專利名稱：血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽，尤其是一種以牡蠣為原料，無 毒副作用、安全性高、成本廉價、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑、制備方法及 其應用。
背景技術：
高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是引起 腦卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，嚴重威脅著人類的健康。血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶在 人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，對血壓調(diào)節(jié)起著重要的作用，它可 以將血管緊張素I轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，使周圍小動脈、血管平滑肌收縮，同時刺激醛固酮 分泌，促進人體腎臟對Na+、K+的重吸收，引起鈉儲量和血容量的增加，使血壓升高；還可以 使舒緩激肽失活，引起血壓升高，如果抑制了血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶的活性，就可以起到降壓 的作用?，F(xiàn)有的作為治療高血壓的合成物卡普托利就是血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶的抑制劑，但 由于它是由化學藥品合成，因此有很多副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種以牡蠣為原料，安 全性高、成本廉價、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑、制備方法及其應用。本發(fā)明的技術解決方案是一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其特征是氨基酸序 列為 Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe0一種上述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.將新鮮牡蠣去殼、除內(nèi)臟，留存的白色蠣肉、鰓和體液用勻漿機在-10°C到10°C 的低溫狀態(tài)下制成牡蠣漿液，提取牡蠣粗蛋白粉；b.將牡蠣粗蛋白粉進行酶解并經(jīng)過超濾膜過濾制得牡蠣粗蛋白酶解液；c.將牡蠣粗蛋白酶解液經(jīng)凝膠柱進行層析分離及RP-HPLC純化分離。所述a步驟的提取牡蠣粗蛋白粉是將牡蠣漿液加到等體積PBS溶液中充分攪拌， 于4°C條件下靜置6小時，5000 Xg離心25分鐘取上清液，向上清液中加入硫酸銨，使硫酸 銨最終濃度達到75%并在4°C條件下靜置6小時，5000Xg離心25分鐘，取沉淀；將沉淀與 水混溶，裝入MW 10000道爾頓的透析袋中流水透析M小時，再用去離子水透析M小時，然 后將內(nèi)容物真空冷凍干燥，得到牡蠣粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0. 2mol/L NaH2PO4和 0. 2mol/L Na2HPO4按體積比39 61混合的pH 7. 0溶液。所述b步驟是將牡蠣粗蛋白粉末溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸緩沖液中使蛋白濃 度為2.5%，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶與蛋白的質(zhì)量比為1 50，在37°C下酶解24小時；所 得酶解液加熱至100°C并保持10分鐘，用堿或者堿性鹽(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂， 碳酸鈉、碳酸鉀等)調(diào)節(jié)酶解液PH為中性，5000 X g、室溫離心25分鐘，經(jīng)MW 10000道爾頓超濾膜過濾，透過超濾膜的組分為牡蠣可溶蛋白酶解液。所述c步驟是取牡蠣可溶蛋白酶解液15ml經(jīng)kphadex LH-20柱進行層析分離， 進行層析分離，用30%的甲醇溶液洗脫，按管數(shù)收集，20分鐘/管，檢測波長為280nm，收集 具有血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑活性的組分，將所得組分在RP-HPLC上純化，具體條件是在 RP-HPLC上用Hypersil Cw柱，流動相A液為0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超聲脫氣； 流動相B液為0. 1 % TFA+100%乙腈的水溶液，檢測波長215nm，室溫，進樣體積20 μ 1，采 用梯度洗脫，按時間收集；洗脫梯度0 60min A液 100% 50%線性降低；B液0% 50%線性升高；60 80minA 液 0%;B 液 100%。上述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑在制備降低高血壓產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明是以牡蠣漿液為原料，通過對牡蠣漿液酶解所產(chǎn)生的牡蠣蛋白酶解液的進 一步分離、純化得到其氨基酸序列為VYPWTQRF的新肽，實驗證明是有效的血管緊張素I轉(zhuǎn) 換酶抑制劑，具有無毒副作用、安全性高、成本廉價、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的等優(yōu)點，可廣泛應用于 制備降低高血壓的藥品及保健品中。


圖1是本發(fā)明實施例中用kphadex LH-20柱進行層析分離，檢測波長為為^Onm 的譜圖。圖2是應用本發(fā)明實施例降血壓得效果示意圖。
具體實施例方式a.將新鮮牡蠣去殼，除內(nèi)臟，留存的白色蠣肉、鰓和體液用勻漿機在低溫狀態(tài)下切 碎制成牡蠣漿液。b.將牡蠣漿液加到等體積的PBS溶液(0. 2mol/L NaH2PO4和0. 2mo VLNa2HPO4按 體積比39 61混合，pH 7.0)中，充分攪拌，于4°C條件下，靜置6小時后，離心(5000Xg， 4°C ) 25分鐘取上清液；向上清夜中加入硫酸銨，使硫酸銨最終濃度達到75%，并在4°C條件 下，靜置6小時，離心(5000 X g，4°C ) 25分鐘取沉淀；將沉淀與少量水混溶，裝入透析袋(MW 10000道爾頓)流水透析M小時，再用去離子水透析M小時，然后將內(nèi)容物真空冷凍干燥， 得到牡蠣粗蛋白粉末，-20°C保存；c.將牡蠣可溶蛋白溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸緩沖液中(用lmol/L的HCl調(diào) PH 2.0)，蛋白濃度2.5%，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶與蛋白的質(zhì)量比為1 50，在37°C下 酶解M小時；將所得酶解液加熱至10(TC并保持10分鐘，使蛋白酶失活；之后用堿或者堿 性鹽(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂，碳酸鈉、碳酸鉀等)調(diào)節(jié)酶解液PH為中性，離心 (5000 X g，室溫)25分鐘，經(jīng)超濾膜(MW10000道爾頓)過濾，取透過超濾膜的組分即為牡蠣 可溶蛋白酶解液；d.由牡蠣可溶蛋白酶解液15mlLH-20柱進行層析分離，用30 %的 甲醇溶液洗脫，按管數(shù)收集，20分鐘/管，檢測波長^Onm，收集具有較強ACE抑制活性的 組分，即收集如圖1所示的10管 30管；將所收集具有較強ACE抑制活性的部分繼續(xù)在 RP-HPLC上分離純化，在RP-HPLC上用HypersilC18柱，流動相A液為0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超聲脫氣；流動相B液為0. 1% TFA+100%乙腈的水溶液，檢測波長215nm，室 溫，進樣體積20 μ 1，采用梯度洗脫，按時間收集洗脫梯度0 60min A液100% -50%線性降低；B液0% -50%線性升高60 80min A 液 0 % ;B 液 100 %。對所收集的組分用Edman降解(Edmandegradation)法檢測，是氨基酸序列為 VYPWTQRF的肽，此肽及肽的類似物的鹽類均可以用于制備降低高血壓的藥物、保健品等。實驗例1.靜脈注射動物實驗選擇20只平均收縮壓為195mmHg的自發(fā)性高血壓大白鼠為實驗模型，大白鼠飼養(yǎng) 一周后，將其分成2組，每一組10只，將本發(fā)明實施例的提取物每日按大白鼠體重5-20mg/ kg劑量進行靜脈注射，結(jié)果表明，1周后對照組大白鼠的血壓持續(xù)升高，而治療組自發(fā)性高 血壓大白鼠的血壓明顯下降，從平均收縮壓從195mmHg下降到162mmHg，說明此肽具有明顯 的降血壓效果。2.灌胃動物實驗選擇20只平均收縮壓為185mmHg的自發(fā)性高血壓大白鼠為實驗模型，大白鼠飼養(yǎng) 一周后，將其分組，將本發(fā)明實施例的提取物每日按大白鼠體重20-200mg/kg劑量進行灌 胃投入，如圖2所示，4周后對照組大白鼠的血壓持續(xù)升高，而治療組自發(fā)性高血壓大白鼠 的血壓明顯下降，從平均收縮壓從185mmHg下降到160mmHg，說明此肽具有明顯的降血壓效^ ο上述氨基酸序列為VYPWTQRF的肽類似物的鹽類可以用通常的方法生產(chǎn)。公認的 與酸反應產(chǎn)生的鹽類，比如說鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸等無機酸；蟻酸，乙酸，丙酸，甘氨膽酸， 蘋果酸，檸檬酸，酒石酸，琥珀酸等有機酸等形成的鹽類；公認的與金屬離子形成的鹽類，包 括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，銨鹽；以及氨基乙醇，三乙氨，二環(huán)乙氨等形成的胺類鹽等沒有特別的 限制。本發(fā)明實施例所提取的組分(肽)可用現(xiàn)有技術制成各種劑型，即由各種充填劑 形成的散劑，顆粒劑，片劑，膠囊，懸浮液，乳化液，噴劑，粉劑等，通過口腔攝取或者是注射 液的形式使用。本發(fā)明相關的ACE抑制劑，可經(jīng)口腔和非經(jīng)口腔投入使用。非經(jīng)口腔的投入方法 比如皮下和靜脈注射，肛腸投入等。注射液的制作可以任意選用生理鹽水，葡萄糖，安定劑， 防腐劑，懸浮劑，乳化劑等。本發(fā)明實施例所提取的組分(肽)可以添加到各種食品當中，作為抑制血壓保健 食品，食品的形態(tài)可以是清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，湯類，奶酪，火腿，點心等。本發(fā)明實施例所提取的組分(肽)無毒副作用，使用量是沒有特別的限制，具體的 要根據(jù)高血壓的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素適當?shù)卮_定。序列表<110>大連水產(chǎn)學院<120>血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑、制備方法及其應用<160>1
<170>PatentIn Version 3. 1<210>1<211 >8<212>蛋白質(zhì)或肽<213> 未知 <220><223>misc_feature<400>1VYPffTQRF 8
權利要求
1.一種血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其特征是氨基酸序列為Vel Tyr Pro TrpThr Gln Arg Phe0
2.一種如權利要求1所述血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，其特征在于按如下 步驟進行a.將新鮮牡蠣去殼、除內(nèi)臟，留存的白色蠣肉、鰓和體液用勻漿機在-10°C 10°C狀態(tài) 下制成牡蠣漿液，提取牡蠣粗蛋白粉；b.將牡蠣粗蛋白粉進行酶解并經(jīng)過超濾膜過濾制得牡蠣粗蛋白酶解液；c.將牡蠣粗蛋白酶解液經(jīng)凝膠柱進行層析分離及RP-HPLC純化分離。
3.根據(jù)權利要求2所述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，其特征在于所述a 步驟的提取牡蠣粗蛋白粉是將牡蠣漿液加到等體積PBS溶液中充分攪拌，于4°C條件下靜 置6小時，5000 Xg離心25分鐘取上清液，向上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨最終濃度達到 75%并在4°C條件下靜置6小時，5000 Xg離心25分鐘，取沉淀；將沉淀與水混溶，裝入麗 10000道爾頓的透析袋中流水透析M小時，再用去離子水透析M小時，然后將內(nèi)容物真空 冷凍干燥，得到牡蠣粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0. 2mol/L NaH2PO4和0. 2mol/L Na2HPO4 按體積比39 61混合的pH 7. 0溶液。
4.根據(jù)權利要求3所述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，其特征在于所述b 步驟是將牡蠣粗蛋白粉末溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸緩沖液中使蛋白濃度為2. 5%，加入 胃蛋白酶，胃蛋白酶與底物蛋白的質(zhì)量比為1 50，在37°C下酶解M小時；所得酶解液加 熱至100°C并保持10分鐘，用堿或者堿性鹽調(diào)節(jié)酶解液pH為中性，5000Xg、室溫離心25分 鐘，經(jīng)MW 10000道爾頓超濾膜過濾，透過超濾膜的組分為牡蠣可溶蛋白酶解液。
5.根據(jù)權利要求4所述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，其特征在于所述c 步驟是取牡蠣可溶蛋白酶解液15mlLH-20柱進行層析分離，用30%的甲醇溶 液洗脫，按管數(shù)收集，20分鐘/管，檢測波長為觀0·，收集具有血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑 活性的組分，將所得組分在RP-HPLC上純化，具體條件是在RP-HPLC上用Hypersil Cw柱，流 動相A液為0. 1% TFA+0%乙腈的水溶液，用前超聲脫氣；流動相B液為0. 1% TFA+100% 乙腈的水溶液，檢測波長215nm，室溫，進樣體積20 μ 1，采用梯度洗脫，按時間收集；洗脫梯 度0 60min A液 100% 50%線性降低；B液0% 50%線性升高；60 80minA 液 0%;B 液 100%。
6.一種如權利要求1所述的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑在制備降低高血壓產(chǎn)品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明是以牡蠣漿液為原料，通過對牡蠣漿液酶解所產(chǎn)生的牡蠣蛋白酶解液的進一步分離、純化得到其氨基酸序列為Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe的新肽，實驗證明是有效的血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制劑，具有無毒副作用、安全性高、成本廉價、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的等優(yōu)點，可廣泛應用于制備降低高血壓的藥品及保健品中。
文檔編號C12P21/06GK102093471SQ20091022075
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權日2009年12月15日
發(fā)明者曲敏, 李偉, 汪秋寬, 王剛, 胡建恩, 趙前程, 陳瑋, 馬馳宇, 黃曉娟 申請人:大連水產(chǎn)學院