專利名稱：：植物花色素苷形成關(guān)鍵基因查爾酮合成酶啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與植物花色素苷形成相關(guān)酶編碼基因啟動(dòng)子與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：觀賞海棠(OrnamentalCrabapples)是薔薇科(Rosales)蘋果屬(MalusMill.)植物。其葉花果色型多樣、色彩艷麗、冬果宿存(部分品種)、樹形緊湊、抗逆性強(qiáng)，是果樹植物中兼具觀賞價(jià)值和經(jīng)作價(jià)值的重要資源。觀賞海棠葉色有紫、紅、綠之分；花色有紫、紅、粉、白之別；果色有紫、紅、黃、綠之不同。這些性狀特征不僅為城鄉(xiāng)園林綠化提供了豐富的植物景觀資源；而且為探索植物成色機(jī)理提供了良好的研究素材。在觀賞海棠品種中，一些綠色葉類品種中，如"火焰"，隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程果皮色澤由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色；一些新葉有色類品種中，如"草莓果凍"，生長(zhǎng)期內(nèi)嫩葉為紫紅色，成熟葉逐漸轉(zhuǎn)為綠色，隨果實(shí)發(fā)育果皮色澤保持綠色，臨近成熟迅速轉(zhuǎn)黃微帶紅暈；尤其是個(gè)別常色紫葉類品種中，如"王族"果實(shí)坐果后果皮即為紫紅色(胎紅果)，并一直持續(xù)至果實(shí)成熟；這一現(xiàn)象在柱形蘋果、胎里紅蘋果(陜西關(guān)中)、胎里紅棗等果樹植物中也有類似的表現(xiàn)。研究這一現(xiàn)象對(duì)于了解果實(shí)色澤發(fā)育的實(shí)質(zhì)是十分重要的?；ㄉ帐侵参锷珴尚纬蛇^程中最重要的組分之一(Lee，2002)。植物體內(nèi)花色苷的形成與積累不僅制約著植物器官和組織的紅色發(fā)育，而且影響著其它色澤的形成，因而使植物器官組織呈現(xiàn)出多樣性的色彩變化(Jos印h，1998;Gillianeta1，2001)。對(duì)于特定的品種來說，花色苷形成和積累的數(shù)量以及時(shí)空變化決定著植物器官和組織紅色開始形成的時(shí)間及紅色的深淺(Awadeta1，2000)。近年來的研究表明，花色苷生物合成途徑中主要包括查爾酮合成酶基因(Chalconesythase，CHS)、黃烷酮3_羥化酶基因(flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮醇4_還原酶基因(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)禾口花色素合成酶基因(anthocyanidinsynthase,ANS)等結(jié)構(gòu)基因，以及那些可以直接參與花色素苷形成的其它酶的基因(祝欽攏，2006)。其中，查爾酮合成酶基因(CHS)是類黃酮和花色素苷次生代謝途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶(孟繁靜，2000)，它催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成查爾酮(Holtonetal.，1995)。查爾酮分子的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色苷的合成，從而使植物花朵、葉片和果實(shí)色澤發(fā)生變化(Lietal.，2005)。圍繞著花色苷生物合成這一研究熱點(diǎn)，許多研究者在一年生和多年生草本植物如苜蓿(Ferreretal.，1999)、矮牽牛(Koesetal.，1989)、歐片(Herrmannetal.，1988)等植物中，對(duì)CHS進(jìn)行克隆、功能分析和遺傳轉(zhuǎn)化研究，初步明確了CHS在植物花色苷代謝中的重要作用，證明了CHS基因表達(dá)的時(shí)空差異影響著一年生和多年生草本植物葉色、花色和果色的著色早晚和色澤的深淺(RichardVetal.，2006)。目的基因表達(dá)的時(shí)空性、組織特異性及強(qiáng)度在一定程度上受啟動(dòng)子的調(diào)控(張曉軍，2006)。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別并與之結(jié)合、從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因的上游，其包含的CAATbox和TATAbox兩個(gè)功能元件分別依賴DNA的RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。在啟動(dòng)子的5'端遠(yuǎn)上游區(qū)，不僅包含增強(qiáng)或阻遏基因表達(dá)的序列(enhancer和dehancer);同時(shí)具有對(duì)激素、外界脅迫等內(nèi)外環(huán)境條件進(jìn)行應(yīng)答的元件(Cis-actingelements,順式作用元件)，啟動(dòng)子的這些序列特征決定了目的基因在特定時(shí)空條件下的表達(dá)。自1990年IngridM等在矮牽牛中首次研究chsA啟動(dòng)子的表達(dá)特性后，植物CHS基因的啟動(dòng)子即成為與植物色澤發(fā)育和基因特異性表達(dá)研究的熱點(diǎn)。研究者相繼分離和鑒定了許多一年生和多年生草本植物中的CHS啟動(dòng)子，如矮牽牛(IngridMetal，1990;夏江東等，2006)、擬南芥(陶妹英等，2006)、大豆(Faktoretal，1996)、煙草、康乃馨(張樹珍等，2002)、碧冬茄(洪亞輝等，2003)、百合(常小麗，2007)，并對(duì)其表達(dá)功能進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)不同植物種類CHS啟動(dòng)子序列均含有大量的功能性元件。如擬南芥的CHS啟動(dòng)子序列中，不僅包含增強(qiáng)或阻遏基因表達(dá)的序列，還包括多個(gè)MRE、ACE、A-Box、G-Box、GT+bindingsite等元件(KochMA，etal，2001;TrezziniGF，etal，1993;HartmannU，etal，199S)。再如矮牽牛chsA啟動(dòng)子序列中，靠近5'端的僅67bp的片段就可以在花瓣中特異性表達(dá)，隨著5'端啟動(dòng)子的加長(zhǎng)(220bp、530bpMchsA基因的表達(dá)水平逐漸提高(IngridMetal，1990)。進(jìn)一步研究證明在矮牽牛CHS-A啟動(dòng)子(Pchsa)序列中不僅含有TATAbox,CAAT-box，GC-box，G-box(保守序列)等元件，還含有花期特異表達(dá)的啟動(dòng)序列TACPyAT'-box(夏江東等，2006)。在不斷的深入研究中，研究者發(fā)現(xiàn)植物CHSA啟動(dòng)子序列中的核心元件具有組織、器官的特異性表達(dá)功能。1996年，F(xiàn)aktor等對(duì)豆科植物的CHSA啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)活性進(jìn)行研究，GUS活性分析表明，花中和根尖有較高的表達(dá)，而且在花中的表達(dá)主要是限定在花瓣的色素部分，且CHS15基因的啟動(dòng)子序列，CHS15-GUS融合表達(dá)顯示該啟動(dòng)子與大豆CHS啟動(dòng)子具有相似的組織特異表達(dá)模式。洪亞輝等報(bào)道碧冬茄CHSA啟動(dòng)子含有TATAbox,CCAATbox,Antherbox,G-box，TACPyATbox,，boxl，box2和C即site等核心元件，其具有花器官特異表達(dá)特性(洪亞輝等，2003)。陶妹英在擬南芥中克隆了531bp的CHS啟動(dòng)子全長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有四個(gè)花特異表達(dá)的調(diào)控元件G-box(CACGTG)、Q-element(AGTCA)、pollen-box(AAATGA、TGATTT)。GUS基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在花瓣中有較強(qiáng)的表達(dá)特性，在莖中微量表達(dá)，而在葉和根中沒有表達(dá)，初步認(rèn)為PCHS啟動(dòng)子是花特異表達(dá)啟動(dòng)子(陶妹英等，2006)。在對(duì)模式植物擬南芥CHS啟動(dòng)子的研究中表明，CHS啟動(dòng)子序列既存在高度保守性，也存在品種間的差異性。Koch等在對(duì)22個(gè)十字花科植物種CHS啟動(dòng)子序列比較中發(fā)現(xiàn)，有多個(gè)高度保守功能元件，包括MRE、ACE、A-Box、G-Box、GT-l-bindingsite。這些保守元件對(duì)于CHS基因的表達(dá)是非常重要的(Kochetal.，2001)。Meaux等對(duì)擬南芥CHS啟動(dòng)子的進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，不同品種的擬南芥CHS啟動(dòng)子序列存在廣泛的多態(tài)性，認(rèn)為這是在進(jìn)化過程中CHS基因?qū)Νh(huán)境適應(yīng)的一種體現(xiàn)(Julietteetal.，2001)。2007年常小麗對(duì)不同品種百合的CHS啟動(dòng)子序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)某些品種的百合CHS啟動(dòng)子出現(xiàn)部分序列缺失，但這段缺失序列不存在典型的調(diào)控元件，并未影響啟動(dòng)子的功能(常小麗，2007)。主要參考文獻(xiàn)1LeeDavidW…AnthocyaninsinLeaves-Distribution,PhylogenyandDevelopment.AdvancesinBotanicalResearch，2002，37:37-53.2JosephM.，ErichG.，RonaldK..Howgenespaintflowersandseeds.TrendsPlantScience,1998，(3):212—218.3GillianA.，ContributionsofJeffreyHarborneandco_workerstothestudyofanthocyanins.Phytochemistry，2001，56:229-236.4祝欽攏.彩葉草葉色形成相關(guān)的花色素苷生物合成途徑的分子調(diào)控研究.2006，西南大學(xué)博士學(xué)位論文.5孟繁靜.植物花發(fā)育的分子生物學(xué).中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，225-256.6HoltonT.A.，CornishE.C.，Geneticsandbiochemistryofanthocyaninbiosynthesis.PlantCell,1995，(7):1071-1083.7LiS.J.，DengX.M.，MaoH.Z.，HongY..EnhancedanthocyaninsynthesisinfoliageplantCaladiumbiocolor.PlantCellR印ort，2005，23:716-720.8FerrerJ.L.，JezJ.M.，BowmanM.E.，DixonR.A.，NoelJ.P..Structureofchalconesynthaseandthemolecularbasisofplantpolyketidebiosynthesis.NatureSt潔turalandMolecularBiology,1999，6(8):775_784.9KoseR.E.，SpeltC.E，VandenE.，LzenP.J.M.，MolJ.N..CloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofPetuniahybrida.Gene，1989，81:245-257.10HerrmannA.，SchulzW.，HahlbrockK..Twoallelesofthesingle-copychalconesynthasegeneinpa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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供兩種與植物花色素苷形成相關(guān)編碼基因的啟動(dòng)子'本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關(guān)基因的啟動(dòng)子，名稱為McCHSpromoter,來源于蘋果屬觀賞海棠品種'王族'(MalusCrab即ple'Royalty')和'火焰，(MalusCrab即ple'Flame')，本發(fā)明的保護(hù)范圍為1)由序列表中序列l(wèi)和序列2所示的啟動(dòng)子序列，蘋果屬觀賞海棠品種'王族'(MalusCrab即ple'Royalty')為5，末端上游1-2497位堿基，'火焰'(MalusCraba卯le'Flame')為5，末端上游1-1723位堿基;2)將序列表中序列1和序列2的啟動(dòng)子序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸堿基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷代謝相關(guān)的啟動(dòng)子序列；3)與1)的啟動(dòng)子具有95%以上的同源性，且調(diào)控上述與植物花色素苷形成相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列4)與l)的啟動(dòng)子具有95%以上的同源性，為蘋果屬觀賞海棠'王族'(MalusCrab即ple'Royalty')和'火焰，(MalusCrab即ple'Flame')CHS啟動(dòng)子內(nèi)部的序列；5)序列1與序列2相比較，序列2中間缺失的743bp序列(序列3);6)擴(kuò)增上述CHS基因全長(zhǎng)或任一片段的引物具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測(cè)序工作均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。限制性內(nèi)切酶EcoR1、HindlII和Taq酶，T4DNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司，pMD19-TVector購自寶生物工程公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、CTAB、DL2000plusDNAMarker、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司?！NA提取以蘋果屬觀賞海棠'王族'(MalusCrab即ple'Royalty')和'火焰'(MalusCrab即ple'Flame')(北京農(nóng)學(xué)院海棠種質(zhì)資源圃)為實(shí)驗(yàn)材料，采用CTAB法提取其葉的DNA，將提取得到的基因組DNA用50iU的TE溶解，電泳檢測(cè)。經(jīng)電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看到DNA條帶，且無雜質(zhì)污染。結(jié)果表明，提取得到的DNA是完整的，染色結(jié)果顯示，提取得到的基因組DNA可以用來進(jìn)行啟動(dòng)子擴(kuò)增，結(jié)果如圖l所示。二、McCHS啟動(dòng)子序列的獲得啟動(dòng)子擴(kuò)增采用hi-TAILPCR方法，啟動(dòng)子擴(kuò)增步驟、PCR反應(yīng)體系和引物序列見表1、表2和表3:根據(jù)已經(jīng)克隆得到的蘋果屬觀賞海棠CHS基因設(shè)計(jì)引物CHS1(序列表中序列四)，CHS2(序列表中序列五)，CHS3(序列表中序列六)為特定引物進(jìn)行啟動(dòng)子擴(kuò)增表1PCR反應(yīng)程序Tab.1TheprogramofPCRreaction<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2PCR反應(yīng)體系Tab.2ThesystemofPCRreaction<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3、PCR反應(yīng)引物序列Tab.3TheprimersequenceofPCRreaction<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，蘋果屬觀賞海棠品種'王族'CHS基因啟動(dòng)子第一輪和第二輪PCR反應(yīng)結(jié)果如圖2和圖3所示，蘋果屬觀賞海棠品種'火焰'CHS基因啟動(dòng)子第一輪和第二輪PCR反應(yīng)結(jié)果如圖4和圖5所示。將兩個(gè)品種第二輪PCR反應(yīng)泳道2的產(chǎn)物回收，純化回收后按照pMD19-TVector(寶生物工程公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上。對(duì)擴(kuò)增得到的McCHS基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，獲得2467bp'王族'CHS基因啟動(dòng)子，1723bp'火焰'CHS基因啟動(dòng)子。序列表序列一DNA蘋果屬觀賞海棠Sk種'王族'CHS基因啟動(dòng)子序列2467bp1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCCAATTCCCACGMAATGAGGCMCAACTCTCACGCCT61AGCCTCAGAGGCACACTAGGCATGCCCCGAGGTTGGTTTTTTAAMTGCTGGTACATACG121TTTTTTTTTTTTAACAMCAATATTATCTACTAAGAGGTAGGAGAGTGGGCTATACCTCA181CATTGAGCTAGCCATAATAAGGTGGTTCGAATTCACCTTTGGCGAGAATCAAACCTAAGA241CCTCTCACTTACAAGTMAGMGAATATTATTAGACCGCAGTACTAAATGGTTGTACGTA301CGTATTTATCTTTGAATGAGAGATACGGCTGTTGGCAATTCAAAGTTAAAACTGGTAAGC361AMTTATGGAGTTTAGCAAACAAAAGTAATTAGCTCACGTCCTATATCTGCTCTCAAATT421CMTGAGATCGATGTATATCTAGTCCAATGTCATATATGCAATGTCCCCCAATCCACGCA481TACAAGGATTATGATCATAATCTTGTAAAGATTTGCACCCAAATMGAATACATCGGTGA541CGAGGACGAGCTAATTAGCTTAGCTMTTATATATTCATCCGTTCAGTTCGGACGGATAT601ATATTACACTMGGGACGAGGAGAATAAATTGGTTACAAACTTGACACTTATAMATTTG661AATCTAAGATCTTTTACCTACAAGTGAATAGGATATCATTAAACCGTAATACCATGCTTA721TMCTATGTGTTGGATMGTGATTTGTAAGTATCMTATATTTTGGCTAAGTATAGATTG781CTATTGAGTTTTAATGTTAAGCGATTTTCAGAAATTAATTTCTAATGACGATAMTATTT841TATCTTTCTGATCTTACCACAGTGCGAAAAATTATATACAGTACTACCAGCTACCATTGC901TGAGTGGTAGTACATCTGTACTCAAATTTTGCCATATTACAATTMTACACGGTAATACT961AGGAGATTTGTAAACTMATMCATGGAAGTCGCTCGTTGGATTTTACTTTTTTTTTAAC1021AMAATTGAATTATTACTTAAGTGTTGATTAATGATGTGATTATTTCTTATTGGTGACAC1081GTTATTAGTCTGCAAACTTAGTCTCTTTAGCATTACCCATTTGTACATAAGCTTATGCAG1141TTAATTCTGAGGTTACMACCAAACACAAGGCTCACCAGCATATGCCTGCCACCAACCM1201AAGCTTGAATGACGGACTGACAGTGGCGAGAGTGGCGACCMGTTCTTTAGGTTTGGAAC1261TGCAATTTCTGTGCAATAATATTTTCTAAGAATATATAATTAAGMATACATCMGACGA1321TGGGATMATCCCAAATCCAGTTAATCGGAGACGGTTTTGGAAGCCAAGTCTTTGAATTG1381AAGGCAMCGMCCATCGATGATCCTCAATTCCTGACTATTTCTTCAATTGCTTCAGTTA1441CCATCAMTTCTCTTCAGTCTTCTTTCAGAAAATTCTTAAATTTGAGAAGTAAATCATM1501ATTTTATGCATAATAATATTCTGGGACAGCACAGAGMTGATAACACAAGMAAAGGGGT1561AATACTTGACTAGTACTTACTTTTTGATATTGTCTAATAATATTTTAACACATGTTTTAT1621TGTTTAMAAATAATGTACATGTTATTAATTTTTCTTGAACTTTMAAAATAAAGAACAT1681GTTTTGTTATTGAAACMATMGAAAGTGATTACATAAAGTACTTACTAACTAGTATCM1741GTATTATCCAGAACAAATTACAATATGTCGGTGTTGAATATTCCTGCATGCATGCACTGA1801TTTATCACCGTCCTCCCGTTTAATGGTGTGTGGGAGTTACCAACATCATGAGAAACTCAC1861AGTTAAAGCCMTTAAGGGAATTTTACGTTATATTACTCATATTGCACATTAAATGTATG1921ATTTTCAGTTTTGTTGTTTTGTTTCCGCTGGAATTCTAAGCTTTCCAAATCATGTATAM1981ATACCACGTAGATTTTTTCCTACCCCTTGTTTGGTAGGTAAGACGAGAGGACAMCACAT2041TCCAAATCATGCACAGGTTAGTAGGCAAAGCAGACCACACAAAATGCACGTGCCAACAAG2101CCCCCTTCCCCTTAGGTAGTTGAGGGTTTCTAACGAAGTAATGGGTCAGGCACGTGATCC2161TCATCTACCCTCTATTCGCGTTATATAAATATATCCACTTCCCTTAACATTGTGTCACAC2221CCCTTACCTGCTATCTTACTTACCCTTGCAACGTCCTCTAACTCCTCTCTTCGATCTTTC2281TTGACGACCCGATCAAMTGGTGACCGTCGAAGAAGTTCGCAAGGCTCGACGGGCTGAGG2341GTCCGGCCACTGTTTTGGCCATTGGGACAGCAACTCCTCCCAACTGTGTGGATCAAGCCA2401CATACCCCGACTATTACTTTCGTATCACCAACAGTGAGCACAAGACTGAGCTCMAGAM2461AATTCCA序列一蘋果屬觀賞海棠S3種'火焰'CHS基因啟動(dòng)子序列91723lTTGGAATTTTTCTTTGAGCTCAG／C／／G／GC／CAC／G／／GG／GA／ACGAAAG／AA／AG／C6lGGGGTATGTGGCTTGATCCACACAG／／GGGAGGAG／／GC／G／CCCAA／GGCCAAAACAG／l2lGGCCGGACCCTCAGCCCGTTGAGCCTTGCGAACTTCTTCGACGGTCACCATTTTGATCGGl8lGTCGTC從GA從GACCGAAGAGAGGAGGAG／／AGGGGACG／／GCAAGGG／AAG／AAGA／A36lCCCGAGGTTTTTAAAACACTAGTACATACGTTTTTTTTTAACAAACAATATTATCTACTA42lAGGGGTGGGGGAGTGGTCTATGCCTCACA／／GAGC／AGCCA／AA／AA／G／／G／／CGAA／／48lCACCTTTTGGGAGAATCAAACC／AAGACC／C／CAC／／ACAAG／GAAGAGAAA／A／／A／／G541GACCGCAATAC／AAG／GG／／G／A／G／A／／／G／C／／／GAA／GAAAGA／ACGGAGC／G／／CG60lCAA／／CAAAG／／AAAAC／GG／AAGCAAA／／A／GGAG／／／AGCAAACAAAAG／／A／／AGC／66lCACGTCCTATATCTGCTCTCAAATTCAA／GAGA／CGA／G／A／A／C／AG／CCAAGA／CA／A72lTATGCAATGTCCCCCAATCCACGCATACTCGGATTATGATCATAATCTTGTAAAGATTTG78lCACCTAAATGAGAA／ACATTGGTGACGAGGACGAGCTAATTAGCTTAGCTAATTATATAT96lATCGTTAGACCGTAATACCAACGATCGAATGCTTATAATTATGTGTTGGATAAGTGATTT102lGTAAGTATCAATATATTTTGGCTAAGTATAGATTACTATTGAGTTTTAATGTTAAGCGAT108lTTTCAGAAATTAATTTCTAATGACGATAAATATTTTATCTTTCTGATCTTACCACAGTGC114lGAAAAA／／A／A／／G／C／AA／／AA／AA／G／ACA／G／／A／／AA／／／／／C／／GAAC／／／AAAAl20lAATAAAGAACACG／／／／G／／A／／GAACCAAA／AAGA從ATGA／／ACA／AAAG／AC／／AC／l26lAACCTGTATCCAAG／A／AG／CCAGAAAAAA／／ACAA／A／G／CGG／G／／GAA／A／／CC／GCl32lATGCATGCACTGATTTATCACCGTCCTCCCGTTTAA／GG／G／G／GGGAG／／ACCAACACCl38lATGAGAATCTACTTTA從GCCAA／／從GGGAA／／／／ACG／／A／A／／A／／CA／A／／GCACAl56lAACAAACACA／／CCAAA／CA／GCACAGG／／AG／AGGCAAAGCAGACCACACAAAA／GCAC162lGTGCCAACAAGCCCCCTTCCCCTTAGGTAGTTGAGGGTTTCTAACGAAGTAATGGGTCAG168lGCACGTGATCCTCATCTACCCTCTCTTCGCGTTATATAAATAT序列三蘋果屬觀賞海棠品種‘火焰’CHS基因啟動(dòng)子與‘王族’比較缺失的堿基序列743bplTATACAGTACTACCAGCTACCATTGCTGAGTGGTAGTACATCTGTACTCAAATTTTGCCA6lTATTACAATTAATACACGGTAATACTAGGAGATTTGTAAACTAAATAACATGGAAGTCGC24lACCCATTTGTACATAAGCTTATGCAGTTAATTCTGAGGTTACAAACCAAACACAAGGCTC30lACCAGCATATGCCTGCCACCAACCAAAAGCTTGAATGACGGACTGACAGTGGCGAGAGTG361GCGACCAAGTTCTTTAGGTTTGGAACTGCAATTTCTGTGCAATAATATTTTCTAAGAATA421TATAATTAAGMATACATCAAGACGATGGGATAAATCCCAAATCCAGTTAATCGGAGACG481GTTTTGGAAGCCAAGTCTTTGAATTGAAGGCAAACGAACCATCGATGATCCTCMTTCCT541GACTATTTCTTCAATTGCTTCAGTTACCATCAAATTCTCTTCAGTCTTCTTTCAGAAAAT601TCTTAAATTTGAGAAGTAAATCATAMTTTTATGCATAATAATATTCTGGGACAGCACAG661AGAATGATAACACAAGMAAAGGGGTAATACTTGACTAGTACTTACTTTTTGATATTGTC721TAATAATATTTTAACACATGTTT序列四DNA人工序列CHS1:5'-GCCGTAATCAGACAGCACTTGCCTTGTA-3'序列五DNA人工序列CHS2:5'-AAATGTAAGCCCTACTTCACGGAGATGG-3'序列六DNA人工序列CHS3:5'-TCTCAATGCTTCAGTTACCATCAAATCTCT-3'圖1為觀賞海棠S]口種'王族，和'火焰'DNA提取電泳圖圖2為觀賞海棠S]口種'王族，hi-TAIL第二輪PCR電泳圖圖3為觀賞海棠B口]口種'王族，hi-TAIL第三輪PCR電泳圖圖4為觀賞海棠口口]口種'火焰，hi-TAIL第二輪PCR電泳圖圖5為觀賞海棠B口]口種'火焰，hi-TAIL第三輪PCR電泳圖權(quán)利要求本發(fā)明的目的是提供兩種與植物花色素苷形成相關(guān)編碼基因的啟動(dòng)子本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關(guān)基因的啟動(dòng)子，名稱為McCHSpromoter，來源于蘋果屬觀賞海棠品種‘王族’(MalusCrabapple‘Royalty’)和‘火焰’(MalusCrabapple‘Flame’)，本發(fā)明的保護(hù)范圍為1)由序列表中序列1和序列2所示的啟動(dòng)子序列，蘋果屬觀賞海棠品種‘王族’(MalusCrabapple‘Royalty’)為5’末端上游1-2497位堿基，‘火焰’(MalusCrabapple‘Flame’)為5’末端上游1-1723位堿基；2)將序列表中序列1和序列2的啟動(dòng)子序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸堿基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷代謝相關(guān)的啟動(dòng)子序列；3)與1)的啟動(dòng)子具有95％以上的同源性，且調(diào)控上述與植物花色素苷形成相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列4)與1)的啟動(dòng)子具有95％以上的同源性，為蘋果屬觀賞海棠‘王族’(MalusCrabapple‘Royalty’)和‘火焰’(MalusCrabapple‘Flame’)CHS啟動(dòng)子內(nèi)部的序列；5)序列1與序列2相比較，序列2中間缺失的743bp序列(序列3)；6)擴(kuò)增上述CHS基因全長(zhǎng)或任一片段的引物全文摘要本發(fā)明公開了兩種種植物花色素苷形成關(guān)鍵酶的編碼基因啟動(dòng)子。1)由序列表中序列1和序列2所示的啟動(dòng)子序列，蘋果屬觀賞海棠品種‘王族’(MalusCrabapple‘Royalty’)為5’末端上游1-2497位堿基，‘火焰’(MalusCrabapple‘Flame’)為5’末端上游1-1723位堿基；2)將序列表中序列1和序列2的啟動(dòng)子序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸堿基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷代謝相關(guān)的啟動(dòng)子序列。文檔編號(hào)C12N15/113GK101709301SQ200910223600公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月24日優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日發(fā)明者姚允聰,宋婷婷,沈紅香,田佶申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院;姚允聰