專利名稱：：重組副溶血弧菌外膜蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)的重組副溶血弧菌外膜蛋白及制備方法。
背景技術(shù)：
：副溶血性弧菌是一種常見的革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中。它是海水魚類養(yǎng)殖業(yè)中常見的一種條件致病菌，在某些特定條件如水質(zhì)惡化或異常環(huán)境等情況下，能引起養(yǎng)殖魚類患病，給水產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失?；【耐饽ぴ趯λ拗鞯母腥竞椭虏∵^程中發(fā)揮很重要的作用，作為外源物質(zhì)，它們易被宿主免疫系統(tǒng)所識別。其中外膜蛋白是菌體外膜的主要成分之一，因外膜蛋白直接面對宿主的體液及組織，細菌利用外膜蛋白進行粘附、侵入和炎癥等生理活動，更容易被宿主識別作為攻擊目標，因此弧菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性。不僅可以剌激體液免疫，而且對細胞免疫亦有剌激作用。在外膜蛋白中，0mpW屬于小的細菌外膜孔蛋白0mpW家族，由8股P片層結(jié)構(gòu)形成一個狹長的疏水通道，與轉(zhuǎn)運小的疏水分子通過細菌外膜有關(guān)。研究表明，OmpW與環(huán)境鹽度(Nacl)和細菌滲透壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而鹽度、溫度和溶氧等環(huán)境因子對病原菌在宿主體內(nèi)的生長和毒力的產(chǎn)生有顯著影響，因此，研究副溶血弧菌外膜蛋白，可有效地控制養(yǎng)殖條件，抑制弧菌病的流行。然而，從弧菌中直接提取該蛋白的操作復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量少，不能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)且所得蛋白容易降解，因此人們致力于重組制備副溶血弧菌外膜蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)已有關(guān)于對弧菌外膜蛋白OmpW表達的報道(RonghuaQian，ZhaohuaXiao，ChongwenZhangetal.ExpressionandpurificationoftwomajoroutermembraneproteinsfromVibrioalginolyticus.WorldJMicrobiolBiotechnol.2008，24:245-251)，是通過將溶藻弧菌外膜蛋白ompW基因與pET_30a(+)表達載體重組獲得表達質(zhì)粒來表達0mpW蛋白的，但是，此方法在表達過程中產(chǎn)生了包涵體，所以在純化前要對樣品進行變性和復(fù)性，不僅操作復(fù)雜，增加制備成本，也容易使蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應(yīng)于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重組副溶血弧菌外膜蛋白及制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種重組副溶血弧菌外膜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4?！N上述重組副溶血弧菌外膜蛋白的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA;b.設(shè)計副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為模板進行PCR擴增；c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍白斑法篩選陽性克隆，選擇579bp大小的條帶進行回收；d.用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質(zhì)粒；e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種；f.將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。所述引物對的核苷酸序列為上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。所述PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進行94t:變性30秒、58。C復(fù)性30秒、72t:延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C。所述e步驟是將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)后，挑取單菌落接種于5mlAmpLB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5mlAmpLB液體培養(yǎng)基，37°C、200轉(zhuǎn)/分搖菌2.5小時，至菌液的0D600為0.4，向菌液中加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmM，37。C搖菌4小時后，回收菌體。所述g步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為0.22iim的過濾器過濾細菌裂解液，在4mlBindbuffer中加lml50^的Ni-NTAHisBind樹脂懸液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C，200rpm振蕩12h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0.5mlElutebuffer洗脫，收集洗脫液。本發(fā)明根據(jù)GenBank中副溶血弧菌外膜蛋白的DNA序列，設(shè)計針對外膜蛋白編碼序列的引物對，以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與pMD19T載體連接得重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中；通過IPTG誘導(dǎo)實現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達。因在表達過程中不產(chǎn)生包涵體，該表達質(zhì)粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，方便了樣品的鑒定和純化，避免了樣品的變性和復(fù)性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步研究副溶血弧菌外膜蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。圖1本發(fā)明實施例副溶血弧菌外膜蛋白基因片斷的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖2本發(fā)明實施例重組表達質(zhì)粒的雙酶切電泳鑒定圖。圖3本發(fā)明實施例純化柱洗脫組分的SDS-PAGE分析圖。圖4本發(fā)明實施例重組表達質(zhì)粒表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖。圖5本發(fā)明實施例重組表達質(zhì)粒誘導(dǎo)表達的蛋白印跡分析圖。具體實施例方式實施例a.將副溶血弧菌菌種ATCC17802接種于2216E瓊脂平板上，28。C過夜培養(yǎng)，從所述接種于2216E瓊脂平板上的副溶血弧菌菌體中以CTAB法提取DNA。b.根據(jù)已發(fā)表的GenBank中副溶血弧菌的外膜蛋白基因保守序列設(shè)計針對外膜蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為模板進行PCR擴增，引物對的核苷酸序列為上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進行94t:變性30秒、58。C復(fù)性30秒、72。C延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C。引物對由上海生物工程有限公司合成，劃線部分分別為BamHI酶切位點和Xhol酶切位點。以副溶血弧菌基因組DNA為模板，用PCR技術(shù)獲得目的基因。目的基因片斷的瓊脂糖凝膠電泳分析圖如圖l所示，圖中1:外膜蛋白基因的PCR產(chǎn)物；2:陰性對照；3:MakerDL2000。c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍白斑法篩選陽性克隆，用酶切方法對陽性克隆進行分析以鑒定重組質(zhì)粒并選擇579bp大小的條帶進行回收。d.用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET-32a(+)，37t:作用2小時后，酶切產(chǎn)物用DNAFragmentPurificationKit(Takara公司)回收，PCR酶切產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物按5:1混合，T4DNA連接酶(Takara公司)16°C過夜連接，37t:過夜培養(yǎng)，提取重組表達質(zhì)粒pET-ompW;用BamHI和XhoI對重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示圖中1:MakerDL2000;2:pET-ompW質(zhì)粒；3:pET-ompW經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切產(chǎn)物。測序結(jié)果表明，所測序列與其他弧菌外膜蛋白OmpW編碼序列同源性極高，故初步確認所提取的重組表達質(zhì)粒為副溶血弧菌外膜蛋白OmpW的編碼序列。e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，挑取單菌落接種5mlAmpLB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取50yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5mlAmpLB液體培養(yǎng)基，37°C200轉(zhuǎn)/分搖菌2.5小時，至0D600為0.4，所搖菌液加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmM，37t:搖菌4小時后，回收菌體，即得到菌種。f.將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；g.用BllgBuste纖Ni-NTAHisBindPurificationkit(Novagen公司)純化融合蛋白，具體操作步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為0.22iim的過濾器過濾細菌裂解液，除去其中的大顆粒。在4mlBindbuffer中加1ml50%的Ni-NTAHisBind樹脂懸液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后用移液槍吸去上清液取沉淀；在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C，200rpm振蕩12h形成混合液；將混合液移入純化柱，打開底部的蓋子，收集液體；用4mlWashbuffer洗滌，收集洗滌液；用0.5mlElutebuffer洗脫，收集洗脫液。SDS-PAGE分析各收集液，其結(jié)果如圖3所示圖中1:洗滌部分；2:蛋白Marker;3:純化蛋白部分；洗脫液部分即為純化的蛋白液。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。重組副溶血弧菌外膜蛋白(0mpW)的鑒定l.SDS-PAGE電泳配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。將誘導(dǎo)前的樣品和誘導(dǎo)后的樣品各取20分別加入20ill2XSDSloadingbuffer混勻，沸水煮5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，留取上清做SDS-PAGE。120V恒壓電泳2h、考馬斯亮藍R250染色2小時、脫色液脫色。觀察，在43.3kDa處有明顯條帶出現(xiàn)，如圖4所示，圖中1:pET32a(+)誘導(dǎo)前產(chǎn)物；2:pET32a(+)誘導(dǎo)后表達蛋白；3:蛋白Marker;4:pET-ompW誘導(dǎo)前產(chǎn)物；5:pET-ompW誘導(dǎo)后表達蛋白。2.WesternBlot鑒定當SDS-PAGE電泳即將結(jié)束時，用蒸餾水洗清石墨板，擦干。從SDS-PAGE膠上切下需要轉(zhuǎn)膜的部分。戴手套操作，切6張濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC)。把硝酸纖維素膜浸沒于去離子水的水面中，濾紙浸沒于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡5分鐘。按紙、膜、膠、紙的順序從陽極到陰極擺放正確，連接電源，注意正負極。根據(jù)凝膠面積按0.65-1.0mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移0.5-2h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，切斷電源，從上至下拆卸裝置，逐一拆去各層。在NC上作標記。把凝膠取出進行抗體標記。硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和Anti-HisAntibody。(Anti-HisAntibody為1:1000稀釋)。37。C搖床中溫育lh。取出硝酸纖維素膜，用PBS漂洗3次，每次10分鐘。濾膜再用TBST漂洗10分鐘。硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和l:2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠酶標二抗。37t:搖床中溫育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。將NC膜放在底物液中直到有條帶出現(xiàn)(一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。觀察結(jié)果，在43.3KDa處有一條特異性免疫條帶。如圖5所示，圖中1:蛋白Marker;2:誘導(dǎo)后的pET-ompW;3:誘導(dǎo)前的pET-ompW作為陰性對照。結(jié)果和預(yù)期的pET-ompW大小一致。序列表〈110〉大連水產(chǎn)學(xué)院〈120〉重組副溶血弧菌外膜蛋白及制備方法〈160>4〈170>PatentinVersion3.1〈210>1〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1cgcggatcccataaacaaggtgacttcgtt〈210>2〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>2cgctcgaggaacttgtaaccgccgct26〈210>3〈211>579〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉副溶血弧菌外膜蛋白OmpW基因〈400>3cate朋c朋ggtgacttcgttcttcgtgttggtgcggcgtctgtcgttccaaatgacagc60agcgateagattcttggttctcaagaagaattga朋gtgg3ttca朋tecgcagcttggt120ttgacgtttggctecatgttcacagacaacatcagcctegagcttctegcagcaacacca180ttcagccatgatetttcaacagacttgtteggtcttggtgatetcgcggac3cc朋3C3c240cttccaccaacgcttetggttcagtectectttggcgagccacaaagteagttccgtcca300tecgttggtgcaggtctcaactecaccatcttttttgatg朋ggcttteac朋ca朋gcg360a朋朋cgtgggctteactgatctteagctegacgattcatttggtttegc3gca朋cgte420ggcgtggact3C3tg3tC皿cgatc皿tggttcctteacgcatctgcgtggtetgcaaac■3ttg朋3C3g皿gc皿catera皿tttggtggagcg朋gc朋朋朋ccgacgtc朋朋tt540aacccttgggtetttetgatcagcggcggttecaagttc579〈210>4〈211>193〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉副溶血弧菌外膜蛋白OmpW〈400>4HisLysGinGlyAspPheValLeuArgValGlyAlaAlaSerVal151015ValProAsnAspSerSerAspLyslieLeuGlySerGinGluGlu202530<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種重組副溶血弧菌外膜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO4。2.—種如權(quán)利要求1所述重組副溶血弧菌外膜蛋白的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA;b.設(shè)計副溶血弧菌外膜蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為模板進行PCR擴增；c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過藍白斑法篩選陽性克隆，選擇579bp大小的條帶進行回收；d.用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質(zhì)粒；e.將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種；f.將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組副溶血弧菌外膜蛋白的制備方法，其特征在于所述引物對的核苷酸序列為上游引物PaF:5'-CGCGGATCCCATAAACAAGGTGACTTCGTT-3';下游引物PaR:5'-CGCTCGAGGAACTTGTAACCGCCGCT-3'。所述PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進行94t:變性30秒、58"C復(fù)性30秒、72"C延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組副溶血弧菌外膜蛋白的制備方法，其特征在于所述e步驟是將所提取的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)后，挑取單菌落接種于5mlAmpLB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5mlAmpLB液體培養(yǎng)基，37°C、200轉(zhuǎn)/分搖菌2.5小時，至菌液的0D600為0.4，向菌液中加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmM，37t:搖菌4小時后，回收菌體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組副溶血弧菌外膜蛋白的制備方法，其特征在于所述g步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為0.22iim的過濾器過濾細菌裂解液，在4mlBindbuffer中加lml50X的Ni-NTAHisBind樹脂懸液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C，200rpm振蕩12h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0.5mlElutebuffer洗脫，收集洗脫液。全文摘要本發(fā)明公開一種重組副溶血弧菌外膜蛋白及制備方法，根據(jù)副溶血弧菌外膜蛋白的DNA序列，設(shè)計引物對并以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與pMD19T載體連接得重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中；通過IPTG誘導(dǎo)實現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達。因在表達過程中不產(chǎn)生包涵體，該表達質(zhì)粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，方便了樣品的鑒定和純化，避免了樣品的變性和復(fù)性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步研究副溶血弧菌外膜蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/70GK101698674SQ20091021966公開日2010年4月28日申請日期2009年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日發(fā)明者仇雪梅,劉洋,王秀利,袁野申請人:大連水產(chǎn)學(xué)院