專利名稱：一種表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球應(yīng)用于生物樣品中純化核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球用
于純化核酸的方法。
背景技術(shù)：
目前，生物磁分離技術(shù)正在成為生命科學(xué)研究的一個重要手段。在分子生物學(xué)領(lǐng) 域中，核酸是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。作為遺傳信息的攜帶者，DNA是基因表 達的物質(zhì)基礎(chǔ)，除在生物體正常生長、發(fā)育和繁殖等生命活動中的作用外，它與生命異常如 腫瘤的發(fā)生、遺傳疾病等也密切相關(guān)。因此，對核酸分離純化是許多研究領(lǐng)域的重要前提和 保障。 目前常見的核酸分離方法有酚提取/沉淀法、層析法、密度梯度離心法等。這些傳 統(tǒng)方法往往比較費時，步驟繁瑣，需使用有機試劑，有損操作者健康。所以有必要研究一種 新的快速、方便的提取基因組DNA的方法。 Levison應(yīng)用一種以磁性瓊脂糖微球作為基質(zhì)，表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的 磁性微球用于核酸提取。 孫敏莉通過磁性納米粒子與葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一種磁性葡聚糖-DEAE 微球，并應(yīng)用于大場桿菌中提取質(zhì)粒。 上述兩種表面修飾DEAE的磁性微球與核酸結(jié)合，主要是由于磁性微球表面修飾 的DEAE在水溶液中帶有正電荷，可與帶負電荷的核酸結(jié)合，從而達到分離純化核酸的目 的。但是DEAE與核酸結(jié)合能力強，在洗脫過程中需用高濃度的鹽溶液洗脫。這給下游核酸 的應(yīng)用帶來不便。核酸在低濃度的鹽溶液中才能用于下游應(yīng)用。所以Levison和孫敏莉用 表面修飾DEAE的磁性微球提取核酸后，還需采用乙醇沉淀的方法除去高濃度的鹽，然后在 將核酸沉淀重新溶解在緩沖溶液中。因此，該核酸純化過程費時費力，而且在乙醇沉淀的過 程中造成核酸的損失。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種具有相似結(jié)構(gòu)的陽
離子修飾的磁性二氧化硅微球，該磁性微球表面的陽離子功能基團的pK值介于4 8之
間，在一定pH條件下帶正電荷，可與核酸結(jié)合，升高溶液的pH值該功能基團不帶電荷，核酸
從磁性微球表面脫落。應(yīng)用該磁球建立的核酸純化方法，洗脫條件不需高濃度的鹽溶液，無
需醇沉步驟，避免了乙醇沉淀過程中對核酸的浪費，并且縮減了純化核酸所需時間，大大提
高了提純效率。 本發(fā)明的技術(shù)方案 —種表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球應(yīng)用于生物樣品中純化核酸的方法，其 特殊之處在于該方法包括以下步驟
(1)生物樣本的裂解 向生物樣本加入裂解液(譬如取100 200iil)，渦旋30 60秒，加入20mg/ml 蛋白酶K(譬如取2. 5 5ii l)，混勻，于50 6(TC裂解25 60min分鐘；
(2)核酸的結(jié)合 向步驟(1)得到的產(chǎn)物中加入滅菌水(譬如取0. 8 1. 6ml)和儲存于預(yù)處理溶 液的表面修飾有陽離子的磁性二氧化硅微球，吹吸混勻，孵育3 5分鐘；
(3)清洗 向步驟(2)得到的產(chǎn)物中加入清洗液(譬如取0.4 0.8ml)，搖勻，靜置l 3分
鐘，磁性分離，棄上清； (4)洗脫 向步驟(3)得到的產(chǎn)物中加入洗脫液(譬如取100 200iU)，吹吸均勻，50
65t:孵育5 10分鐘，磁性分離，收集上清，所得上清液為分離出的核酸； 上述步驟(2)表面修飾有陽離子的磁性二氧化硅微球是以磁性二氧化硅微球作
為模板，以環(huán)氧烷偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作為活化劑，選擇
帶電基團的pKa值介于4 8的一類陽離子修飾劑作為功能基團制備而成的。 上述步驟(1)裂解液的成分是0. 01 0. 5M MES、0. 5 2M鹽酸胍、0. 01 1MEDTA
和質(zhì)量濃度為0. 1 2%的Triton X-100，該裂解液的pH值為4. 0 8. 0 ; 上述步驟(2)預(yù)處理溶液的成分是5 20mM MES、0. 1 3mM EDTA禾P 0. 5 30mM
NaCl ; 上述步驟(3)清洗液的成分是1 50mM MES和0. 5 10mM EDTA，pH值為5. 5 8 ; 上述步驟(4)洗脫液的成分是10mM Tris-HCl和lmM EDTA， pH值為8. 5 10 ;
本發(fā)明的優(yōu)點 1、該方法利用陽離子修飾的磁性二氧化硅微球純化核酸時，洗脫步驟不需高濃度 的鹽溶液，無需乙醇沉淀步驟，避免乙醇沉淀過程造成的核酸的損失，縮短了純化核酸所需 的時間，大大提高了提純效率。
2、該方法設(shè)計合理、工藝可行。


圖1為實施例1中產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果； 圖2為實施例1中紫外分光光度計進行核酸定量結(jié)果具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明
實施例1 取2mL離心管，分別加入200ii L凍存血，100iil裂解液(0. 03M MES、0. 8M鹽酸胍、 0. 03M EDTA和質(zhì)量濃度為0. 5%的Triton X-100)，渦旋30秒，加入2. 5 ii 1 20mg/ml蛋白 酶K，混勻，于5(TC裂解25min。 裂解后加入0. 8ml滅菌水和約lmg表面修飾組氨酸的磁性二氧化硅微球(儲存于10mM MES、lmM EDTA、10mM NaCl的溶液中)。吹吸混勻，孵育5分鐘，加入0. 4ml清洗液 (10mM MES、lmM EDTA、pH 6. O)，搖勻靜置1分鐘。磁性分離去上清。 加入100 ii 1洗脫液(10mM Tris-HCl、lmM EDTA、pH 8. 5)，吹吸均勻，孵育5分鐘， 磁性分離收集上清。 用收集的上清進行瓊脂糖電泳，結(jié)果見圖1，圖中泳道1為核酸Marker,泳道2為 洗脫液，即收集到的上清，該泳道條帶單一，且大小約為23kb，說明得到的上清是基因組核 酸。用紫外分光光度計進行核酸定量分析，結(jié)果如圖2所示。該紫外圖在260有特征峰。由 以上結(jié)果說明用該方法得到了較純的基因組核酸。
實施例2 取10mL離心管，分別加入2mL凍存血，lmL裂解液(0. 03M MES、0. 8M鹽酸胍、0. 03M EDTA和質(zhì)量濃度為0. 5 %的Triton X-100)，渦旋30秒，加入2. 5 yl 20mg/ml蛋白酶K，混 勻，于5(TC裂解25min。 裂解后分別加入8ml滅菌水和約10mg表面修飾多聚組氨酸的磁性二氧化硅微球
(儲存于10mM MES、lmM EDTA、10mM NaCl的溶液中)。吹吸混勻，孵育5分鐘，加入lml清
洗液(10mM MES、lmM EDTA、pH 6. O)，搖勻靜置1分鐘。磁性分離去上清。加入100 ii 1洗脫液(10mM Tris-HCl、lmM EDTA、pH 8. 5)，吹吸均勻，孵育5分鐘，
磁性分離收集上清。
權(quán)利要求
一種表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球應(yīng)用于生物樣品中純化核酸的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)生物樣品的裂解向生物樣本加入裂解液，渦旋30～60秒，加入20mg/ml蛋白酶K，混勻，于50～60℃裂解25～60min分鐘；(2)核酸的結(jié)合向步驟(1)得到的產(chǎn)物中加入滅菌水和儲存于預(yù)處理溶液的表面修飾有陽離子的磁性二氧化硅微球，吹吸混勻，孵育3～5分鐘；(3)清洗向步驟(2)得到的產(chǎn)物中加入清洗液，搖勻，靜置1～3分鐘，磁性分離，棄上清；(4)洗脫向步驟(3)得到的產(chǎn)物中加入洗脫液，吹吸均勻，50～65℃孵育5～10分鐘，磁性分離，收集上清，所得上清液為分離出的核酸；所述步驟(2)表面修飾有陽離子的磁性二氧化硅微球是以磁性二氧化硅微球作為模板，以環(huán)氧烷偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作為活化劑，選擇帶電基團的pKa值介于4～8的一類陽離子修飾劑作為功能基團制備而成的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)裂解液的成分是0. 01 0. 5M MES、0. 5 2M鹽酸胍、0. 01 1M EDTA和質(zhì)量濃度為0. 1 2%的Triton X-100，該 裂解液的pH值為4.0 8.0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)預(yù)處理溶液的成分是5 20mM MES、0. 1 3mM EDTA和0. 5 30mM NaCl。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)清洗液的成分是1 50mM MES和0. 5 10mM EDTA， pH值為5. 5 8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(4)洗脫液的成分是10mM Tris-HCl和lmM EDTA， pH值為8. 5 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球用于純化核酸的方法。該方法包括(1)生物樣品的裂解；(2)表面修飾陽離子的磁性二氧化硅微球與核酸結(jié)合；(3)清洗；(4)洗脫，通過磁性分離得到純化后的核酸樣品。該磁性微球表面的陽離子功能基團的pK值介于4～8之間，在一定pH條件下帶正電荷，可與帶有負電荷的核酸分子結(jié)合，增加溶液pH值將中和功能基團所帶電荷，降低或消除正負電荷的相互作用，核酸從磁性微球表面解離。應(yīng)用該磁球建立的核酸純化方法，無需醇沉步驟，避免了乙醇沉淀過程中核酸的損失，洗脫不需高濃度的鹽溶液，并且縮減了純化核酸所需時間，大大提高了提純效率。
文檔編號C12N15/10GK101709299SQ200910219010
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者崔亞麗, 楊磊, 胡道道, 陳超 申請人:陜西北美基因股份有限公司