專利名稱：一種4-磷酸赤鮮糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用分子生物學(xué)技術(shù)制備 4_磷酸赤鮮糖的方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化分解的一種方式是磷酸戊糖(ppp)代謝途徑。由于此途徑是由6-磷 酸葡萄糖(G-6-P)開始的，因此又被稱為己糖磷酸旁路。此途徑是在細(xì)胞的胞漿中進(jìn)行的， 整個(gè)代謝途徑經(jīng)過氧化階段和非氧化階段的一系列酶促反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生NADPH+礦，提供還 原力。具體的說，第一階段由G-6-P脫氫生成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯開始，然后水解生成6-磷 酸葡糖酸，再脫氫脫羧生成5-磷酸核酮糖；第二階段是5-磷酸核酮糖經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)酮反應(yīng) 及轉(zhuǎn)醛反應(yīng)，再經(jīng)過磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中間代謝物，最后生成3-磷酸甘油 醛及6-磷酸果糖，后二者與糖酵解相銜接，還可重新進(jìn)入糖酵解途徑而進(jìn)行代謝。4-磷酸赤鮮糖是生物體內(nèi)代謝的重要中間產(chǎn)物，赤鮮糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯 醇式丙酮酸(PEP)可以合成莽草酸，是合成芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的 前體物質(zhì)，也可合成與植物生長、抗病性有關(guān)的生長素、木質(zhì)素、綠原酸、咖啡酸等，植物在 感病或受傷情況下，該途徑明顯加強(qiáng)；同時(shí)還是合成維生素B6等一些藥物和活性中間體的 前體物質(zhì)。因此，4-磷酸赤鮮糖作為代謝的中間產(chǎn)物合成上述物質(zhì)對(duì)生物體來講具有重要 的生理作用。目前制備4-磷酸赤蘚糖的方法主要有1、過氧化氫氧化阿拉伯糖酸鈣制備；2、四 乙酸鉛氧化D-葡萄糖制備；3、高碘鹽酸氧化4，6-0_亞已基-D-葡萄糖制備。以上方法均 需要在高溫高壓條件下進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求高，產(chǎn)物成分復(fù)雜，并且得率低。因此，有必要提出一種新的4-磷酸赤鮮糖的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服目前合成4-磷酸赤鮮糖方法的缺點(diǎn)，利用分子生物學(xué)技術(shù)，制備 耐高溫、特異性轉(zhuǎn)化4-磷酸赤鮮糖的轉(zhuǎn)酮醇酶，通過固定化酶技術(shù)，以6-磷酸果糖和3-磷 酸甘油醛為原料高效制備4-磷酸赤鮮糖，方法簡(jiǎn)單實(shí)用。一種4-磷酸赤鮮糖的制備方法，在55_65°C下，固定化耐熱的轉(zhuǎn)酮醇酶，以6-磷酸 果糖和3-磷酸甘油醛為原料通過酶促反應(yīng)制備4-磷酸赤鮮糖。合成4-磷酸赤鮮糖的酶促反應(yīng)如下
轉(zhuǎn)酮醇酶
6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛:^ 4-磷酸赤鮮糖+5-磷酸木酮糖
55-65。C本發(fā)明的方法，其中所述固定化轉(zhuǎn)酮醇酶的方法優(yōu)選采用重組工程菌表達(dá)C_端 帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn)酮醇酶(6XHis-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白純化樹脂層析柱特異性吸附6XHis-TK，洗去雜蛋白，Ni-NTA蛋白純化樹脂層析柱保留TK，在有底物6-磷酸果 糖和3-磷酸甘油醛情況下，生成4-磷酸赤鮮糖。本發(fā)明的方法，其中所述轉(zhuǎn)酮醇酶能耐受55-65°C的溫度?？梢詠碓从谄ぱ捉M織 胞菜菌(Ajellomyces dermatitidis)、紫球硫菌(Thiosphaerion violaceum)、紅棲熱菌 (Thermus ruber)或白色嗜熱單抱菌(Thermomonospora alba)。本發(fā)明的方法，轉(zhuǎn)酮醇酶優(yōu)選來源于皮炎組織胞漿菌(Ajellomyces dermatitidis)，具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。利用多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增皮炎組 織胞漿菌的TK基因，然后把該基因片段插入到載體pET中，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化 E.coli JM109后制備TK。用于擴(kuò)增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。表達(dá)產(chǎn)物為C-端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的皮炎組織胞漿菌轉(zhuǎn)酮醇酶。上述技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、利用來源自皮炎組織胞漿菌等的轉(zhuǎn)酮醇酶能夠耐受高溫，特異性生成4-磷酸 赤鮮糖的特性，通過基因克隆，發(fā)酵表達(dá)，并結(jié)合M-NTA蛋白純化樹脂純化帶有6個(gè)組氨酸 標(biāo)簽的轉(zhuǎn)酮醇酶，同時(shí)制備耐高溫的固定化酶裝置，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛為原料 高效制備4-磷酸赤鮮糖。2、利用帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn)酮醇酶能與M-NTA蛋白純化樹脂層析柱特異性 結(jié)合的原理，再用含有低濃度的咪唑洗去雜蛋白，保留在Ni-NTA層析柱上的6XHis-TK，從 而簡(jiǎn)化6 X His-TK分離純化步驟。3、反應(yīng)不需在高溫高壓條件下進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求不高，產(chǎn)物得率高。本發(fā)明提 供的4-磷酸赤鮮糖制備方法，利用分子生物學(xué)技術(shù)，制備耐受55-65°C高溫的轉(zhuǎn)酮醇酶，在 此溫度條件下目標(biāo)產(chǎn)物4-磷酸赤鮮糖得率高(4-磷酸赤鮮糖分子比占反應(yīng)四種混合物的 37%)；酶的反應(yīng)體系不易染菌；同時(shí)固定化酶層析柱中殘留的，干擾制目的產(chǎn)物的酶類失 活，最大程度地減少其它雜酶的干擾，更大程度地得到目標(biāo)產(chǎn)物4-磷酸赤鮮糖。


圖1為皮炎組織胞漿菌轉(zhuǎn)酮醇酶基因的PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為表達(dá)載體pET_22b (+) -tktA的BamHI和XhoI雙酶切驗(yàn)證圖；圖3為純化的皮炎組織漿菌轉(zhuǎn)酮醇酶的SDS-PAGE電泳圖；圖4為4-磷酸赤鮮糖的液相色譜(HPLC)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)酮醇酶基因來源于皮炎組織胞漿菌，但也包括含有耐熱轉(zhuǎn)酮醇酶 的其它微生物，如紫球硫菌(Thiosphaerion violaceum)、紅棲熱菌(Thermus ruber)、白色
(Thermomonospora alba) ·。實(shí)施例1皮炎組織胞漿菌(ATCC 18188)轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tktA)的克隆以0. 5μ g皮炎組織胞漿菌基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，按轉(zhuǎn)酮醇酶的序列(如SEQID NO. 1 所示)設(shè)計(jì)正向引物 tktA-F 為 5 ‘ -TTCGGGATCCTACCCCTCGATGTGACTGCA-3 ‘，反向 弓丨物tktA-R為5 ‘ -TTGCCTCGAGAATCTACTAAACGACCTTCCGC-3 ‘，其中斜體字母部分分別為 酶切位點(diǎn)BamHI和Xhol。3'引物的設(shè)計(jì)確保表達(dá)產(chǎn)物含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。PCR反應(yīng)在 50 uL總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94°C變性5min后開始循環(huán)，然后94°C變性50s，56°C退 火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。取5 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊 脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(圖1)。取100y L PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步 驟回收目的片段。實(shí)施例2 tktA表達(dá)載體的構(gòu)建及在E. coli JM109中的表達(dá)1. tktA基因的構(gòu)建凝膠回收實(shí)施例1中的PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物和 pET-22b(+)載體分別用BamH I和Xhol雙酶切，并通過凝膠回收試劑盒回收，然后進(jìn)行連接 (16°C，16h)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒后用BamHI和Xhol 進(jìn)行酶切驗(yàn)證分析(圖2)，驗(yàn)證正確后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。構(gòu)建pET-22b (+) -tktA表達(dá)載 體。2. tktA基因的表達(dá)以測(cè)序驗(yàn)證的pET_22b (+) -tktA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性克隆，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)0D_ 至0. 6 0. 8時(shí)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導(dǎo)3h。接種上述轉(zhuǎn)化后的大腸桿 菌JM109于1000mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌體生長的0D■值為2. 0時(shí)，誘導(dǎo)方法同上。通過 誘導(dǎo)，使tktA基因在大腸桿菌JM109得到表達(dá)。實(shí)施例3 TK的分離純化及酶活檢測(cè)1.皮炎組織胞漿菌轉(zhuǎn)酮醇酶的純化將實(shí)施例2中發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體， 以50mmol/L、pH 8. OTris-HCl (含lmmol/L)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為 lg 5mL)，在冰浴中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清。NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的 去離子水洗滌，加NiS04溶液至NTA介質(zhì)使結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液 (20mM Tris-HCl pH7.9，0. 5M NaCl)洗柱。將上述得到的上清加入到Ni2+_NTA樹脂柱中，反 復(fù)加入3 5次后，用5倍柱體積的NAT-2緩沖液(NAT-0緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗 滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L的上述緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn) 酮醇酶，并做SDS-PAGE分析(圖3)。2.轉(zhuǎn)酮醇酶的酶活分析為取一定量的純化酶加入反應(yīng)體系中檢測(cè)酶的活性。酶 反應(yīng)時(shí)間從加入轉(zhuǎn)酮醇酶液時(shí)開始，在340nm波長下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定三磷酸甘油脫 氫酶氧化NADH的速率。每個(gè)反應(yīng)測(cè)三次。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中，酶活力單位(U)定義在 分析條件下每分鐘氧化1 P mol NADH所需要的酶量。lmL酶促反應(yīng)體系中含有50mmol/L Tris(pH 7. 4) ,50mmol/L MgCl2, 2mmol/L 6-磷酸果糖，2mmol/L 3-磷酸甘油酸，0. ImM焦磷 酸硫胺素，2U磷酸丙糖異構(gòu)酶(X型)和2U三磷酸甘油脫氫酶。實(shí)施例4 Ni2+-NTA樹脂柱制備4_磷酸赤鮮糖及檢測(cè)1.制備按實(shí)施例3的方法，使帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn)酮醇酶保留在Ni2+_NTA 樹脂柱中。將含有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛的體系(組份50mmol/L Tris(pH 7.4)， 50mmol/L MgCl2，1 % 6-磷酸果糖，1 % 3-磷酸甘油醛)在37°C水浴鍋中保溫，以20mL/h的 速度流經(jīng)螯合有His-tag-TK的Ni2+-NTA樹脂柱。得到含有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、 4-磷酸赤鮮糖和5-磷酸木酮糖的反應(yīng)體系。利用高效液相色譜分離法，并結(jié)合4-磷酸赤鮮糖標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜上出峰的時(shí)間得到有效分離為標(biāo)準(zhǔn)，分離出目的產(chǎn)物4-磷酸 赤鮮糖。2.檢測(cè)采用高效液相色譜法檢測(cè)4-磷酸赤鮮糖。檢測(cè)用的色譜儀為Agilent 1200 HPLC (Agilent 1200色譜工作站)，離子交換色譜柱為87H3，色譜柱溫為60°C，檢測(cè)器 為示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相是4mmol/L的H2S04，流速0. 6mL/min,進(jìn)樣量為25 u L。結(jié)果如 圖4。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種4-磷酸赤鮮糖的制備方法，其特征在于，在55-65℃下，固定化耐熱的轉(zhuǎn)酮醇酶，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛為原料通過酶促反應(yīng)制備4-磷酸赤鮮糖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化轉(zhuǎn)酮醇酶的方法是采用重組工 程菌表達(dá)C-端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn)酮醇酶(6 X His-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白純化樹 脂層析柱特異性吸附6XHis-TK，洗去雜蛋白，Ni-NTA蛋白純化樹脂層析柱保留TK，在有底 物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛情況下，生成4-磷酸赤鮮糖。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)酮醇酶能耐受55-65°C的溫度。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)酮醇酶來源于皮炎組織胞漿菌 (Ajellomyces dermatitidis)、紫球硫菌(Thiosphaerion violaceum)、紅棲熱菌(Thermus ruber)(Thermomonospora alba)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)酮醇酶來源于皮炎組織胞漿菌 (Ajellomyces dermatitidis)，具有如 SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增皮炎組織胞漿菌的 TK基因，然后把該基因片段插入到載體pET中，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 后制備TK。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用于擴(kuò)增TK基因的正向引物和反向引物如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，表達(dá)產(chǎn)物為C-端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的皮 炎組織胞漿菌轉(zhuǎn)酮醇酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種4-磷酸赤鮮糖的制備方法，在55-65℃下，固定化耐熱的轉(zhuǎn)酮醇酶，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛為原料通過酶促反應(yīng)制備4-磷酸赤鮮糖。本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)，制備耐高溫、特異性轉(zhuǎn)化4-磷酸赤鮮糖的轉(zhuǎn)酮醇酶，通過固定化酶技術(shù)，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛為原料高效制備4-磷酸赤鮮糖，方法簡(jiǎn)單實(shí)用。
文檔編號(hào)C12P19/02GK101875951SQ20091022356
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者尚海濤, 徐斌, 李榮杰, 段緒果, 胡長浩, 薛亮, 薛培儉 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司