GHRHR基因遺傳變異的研究國(guó)內(nèi)外多見于小鼠、牛等動(dòng)物，未見奶山羊GHRHR基因遺傳變異與性狀關(guān)聯(lián)研究的報(bào)道。目前有關(guān)該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如不同泌乳期產(chǎn)奶量)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題在于提供奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法，利用DNA池測(cè)序的方法篩查奶山羊GHRHR基因的目的DNA序列的多態(tài)性，尋找與奶山羊泌乳性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，加快奶山羊良種繁育速度。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)—種奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在如SEQIDNO.1所示的奶山羊的GHRHR基因序列表的第231位為C或G的堿基多態(tài)性；上述奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法為以包含GHRHR基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊GHRHR基因；用限制性內(nèi)切酶MspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定SEQIDNO.l所示的奶山羊GHRH基因序列表的第231位堿基多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為上坊,弓l物PI:acgccaccctctttcaccc19;4下游弓l物P2:catcctgggtgcttcttgaag21。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4"C預(yù)變性5min;94。C變性30s，57。C退火35s，72。C延伸50s，35個(gè)循環(huán);72。C延伸10min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊GHRH基因序列表的第231位堿基多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為291bp和134bp條帶；CG基因型表現(xiàn)為21bp、195bp、134bp和96bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為195bp、134bp和96bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明公開了與奶山羊泌乳性相關(guān)的功能基因GHRHR的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。針對(duì)上述GHRHR基因的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其檢測(cè)方法，通過設(shè)計(jì)特定的PCR引物擴(kuò)增片段，能夠用RFLP方法簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對(duì)GHRHR基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與薩能奶山羊各胎次年平均泌乳量之間進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明CG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，擁有CG基因型的奶山羊其三胎年平均泌乳量均高于CC、GG基因型；GHRHR基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。由于GHRHR基因功能主要涉及不同泌乳期產(chǎn)奶量，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為GHRHR基因的SNP與產(chǎn)奶量關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)奶山羊乳用經(jīng)濟(jì)性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群。圖1為奶山羊血樣基因組DNA電泳檢測(cè)圖；圖2為奶山羊GHRHR基因PCR產(chǎn)物電泳；圖3為奶山羊GHRHR基因第6外顯子與部分第6內(nèi)含子425bp的PCR產(chǎn)物的MspI酶切電泳檢測(cè)GHRHR基因第7307位的C/G多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；CC基因型表現(xiàn)為291bp和134bp條帶；CG基因型表現(xiàn)為21bp、195bp、134bp和96bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為195bp、134bp和96bp條帶；圖4為奶山羊GHRHR基因SNP的不同基因型測(cè)序峰圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明根據(jù)與奶山羊的同源動(dòng)物牛的GHRHR基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，分別以2種奶山羊品種的基因組DNA池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)測(cè)序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對(duì)發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測(cè)方法，使得GHRHR基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測(cè)的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的奶山羊種群提供依據(jù)。a、奶山羊GHRHR基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測(cè)1、奶山羊血樣的采集及處理取山羊血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA500yL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-8(TC保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用了2個(gè)奶山羊品種，具體為(1)關(guān)中奶山羊血樣350份采自陜西省西安市三原塔南保種場(chǎng)；(2)薩能奶山羊血樣268份采自陜西省寶雞市千陽縣薩能奶山羊繁育中心(201份)和西北農(nóng)林科技大學(xué)奶山羊場(chǎng)(67份)；2、血樣基因組DNA的提取、純化(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500iiL至1.5mLE卯endorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500yL，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37。C水浴lh。DNA抽提緩沖液的配制0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8.0，4"保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1PL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500iiL，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500iiL，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中。(6)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-2(TC保存3060min。(7)4。C，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)4°C，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80100yL的TE_緩沖液或超純水，4。C保存直至DNA完全溶解，O.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-S(TC保存。(10)500iiL的DNA溶液中加入10%SDS使其終濃度為0.1X，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到50iig/mL;(11)5。C保溫10h左右；(12)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25:24:1)和氯仿分別抽提一次；(13)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；(14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA;(15)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60iiL滅菌超純水溶解，4。C待檢測(cè)。3、DNA池的構(gòu)建(1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。(力OD值測(cè)定用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和0D26。/60D28。的比值。如0D26。/0D28。比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA質(zhì)量(ng)=SOXOD腳值X稀釋倍數(shù)[OOSO](3)品種DNA池的構(gòu)建DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/iiL，然后從關(guān)中奶山羊品種50個(gè)濃度為50ng/iiLDNA樣品中取10iiL混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法也構(gòu)建薩能奶山羊品種DNA池。4、PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)由于山羊基因組序列尚未公布，所以以NCBI所公布的同源性較高的牛(NC_007302)與部分綿羊序列為參考，利用Primer5.0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含奶山羊GHRHR基因第六外顯子與部分內(nèi)含子區(qū)域的PCR引物，其引物對(duì)序列P如下上坊,弓l物PI:acgccaccctctttcaccc19;下坊,弓l物P2:catcctgggtgcttcttgaag21;5、PCR克隆奶山羊GHRHR基因分別以2個(gè)奶山羊品種的DNA池為模版，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)P進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為25yL，見表1;PCR總反應(yīng)程序，見表2。表1PCR反應(yīng)體系體系成分體積(uL)IOXPCR緩沖液(MBI)2.5MgCl2(25mmol/L)1.5dNTPs(2.5mmol/L)2.5上游引物(lOpmol/L)0.25下游引物(lOpmol/L)0.25T叫DNA聚合酶(0.5U/uL)2.0DNA模板(50ng/uL)1.0滅菌超純水(H20)15.0總體積25.0表2PCR反應(yīng)程序7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，可以清楚看到425bp的條帶，說明目的基因克隆成功；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下(1)首先向吸附柱中加入500iiL平衡液BL，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，6(TC水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700iiL漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500iiL漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000卬m離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000rpm離心1分鐘收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。把以上兩個(gè)品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。奶山羊GHRHR基因目的片段425bp的測(cè)序結(jié)果如SEQIDNO.1所示。對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；位于奶山羊的GHR服基因第7307位(SEQIDNO.1第231位)出現(xiàn)了C、G兩種檢測(cè)結(jié)果，即為篩查到的奶山羊GHRHR基因的SNP多態(tài)性，該位點(diǎn)是為C或G的堿基多態(tài)性。b、奶山羊GHRHR基因C>G突變多態(tài)性的PCR-RFLP檢測(cè)當(dāng)?shù)?307位點(diǎn)發(fā)生C>G突變時(shí)，即C突變?yōu)镚，使原來的序列CCCG也相應(yīng)地變成CCGG，從而成為MspI的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；可直接通過MspI對(duì)目的片段的酶切進(jìn)行基因分型。1、RFLP-PCR弓|物設(shè)計(jì)以引物對(duì)P作為PCR擴(kuò)增的引物。2、PCR反應(yīng)條件PCR產(chǎn)物擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件分別如同表1和表2所述，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以清晰的看到425bp的條帶。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Mspl酶切(1)20iiLMspI酶切反應(yīng)體系10iiLPCR產(chǎn)物，10X緩沖液(含BSA)2.53.0iiL，MspI(10U/iiL)為1.0iiL，8.0iiL滅菌純水(H20);(2)酶切消化條件37t:恒溫培養(yǎng)箱中消化510h。(3)MspI消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析用2.0%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1小時(shí)，EB染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用KodakDC120凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR擴(kuò)增的425bp片段中還包含其它的一個(gè)MspI酶切識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)GHRHR基因的第7307位由C突變?yōu)镚時(shí)，PCR擴(kuò)增的GHRHR基因產(chǎn)物的第7305bp7308bp序列為ccgg，限制性內(nèi)切酶Mspl識(shí)別后在cc/gg對(duì)擴(kuò)增片段酶切，將擴(kuò)增片段切為4段；而當(dāng)GHRHR基因的第7307位沒有發(fā)生突變，不能形成新的限制性內(nèi)切酶Mspl酶切識(shí)別位點(diǎn)，擴(kuò)增片段被切為2段；由于奶山羊?yàn)?倍體動(dòng)物，所以當(dāng)發(fā)生OG的突變時(shí)，可形成3種不同的基因型，分別為CC、CG、GG，其PCR-RFLP檢測(cè)的凝膠結(jié)果圖如圖3所示其中，CC基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點(diǎn)均不能被Mspl酶切，表現(xiàn)為291bp和134bp條帶；發(fā)生突變后的野生型GG的兩條鏈的SNP位點(diǎn)均能被酶切，表現(xiàn)為291bp、134bp和96bp條帶；雜合子CG的兩條鏈中的一條的SNP位點(diǎn)能夠被識(shí)別而另一條不能被識(shí)別，表現(xiàn)為291bp、195bp、134bp和96bp條帶；根據(jù)條帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，圖3所示的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果能夠很清楚的判定是否發(fā)生了點(diǎn)突變，將三種基因型區(qū)分開，從而檢測(cè)其SNP多態(tài)性。(4)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證利用ABI377和ABI3730測(cè)序儀對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測(cè)序；同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含291bp、195bp、134bp和96bp條帶的雜合子CG基因型個(gè)體其7307位的測(cè)序圖的確表示為C或G，如圖4b所示，自左向右第6個(gè)峰為兩個(gè)峰，而CC基因型、GG基因型分別為C、G，分別如圖4a、4c所示。c、GHRHR基因第7307位的SNP作為分子標(biāo)記在不同山羊群體多態(tài)性中的應(yīng)用1、群體多態(tài)性中的診斷利用上述的SNP多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)薩能奶山羊268份DNA樣品、關(guān)中奶山羊440份DNA樣品，分別進(jìn)行SNP多態(tài)性的鑒定；統(tǒng)計(jì)其SNP位點(diǎn)的頻率以及與性狀的關(guān)聯(lián)情況。2、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。PM=NAA/N，其中PAA代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；NM表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式可以寫成:PA=(2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A頻率，NM表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，N^表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為等位基因A的n個(gè)不同的復(fù)等位基因；統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。表3奶山羊GHRHR基因第7307位SNP基因頻率分布表奶山羊品種-.基因型頻率總計(jì)等位基因頻率ccCGGG618CG薩能奶山羊0.7390.2430.192680.840.19關(guān)中奶山羊0.6890.2820.0293500.830.17從表3可以看出薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊的C等位基因頻率遠(yuǎn)高于T等位基因，這表明等位基因C與泌乳性狀相關(guān)。3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)MspI識(shí)別的基因型(CC、CG和GG)生產(chǎn)數(shù)據(jù)胎次(第一胎、第二胎和第三胎)和年產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析模型利用SPSS(16.0)軟件分析基因位點(diǎn)、公畜、產(chǎn)羔季節(jié)、年齡和胎次因素與泌乳性狀的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用多元線性模型分析基因型效應(yīng)。模型如下yijklmn=y+Gen0typei+Sj+LSk+LN1+Agem+Xn+eijkl其中yijklm為個(gè)體表型記錄；1A胎次效應(yīng)；Sj為種公畜效應(yīng)；LSk:產(chǎn)羔季節(jié)效應(yīng)；Agem為年齡效應(yīng)；Xn為各種二級(jí)和二級(jí)以上互作效應(yīng)，如AgeXGenotype,SjXGenotype等；ew為隨機(jī)誤差；運(yùn)用SPSS(16.0)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對(duì)各基因型間產(chǎn)奶量指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明(見表4):對(duì)于Mspl可識(shí)別的第7307位的SNP位點(diǎn)，CG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，擁有CG基因型的奶山羊其三胎年平均泌乳量均高于CC、GG基因型，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。表4MspI多態(tài)位點(diǎn)與莎能奶山羊各胎泌乳量之間的方差分析每胎年產(chǎn)奶量(kg)CC(Mean士S.E.)CG(Mean士S.E.)GG(Mean士S.E.)識(shí)別位點(diǎn)第一胎第二胎第三胎628.985±10.850629.744±19.933548.700±79.733845.702±15.950855.112±29.302688.300±117.207957.204±18.902974.325±34.725901.100±138.899核苷酸序列表〈110〉西北農(nóng)林科技大學(xué)〈120〉奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法〈210>110〈211>426〈212>DNA〈213>奶山羊(C即rahircus)〈220〉〈221>s<222>(231)〈400>1acgccaccctctttcaccaggagaacatggaccactgcagcttctccactgteacagtcg60tgggtgggggtgctggcgtgggcagggaggttggattegagatgtcagcctgtgcagtcc120agtgggctgaccccggggctctggctttgcC朋gg3C3g3gcggg雄gcacccctcccc180cttcccgcccctccttggggtcaagtcctaaatcctcttgcgcccagcccsgtcattccc240ttgctccactctctgctccatettctgtattctggtttcattccccatcccagagccc;aa300cctegagcacatttcactccgctcatgctttccatctcacacttcctctgggctcggtct360gtgCtgggtgtgggtgtC3ggggctgg織朋gccaggtcctttcttcaag朋gC3CCC3420gg￡ltg￡l4261權(quán)利要求一種奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在如SEQIDNO.1所示的奶山羊的GHRHR基因序列表的第231位為C或G的堿基多態(tài)性。2.權(quán)利要求l所述的奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟以包含GHRHR基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊GHRHR基因；用限制性內(nèi)切酶MspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定SEQIDNO.l所示的奶山羊GHRH基因序列表的第231位堿基多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為上坊,弓l物PI:acgccaccctctttcaccc19;下游弓l物P2:catcctgggtgcttcttgaag21。3.如權(quán)利要求2所述的奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5t:預(yù)變性45min;94"變性30s，57.(TC復(fù)性35s，72"延伸35s，3035個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。4.如權(quán)利要求2所述的奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳。5.如權(quán)利要求2所述的奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊GHRHR基因第7307位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為291bp和134bp條帶;CG基因型表現(xiàn)為21bp、195bp、134bp和96bp條帶;GG基因型表現(xiàn)為195bp、134bp和96bp條帶。全文摘要本發(fā)明公開了奶山羊GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在如SEQIDNO.1所示的奶山羊的GHRHR基因序列表的第231位為C或G的堿基多態(tài)性。其檢測(cè)方法為以包含GHRHR基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊GHRHR基因；用限制性內(nèi)切酶MspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定其多態(tài)性。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于奶山羊的輔助選擇和分子育種，加快奶山羊良種繁育速度。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101705289SQ20091021900公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月17日優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日發(fā)明者劉艷麗,屈玉嬌,李轉(zhuǎn)見,胡沈榮,藍(lán)賢勇,陳宏,陳忠琦,雷初朝申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)