專利名稱：一種7-磷酸景天庚酮糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用分子生物學(xué)技術(shù)制備 7_磷酸景天庚酮糖的方法。
背景技術(shù)：
磷酸戊糖途徑是葡萄糖氧化分解的一種方式。由于此途徑是由6-磷酸葡萄糖開 始，故亦稱為己糖磷酸旁路。此途徑在胞漿中進行，可分為兩個階段。第一階段由G-6-P脫 氫生成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯開始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再氧化脫羧生成5-磷酸核 酮糖。NADP+是所有上述氧化反應(yīng)中的電子受體。第二階段是5-磷酸核酮糖經(jīng)過一系列轉(zhuǎn) 酮基及轉(zhuǎn)醛基反應(yīng)，經(jīng)過磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中間代謝物最后生成3-磷酸甘 油醛及6-磷酸果糖，后二者還可重新進入糖酵解途徑而進行代謝。在生物體內(nèi)磷酸戊糖途徑除提供能量外，主要是為合成代謝提供多種原料。如為 脂肪酸、膽固醇的生物合成提供NADPH ；為核苷酸輔酶、核苷酸的合成提供5-磷酸核糖；為 芳香族氨基酸合成提供4-磷酸赤蘚糖。此途徑生成的四碳、五碳、七碳化合物及轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn) 醛酶等，與光合作用也有關(guān)系。因此磷酸戊糖途徑是一條重要的多功能代謝途徑。7-磷酸景天庚酮糖是磷酸戊糖代謝的中間產(chǎn)物，也是研究代謝途徑中的重要轉(zhuǎn)化 酶_轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶的底物，還是合成一些藥物和活性中間體的前體物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用耐熱轉(zhuǎn)酮酶在70°C下具有最大酶活的特性，采用耐高溫的固 定化酶裝置利用該酶催化合成7-磷酸景天庚酮糖。一種7-磷酸景天庚酮糖的制備方法，在70°C下，固定化耐熱轉(zhuǎn)酮酶，以5-磷酸木 酮糖和5-磷酸核糖為原料通過酶促反應(yīng)制備7-磷酸景天庚酮糖。本發(fā)明的方法，其中所述固定化耐熱轉(zhuǎn)酮酶的方法優(yōu)選采用重組工程菌表達 C-端帶有6個組氨酸標簽的耐熱轉(zhuǎn)酮酶(6 X His-ΤΚ)，然后使用Ni-NTA蛋白純化樹脂層析 柱特異性吸附6 X His-TK，洗去雜蛋白，M-NTA蛋白純化樹脂層析柱保留TK，在有底物5-磷 酸木酮糖和5-磷酸核糖情況下，生成7-磷酸景天庚酮糖。本發(fā)明的方法，其中所述耐熱轉(zhuǎn)酮酶在70°C下有最大的酶活?？梢詠碓从谀蜔?解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌 (Salmonella)或酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。本發(fā)明的方法，其中所述耐熱轉(zhuǎn)酮酶優(yōu)選來源于耐熱解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)，具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。利用多聚酶鏈反應(yīng)擴增耐熱解 纖維梭菌的轉(zhuǎn)酮酶(TK)基因，然后把該基因片段插入到表達載體pET中，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21，并表達TK。用于擴增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID N0. 3和 SEQ ID N0. 4所示。表達產(chǎn)物為C-端帶有6個組氨酸標簽的耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶。上述技術(shù)方案具有以下優(yōu)點
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1、利用蛋白質(zhì)親和色譜技術(shù)，利用帶有6個組氨酸標簽的耐熱轉(zhuǎn)酮酶能與蛋白 純化樹脂M-NTA層析柱特異性結(jié)合的原理，再用含有低濃度的咪唑洗去雜蛋白，保留在 Ni-NTA層析柱上的6 XHis-TK，從而簡化6 XHis-TK分離純化步驟。2、帶有6個組氨酸標簽的耐熱轉(zhuǎn)酮酶與蛋白純化樹脂M-NTA層析柱特異性結(jié)合， 在洗去雜蛋白后，M-NTA層析柱保留特異性成分-耐熱轉(zhuǎn)酮酶(TK)，在有合適濃度的底物 5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖情況下，高效合成7-磷酸景天庚酮糖。3、本發(fā)明涉及的酶能夠耐受70°C高溫，在此條件下酶的反應(yīng)體系不易染菌；并且 在此條件下目標產(chǎn)物7-磷酸景天庚酮糖得率高。在此溫度條件下，固定化酶層析柱中殘留 的大腸桿菌其它的酶失活，最大程度地減少其它酶的干擾，更容易得到并純化目標產(chǎn)物。


圖1為耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶基因的PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為表達載體pET_28b (+) -tktA的EcoR I單酶切驗證圖；圖3為純化的耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶的SDS-PAGE電泳圖；圖4為7-磷酸景天庚酮糖的液相色譜(HPLC)圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)酮酶基因來源于耐熱解纖維梭菌 (Clostridiumcellulolyticum)，但也包括含有耐熱轉(zhuǎn)酮酶的其它微生物，如枯草桿菌 (Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)寸。實施例1耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶基因(tktA)的獲得Wlyg耐熱解纖維梭菌(C. cellulolyticum)基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，按轉(zhuǎn) 酮酶基因的序列(如SEQ ID NO. 1所示)設(shè)計正向引物tktA-F為5' -TTTCCATGGGCATGAG CATGATAGACACAGC-3 ‘，反向引物 tktA-R 為 5 ‘ -TTTCTCGAGGTACTTAGCCAAAACAGCC-3 ‘，其 中斜體字母部分分別為酶切位點NcoI和Xhol，為保證讀碼框正確，我們額外地在正向引物 5'端加了兩個堿基，同時下游引物序列中的終止密碼子變了一個堿基，被換為表達酪氨酸 的密碼子。PCR反應(yīng)在50 μ L總體積中進行，反應(yīng)條件為在94°C變性5min后開始循環(huán)，然 后94°C變性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。取 3 μ L PCR擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖1)。取100 μ L PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳， 按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。實施例2表達載體pET_28b (+) -tktA的構(gòu)建凝膠回收實施例1中的PCR產(chǎn)物和pET_28b⑴載體分別用NcoI和XhoI雙酶切， 并通過凝膠回收試劑盒回收，然后進行連接(16°C，16h)，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞，挑選陽性 克隆，提取質(zhì)粒后用EcoR I進行單酶切驗證分析(圖2)，驗證正確后進行DNA測序鑒定。 構(gòu)建的表達質(zhì)粒被稱為pET-28b (+) -tktA。
實施例3 tktA在E. coli BL21 (DE3)中的表達及TK的純化與鑒定1. tktA基因的表達以測序驗證正確的pET_28b (+) -tlrtA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞；挑 取陽性克隆，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至約為0. 6-0. 8時，加入終濃 度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導(dǎo)3h。接種上述轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21于1000ml LB培養(yǎng)基， 待OD6tltl值約達2.0時，誘導(dǎo)與上述相同。離心收集菌體，以50mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl (含 lmmol/L)緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為Ig濕菌體5ml緩沖液)，在冰浴中以超 聲波破碎菌體，離心后收集上清。2.耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶(TK)的純化與鑒定NTA介質(zhì)填柱用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiSO4溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合 度達到飽和，用5倍柱體積的NAT-O緩沖液(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl)洗柱。將 上述收集破碎菌體離心后得到的上清加入到Ni2+-NTA樹脂柱中，反復(fù)加入2 3次后，用5 倍柱體積的NAT-I緩沖液(ΝΑΤ-0緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最 后用含有300mmol/L上述緩沖液洗脫帶有6個組氨酸標簽的耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶，并做 SDS-PAGE 分析(圖 3)。實施例4耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶的酶活檢測耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶的酶活分析液為1ml反應(yīng)體系中含有50mmol/L Tris (pH 7. 4),50mmol/L MgCl2, 2mmol/L 5-磷酸核糖，2mmol/L 5-磷酸木酮糖，0. ImM 焦磷酸硫胺 素，2U磷酸丙糖異構(gòu)酶(X型)和2U三磷酸甘油脫氫酶。酶反應(yīng)時間從加入轉(zhuǎn)酮酶液時開 始，在340nm波長下用紫外分光光度計測定三磷酸甘油脫氫酶氧化NADH的速率。在標準反 應(yīng)混合物中，酶活力單位(U)定義為在分析條件下每分鐘氧化lymol NADH所需要的酶 量。實施例5 Ni2+-NTA樹脂柱合成7_磷酸景天庚酮糖及其分離按實施例3的方法，上述收集破碎菌體離心后得到的上清上樣到Ni2+-NTA樹脂柱 中，反復(fù)加入2 3次后，用5倍柱體積的NAT-I緩沖液(ΝΑΤ-0緩沖液含有80mmol/L咪 唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，在實施例3中已證明在洗去雜蛋白后，在M2+-NTA樹脂柱中保 留帶有6個組氨酸標簽的耐熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶。將含有5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖的體系(組份50mmol/LTriS(pH 7.4)， 50mmol/L MgCl2,1 % 5-磷酸木酮糖，1 % 5-磷酸核糖)在37°C水浴鍋中保溫，以20mL/h的 速度流經(jīng)螯合有His-tag-TK的Ni2+-NTA樹脂柱。得到含有5-磷酸木酮糖，5-磷酸核糖， 和7-磷酸景天庚酮糖和3-磷酸甘油醛的反應(yīng)體系，其中7-磷酸景天庚酮糖分子比占反應(yīng) 四種混合物的35%。利用高效液相色譜(離子交換柱)分離法，并結(jié)合7-磷酸景天庚酮糖 標準品在上述高效液相色譜的分離方法和出峰時間得到有效分離。分離出的7-磷酸景天 庚酮糖液體經(jīng)濃縮，得到7-磷酸景天庚酮糖晶體產(chǎn)物。實施例6 7-磷酸景天庚酮糖的檢測采用高效液相色譜法檢測7-磷酸景天庚酮糖。檢測用的色譜儀為Agilent 1200HPLC (Agilent 1200色譜工作站)，離子交換色譜柱為87H3，柱溫60°C，檢測器為示差 折光檢測器，流動相是5mmol/L的H2SO4,流速0. 5ml/min,進樣量為20 μ L。檢測結(jié)果如圖4。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種7 磷酸景天庚酮糖的制備方法，其特征在于，在70℃下，固定化耐熱轉(zhuǎn)酮酶，以5 磷酸木酮糖和5 磷酸核糖為原料通過酶促反應(yīng)制備7 磷酸景天庚酮糖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化耐熱轉(zhuǎn)酮酶的方法是采用重組 工程菌表達C-端帶有6個組氨酸標簽的耐熱轉(zhuǎn)酮酶(6 X His-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白純 化樹脂層析柱特異性吸附6XHis-TK，洗去雜蛋白，Ni-NTA蛋白純化樹脂層析柱保留TK，在 有底物5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖情況下，生成7-磷酸景天庚酮糖。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述耐熱轉(zhuǎn)酮酶在70°C下有最大的酶活。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述耐熱轉(zhuǎn)酮酶來源于耐熱解纖維梭菌 (Clostridium cellulolyticum)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、沙門氏菌(Salmonella) 或酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述耐熱轉(zhuǎn)酮酶來源于耐熱解纖維梭菌 (Clostridium cellulolyticum)，具有如 SEQ IDN0. 2 所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用多聚酶鏈反應(yīng)擴增耐熱解纖維梭菌的 轉(zhuǎn)酮酶(TK)基因，然后把該基因片段插入到表達載體pET中，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，并表達TK。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用于擴增TK基因的正向引物和反向引物如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，表達產(chǎn)物為C-端帶有6個組氨酸標簽的耐 熱解纖維梭菌轉(zhuǎn)酮酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種7-磷酸景天庚酮糖的制備方法，在70℃下，固定化耐熱轉(zhuǎn)酮酶，以5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖為原料通過酶促反應(yīng)制備7-磷酸景天庚酮糖。本發(fā)明涉及的酶能夠耐受70℃高溫，在此條件下酶的反應(yīng)體系不易染菌；并且在此條件下目標產(chǎn)物7-磷酸景天庚酮糖得率高。在此溫度條件下，固定化酶層析柱中殘留的大腸桿菌其它的酶失活，最大程度地減少其它酶的干擾，更容易得到并純化目標產(chǎn)物。
文檔編號C12P19/02GK101942489SQ200910223568
公開日2011年1月12日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者尚海濤, 徐斌, 李榮杰, 段緒果, 胡長浩, 薛亮, 薛培儉 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司