專利名稱：一種用金磁微粒純化總核酸的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于核酸純化領域，涉及一種對總核酸(包括基因組DNA和總RNA)進行純 化的方法，具體涉及一種用金磁微粒純化總核酸的方法。
背景技術：
在過去的幾十年，分子生物學研究經(jīng)歷了突飛猛進的發(fā)展。隨著技術的進步，核 酸純化已經(jīng)成為分子生物學研究準備階段的必備工作。疾病診斷、克隆、測序、擴增、雜交、 cDNA分析等實驗操作的首要步驟就是純化出完整、高質(zhì)量的核酸。因此，尋求快速、可靠、具 有可重復性的核酸純化方法一直以來為人們所關注。 目前使用的核酸純化方法大體上可分為液相分離和固相分離兩大類。傳統(tǒng)的液相 分離純化方法需要經(jīng)過一系列復雜的沉淀和清洗步驟，不僅耗時而且費力。同時，繁多的純 化步驟還增加了核酸降解、核酸損失以及交叉污染的可能性，造成低得率、低純度。該方法 首先需要用變性劑或離液劑以及蛋白酶對生物樣本進行裂解，再用有機溶劑如酚、氯仿或 醇對裂解的生物樣本進行處理。而清理這些對人體有劇毒的有機溶劑又需要一筆昂貴的費 用。近些年來，基于吸附作用的固相分離純化技術得到了進一步的發(fā)展，該吸附過程可通過 以下四種方式得以實現(xiàn)①在離液劑存在的條件下，核酸與親水性基質(zhì)間的氫鍵作用；② 通過陰離子交換劑實現(xiàn)水相中的離子交換；③親和吸附；④用于DNA純化的分子排阻機制。
利用磁性載體進行的核酸分離純化屬于固相分離純化法的一種。與非磁性分離 純化方法相比，磁性分離純化法具有顯著優(yōu)勢，其純化過程簡單、快速且純化質(zhì)量高，無需 使用酚、氯仿等有機溶劑。目前，國內(nèi)此類研究起步較晚，產(chǎn)品參差不齊，純化質(zhì)量不高，而 Qiagen、Ambion等國外公司的類似產(chǎn)品價格又十分昂貴，不能得到普遍應用。
專利CN 1580067A、 CN1995052A以及CN 101354938A所涉及的核酸的磁性分離 方法都需對磁粒進行目的核酸探針的修飾，然后再用經(jīng)過修飾的磁粒分離純化得到目的核 酸。該過程不但復雜，而且屬于特異性分離，不能將生物樣本的總核酸同時純化出來。
金磁微粒，即組裝型磁性復合微粒和核/殼型超順磁性復合微粒，其制備方法以 及結(jié)構(gòu)組成已經(jīng)在中國專利ZL 03153486. 4和ZL 03124061. 5分別進行了公開，本專利即 利用該自主研發(fā)的金磁微粒提供一種能夠快速、有效且成本低廉的純化生物樣本總核酸的 方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、快速、純化質(zhì)量高且成本低廉的利用金磁微 粒純化總核酸的方法，通過此方法能夠同時純化出基因組DNA和RNA。
本發(fā)明的技術解決方案是 —種用金磁微粒純化總核酸(包括基因組DNA和總RNA)的方法，其特殊之處在
于，該方法包括以下步驟 1)制備含有總核酸的樣品裂解液
用裂解液對生物樣本進行裂解，得到含有總核酸的樣品裂解液；
2)結(jié)合 將金磁微粒與含有總核酸的樣品裂解液混合，在結(jié)合緩沖液的作用下，形成金磁 微粒_總核酸復合物；
3)清洗 對含有金磁微粒_總核酸復合物的溶液進行磁性分離，棄去上清液，再加入清洗 液混勻，磁性分離，棄上清，得到金磁微粒_總核酸復合物；
4)洗脫 將洗脫液與金磁微粒_總核酸復合物混勻，使總核酸從金磁微粒上轉(zhuǎn)到洗脫液
中，磁性分離直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即為純化得到的總核酸溶液。 上述步驟4)純化得到的總核酸，經(jīng)過核酸酶的處理，還可以分別得到基因組DNA
和總RNA，具體實現(xiàn)方法是將步驟4)純化得到的總核酸通過DNase消化，可以得到總RNA ;
或?qū)⒉襟E4)純化得到的總核酸通過RNase消化，可以得到基因組DNA。 上述金磁微粒是指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面包裹
單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復合微粒，也指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚
集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的磁性復合微粒。所述磁性納米粒子
包括Fe304、 Y _Fe203等鐵的氧化物粒子，單質(zhì)Fe、Co、Ni粒子，或由Fe與其它金屬元素形成
的正鐵酸鹽粒子；磁性納米粒子的聚集體是指經(jīng)修飾后形成的Fe304、 Y _Fe203等鐵的氧
化物粒子聚集體，經(jīng)修飾后形成的單質(zhì)Fe、Co、Ni粒子聚集體，或經(jīng)修飾后形成的Fe與其它
金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子聚集體。 上述步驟1)的裂解液是胍鹽裂解液或鋰鹽裂解液；所述胍鹽是硫氰酸胍或鹽酸 胍，濃度為0. 2M 20M ;所述鋰鹽是LiCl或LiBr，濃度為2M 12M。 上述步驟2)的結(jié)合緩沖液含聚乙二醇和鹽，所述聚乙二醇的分子量在6000 10000之間，濃度為10% 30% (W/V)，所述鹽是氯化鈉、氯化鋰、氯化鉀、氯化鎂、氯化牽丐、 氯化鋇或氯化銫，濃度為1M IOM。 上述步驟3)的清洗液是濃度為50% 90% (V/V)的乙醇溶液。 上述步驟4)的洗脫液為pH = 7. 0 8. 0，濃度為0. 001M 0. 1M的TE緩沖液或
無核糖核酸酶水。 上述步驟l)用于純化總核酸的生物樣本包括血液、細胞、細菌、植物組織和動物 組織。 利用本方法純化鼠肝臟組織基因組DNA的電泳圖片如圖3所示；
利用本方法從硫酸鹽還原菌中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜如圖4所示；
利用本方法從擬南芥植物中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜如圖5所示；
利用本方法從Jurkat細胞中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜如圖6所示；
利用本方法純化的總核酸進行13 -actin基因的RT-PCR的電泳圖片如圖8所示。
本發(fā)明的優(yōu)點是 1、該方法整個純化過程不需要離心分離過程由磁性分離實現(xiàn)，這不但避免了離 心過程中可能帶來的交叉污染，而且能夠避免多次離心過程產(chǎn)生的剪切力對核酸的破壞。
2、純化得到的總核酸純度高由于在清洗過程中核酸-磁粒的復合物充分分散懸
4浮在清洗液中，清洗徹底，因此該純化方法得到的總核酸純度高，能夠去除抑制酶反應的抑 制劑。 3、純化過程快速該方法中無需對金磁微粒包裹核酸探針，可將金磁微粒直接用 于核酸純化。整個純化過程可在不到一個小時內(nèi)完成，操作簡便、快速。 4、本發(fā)明在進行核酸純化過程中，核酸與金磁微粒的結(jié)合屬于非特異性吸附，因 此純化得到的核酸不具有專一性，可以同時分離得到生物樣本中的基因組DNA和RNA。


圖1為利用本方法純化鼠肝臟組織中總核酸的電泳圖片； 圖2為利用本方法純化鼠肝臟組織中總RNA的電泳圖片； 圖3為利用本方法純化鼠肝臟組織基因組DNA的電泳圖片； 圖4為利用本方法從硫酸鹽還原菌中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜； 圖5為利用本方法從擬南芥植物中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜； 圖6為利用本方法從Jurkat細胞中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜； 圖7為利用本方法從兔血中純化總核酸的電泳圖片和紫外圖譜； 圖8為利用本方法純化的總核酸進行13 -actin基因的RT-PCR的電泳圖。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明金磁微粒純化總核酸的方法作進一步的說明。實施例1 : 用金磁微粒從鼠肝臟組織中純化總核酸的方法
1)制備含有總核酸的樣品裂解液 1. 1)取50mg鼠肝臟組織放入玻璃勻漿器，加入lml胍鹽裂解液勻漿。該胍鹽裂解 液含2M鹽酸胍； 1. 2)將樣品裂解液移入一 2ml離心管中，置于冰上備用；
2)結(jié)合 2. 1)取100iil金磁微粒于另一支2ml離心管中，將其置于磁性分離器上磁性分離 直至上清澄清，棄去上清液； 2. 2)取下離心管，向管中加入600iU結(jié)合緩沖液，混勻備用。該結(jié)合緩沖液含1M 的NaCl和10% (W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000 ; 2. 3)用移液器移取步驟1. 2)的樣品裂解液600 y 1于步驟2. 2)的離心管中，吹 吸混勻，室溫靜置5min，然后將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清，棄去上清 液； 3)清洗 取下離心管，向管中加入600 ii 1濃度為75% (V/V)的乙醇溶液，吹吸混勻，將其置 于磁性分離器上，棄去上清液；重復清洗兩次，在室溫晾干5min ;
4)洗脫 向管中加入200 ii 1無核酸酶水，吹吸混勻，室溫靜置5min ;然后將離心管置于磁 性分離器上分離至上清澄清，并將上清液移入另一離心管中，保存?zhèn)溆?。所得上清液即為?鼠肝臟組織中純化得到的總核酸溶液。圖1為該方法從鼠肝組織中純化總核酸的電泳圖
5片。 實施例2 :從鼠肝臟組織中純化總RNA的方法
1)制備含有總核酸的樣品裂解液 1. 1)取50mg鼠肝臟組織放入玻璃勻漿器，加入1ml鋰鹽裂解液勻漿。該鋰鹽裂解 液含3M的LiCl ; 1. 2)將樣品裂解液移入一 2ml離心管中，置于冰上備用；
2)結(jié)合 2. 1)取100iil金磁微粒于另一支2ml離心管中，將其置于磁性分離器上磁性分離 直至上清澄清，棄去上清液； 2. 2)取下離心管，向管中加入600iU結(jié)合緩沖液，混勻備用。該結(jié)合緩沖液含1M 的NaCl和10% (W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000 ; 2.3)用移液器移取步驟1.2)的樣品裂解液300iU于步驟2.2)的離心管中，吹 吸混勻，室溫靜置5min，然后將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清，棄去上清 液； 3)清洗 取下離心管，向離心管中加入600 ii 1濃度為75% (V/V)的乙醇溶液，吹吸混勻，將 其置于磁性分離器上，棄去上清液，室溫晾干5min ;
4)消化 向離心管中加入85iil無核酸酶水、10ii1 RDD buffer和5iU DNase，吹吸混勻， 室溫靜置15min ;
5)再結(jié)合 向離心管中加入600 ii 1結(jié)合緩沖液吹吸混勻，室溫靜置2min ;將離心管置于磁性 分離器上，磁性分離至上清澄清，棄去上清液。該結(jié)合緩沖液含1M的NaCl和10% (W/V)的 聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000 ;
6)清洗 重復步驟3)兩次，室溫晾干5min ;
7)洗脫 向離心管中加入200 ii 1無核酸酶水，吹吸混勻，室溫靜置5min ;然后將離心管置 于磁性分離器上分離至上清澄清，并將上清液移入另一離心管中，保存?zhèn)溆?。所得上清液?為從鼠肝臟組織中純化得到的總RNA溶液。圖2為該方法從鼠肝組織中純化總RNA的電泳 圖片。 實施例3 :從兔血中純化總核酸的方法
1)制備含有總核酸的樣品裂解液 1. 1)取600 iil新鮮兔血抗凝血液于2ml離心管，加入600 y 1的胍鹽裂解液吹吸 混勻。該胍鹽裂解液含2M鹽酸胍； 1. 2)3000g離心lmin，將沉淀甩至管底，吸取約600 iU上清液于另一離心管中備 用； 2)結(jié)合 2. 1)取100iil金磁微粒于另一支2ml離心管中，將其置于磁性分離器上磁性分離直至上清澄清，棄去上清液； 2. 2)取下離心管，向管中加入600iU結(jié)合緩沖液，混勻備用。該結(jié)合緩沖液含1M 的NaCl和10% (W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000 ; 2. 3)用移液器移取步驟1. 2)的上清液600 y 1于步驟2. 2)的離心管中，吹吸混 勻，室溫靜置5min，然后將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清，棄去上清液；
3)清洗 取下離心管，向離心管中加入600 ii 1濃度為75% (V/V)的乙醇溶液，吹吸混勻，將 其置于磁性分離器上，棄去上清液；重復清洗兩次，在室溫晾干5min ;
4)洗脫 向管中加入200 ii 1無核酸酶水，吹吸混勻，室溫靜置5min ;然后將離心管置于磁 性分離器上分離至上清澄清，并將上清液移入另一離心管中，保存?zhèn)溆?。所得上清液即為?兔血中純化得到的總核酸溶液。圖7為該方法從兔血中純化總核酸的電泳圖片和紫外光 譜。
權利要求
一種用金磁微粒純化總核酸的方法，該總核酸包括基因組DNA和總RNA，其特征在于該方法包括以下步驟1)制備含有總核酸的樣品裂解液用裂解液對生物樣本進行裂解，得到含有總核酸的樣品裂解液；2)結(jié)合將金磁微粒與含有總核酸的樣品裂解液混合，在結(jié)合緩沖液的作用下，形成金磁微粒-總核酸復合物；3)清洗對含有金磁微粒-總核酸復合物的溶液進行磁性分離，棄去上清液，再加入清洗液混勻，磁性分離，棄上清，得到金磁微粒-總核酸復合物；4)洗脫將洗脫液與金磁微粒-總核酸復合物混勻，使總核酸從金磁微粒上轉(zhuǎn)到洗脫液中，磁性分離直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即為純化得到的總核酸溶液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于得到的總核酸溶 液，經(jīng)過核酸酶的處理，得到基因組DNA和總RNA :將步驟4)純化得到的總核酸通過DNase消化，得到總RNA;或?qū)⒉襟E4)純化得到的總 核酸通過RNase消化，得到基因組DNA。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于所述金磁微粒 為核/殼型超順磁性復合微?；蚪M裝型磁性復合微粒。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于步驟1)所述裂 解液是胍鹽裂解液或鋰鹽裂解液；所述胍鹽是硫氰酸胍或鹽酸胍，濃度為0. 2M 20M ;所述 鋰鹽是LiCl或LiBr，濃度為2M 12M。
5. 根據(jù)權利要求1所述用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于步驟2)的結(jié)合 緩沖液含聚乙二醇和鹽，所述聚乙二醇的分子量在6000 10000之間，質(zhì)量體積濃度為 10% 30%，所述鹽是氯化鈉、氯化鋰、氯化鉀、氯化鎂、氯化^、氯化鋇或氯化銫，濃度為 1M IOM。
6. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于步驟3)所述清 洗液是體積濃度為50% 90%的乙醇溶液。
7. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于步驟4)的洗脫 液為pH = 7. 0 8. 0，濃度為0. 001M 0. 1M的TE緩沖液或無核糖核酸酶水。
8. 根據(jù)權利要求1所述的用金磁微粒純化總核酸的方法，其特征在于步驟1)用于純 化總核酸的生物樣本包括血液、細胞、細菌、植物組織和動物組織。
全文摘要
本發(fā)明屬于核酸純化領域，尤其涉及一種用金磁微粒純化總核酸(包括基因組DNA和總RNA)的方法。該方法包括制備含有總核酸的樣品裂解液；將金磁微粒與生物樣品裂解液混合，在結(jié)合緩沖液的作用下，形成金磁微粒-總核酸復合物；對金磁微粒-總核酸復合物磁性分離，進行清洗；然后用洗脫液將總核酸從金磁微粒表面洗脫下來，磁性分離后收集上清液，即得純化的總核酸溶液。該純化方法不需要離心，操作簡便，純化過程快速，得到總核酸質(zhì)量高且成本低廉，并可同時分離得到生物樣本中的基因組DNA和RNA。
文檔編號C12N15/10GK101724625SQ20091021912
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權日2009年11月25日
發(fā)明者劉蓓, 安德魯·G·陳, 崔亞麗, 張景閣 申請人:陜西北美基因股份有限公司