專利名稱：一種十字花科作物抗病品種的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物抗病品種的鑒定方法，尤其涉及十字花科作物抗病品種的鑒定方法。
背景技術(shù)：
十字花科蔬菜黑腐病的病原菌為十字花科黑腐病菌0(CC， Xanthomonascampestris pv. campestris)，也稱野油菜黃單胞菌野油菜致病變種。十字花 科蔬菜黑腐病主要發(fā)生在大白菜、蘿卜、菜心、芥菜、綠菜花、白菜花、苤藍及油菜等十字花 科蔬菜作物上，近幾年來發(fā)病有逐漸加重的趨勢，降低了該類蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成很大 的經(jīng)濟損失。種植作物的抗病品種是對付作物病害的有效措施之一，而鑒定作物抗病品種 資源則是抗病育種的基礎(chǔ)。生物性病原最主要的是真菌，其次是病毒、細菌、線蟲、類菌原體、放線菌以及寄生 性種子植物等。這些病原生物多數(shù)為寄生性微生物，常統(tǒng)稱為病原物；其中真菌和細菌性病 原又稱為病菌，被病原物寄生的植物稱為寄主植物，簡稱寄主。病原菌群對寄主植物有致病性分化現(xiàn)象是指，同種病原物內(nèi)的不同群體對不同分 類單元的寄主植物的致病性不同。病原物的無毒基因是指病原物遺傳因子，其編碼的產(chǎn)物激發(fā)病原物與植物特異性 相互作用。無毒基因是決定對寄主植物特異性不親和的基因，農(nóng)桿菌在植物體內(nèi)瞬間表達 無毒基因，可引起依賴于寄主抗病基因的過敏反應(yīng)。寄主抗病基因是經(jīng)典遺傳學(xué)基因?qū)?因(gene-for-gene)假說中所指的與病原物無毒基因相對應(yīng)的存在于植物特定品種中且 在植物生長的整個周期或其中某個階段為組成型表達的植物抗病品種所特有的一類基因。十字花科黑腐病菌群對寄主植物有明顯的致病性分化現(xiàn)象，其主要原因之一就是 病菌不同菌株無毒基因的種類或組成的差異，以及對應(yīng)的寄主抗病基因的變化。以往，鑒定作物抗病品種的方法是這樣的從寄主植物的破口處接種上病原物，對 該該寄主植物經(jīng)過一段時間進行觀察，如果未產(chǎn)生相應(yīng)的病害，則說明該寄主植物為抗病 品種，反之，則說明該寄主植物為非抗病品種。這種方法的缺點是其需要花費的時間較長， 已經(jīng)不適應(yīng)日益發(fā)展的農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化生產(chǎn)和建設(shè)的需要。參考文獻[ 1 ] Keen NT. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions. Annu RevGenet, 1990, 24 :447-463.[2]Bai J, Choi S-H, Ponciano G, Leung H, and Leach JE. Xanthomonas oryzae pv.oryzaeavirulence genes contribute differently and specifically to pathogen aggressiveness. MolPlant-Microbe Interact. ,2000,13 :1322-1329.[3]ffhite FF. Prospects for understanding avirulence gene function. Curr· Opin. Plant Biol，2000，3 :291-298.[4]Heesemann, J. Algermissen, B. and Laufs, R. Genetically manipulatedvirulence of Yersiniaenterocolitica. Infect. Immun,1984,46 :105-110.[5]Dangle JL.The enigmatic avirulence genes of phytopathogenic bacteria. Curr TopMicrobiol Immunol,1994,192 :99-118.[6]Vivian A and Gibbon MJ. Avirulence genes in plant-pathogenic bacteria signals orweapons. Microbiology, 1997,143 :693-704.[7] Cornells GR, Van Gijsegem F. Assembly and function of type III secretory systems. Annu. Rev. Microbiol, 2000, 54 :735-774.[8]Fenselau S, Balbo I, and Bonas U. Determinants of pathogenicity in Xanthomonascampestris pv. vesicatoria are related to proteins involved in secretion in bacterialpathogens of animals. Mol Plant-Microbe Interact,1992,5 390-396.[9]Kim MG, Geng X, Lee SY, Mackev D. The Pseudomonas syringae type III effectorAvrRpml induces significant defenses by activating the Arabidopsis nucleotide-bindingleucine-rich repeat protein RPS2. Plant J,2009,57(4) :645-653.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種十字花科作物抗病品種的鑒定方法，能夠 快速地鑒定出十字花科作物抗病品種。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種十字花科作物抗病品種的鑒定方法， 包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中的無毒基因；用所述8004菌株基因組中的無毒基因構(gòu)建系列的鑒別菌株；將至少帶有所述無毒基因的農(nóng)桿菌懸液注滲到十字花科應(yīng)試寄主葉片脈間，并檢 測應(yīng)試寄主的過敏反應(yīng)。優(yōu)選地，若在應(yīng)試寄主上檢測到過敏反應(yīng)，則表明該應(yīng)試寄主對無毒基因發(fā)生了識別作 用，提示該寄主具有針對該無毒基因的抗病基因。優(yōu)選地，找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中的無毒基因，具體包括在十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中搜索已注釋的無毒基因，并驗證的新的 無毒基因的編碼區(qū)。優(yōu)選地，用8004菌株基因組中的無毒基因構(gòu)建鑒別菌株，具體包括分別擴增所有找出的無毒基因全長序列作為候選基因，并將候選基因克隆于表達 雙元載體PBI121中，構(gòu)建含有所述無毒基因的表達載體；通過農(nóng)桿菌注滲法分別將含有所述無毒基因的表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 菌株中，構(gòu)建系列的鑒別菌株。優(yōu)選地，將至少帶有所述無毒基因的農(nóng)桿菌懸液注滲到十字花科應(yīng)試寄主葉片脈 間，具體包括分別將鑒別菌株在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB中，于培養(yǎng)對小時，離心收集菌體， 再用無菌水稀釋成0D_ = 1. O的菌體懸液；
用無菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液約10微升，從十字花科寄主的葉背注滲 入葉脈間，形成一個可見的浸潤斑；將接種后的十字花科寄主置于28。C及80%濕度的環(huán)境 中，交替進行連續(xù)光照16小時及連續(xù)黑暗8小時，共觀察48小時。優(yōu)選地，檢測應(yīng)試寄主的過敏反應(yīng)，具體包括在十字花科寄主上以十字花科黑腐病菌野生型kc 8004作陽性對照，以含有 PBI121的EHA105菌株作陰性對照，觀察若十字花科寄主上產(chǎn)生含無毒基因表達載體的鑒 別菌株的過敏反應(yīng)，則確認十字花科寄主相對所述無毒基因的抗病品種。采用本發(fā)明的對十字花科作物抗病品種進行鑒定的方法，不僅能夠快速地鑒定出 十字花科作物抗病品種，而且能提供十字花科作物抗病基因的相關(guān)信息，為快速分離、克隆 抗病基因奠定了基礎(chǔ)，這無疑對十字花科作物抗病育種以及提高十字花科類蔬菜的產(chǎn)量和 品質(zhì)具有顯著的不可估量的意義。


圖1為PCR克隆XC_0542基因的電泳圖譜；圖2為pBI0542表達載體的酶切電泳圖譜；圖3為EHA105中pBI0542的PCR驗證電泳圖譜；圖4為EHA105/pBI0542菌株在椰菜花上的HR反應(yīng)。
具體實施例方式本發(fā)明提供的十字花科作物抗病品種的鑒定方法基于農(nóng)桿菌注滲法，其發(fā)明構(gòu)思 是，利用無毒基因可引起依賴于寄主抗病基因的過敏反應(yīng)這一特性，通過找出十字花科黑 腐病菌群無毒基因，檢驗出寄主植物抗病基因的存在，由此能夠快速地鑒定出十字花科作 物抗病品種。本發(fā)明完成kc 8004菌株全基因組測序后，在全基因組水平注釋了 8個無毒基 因，并用實驗證明了 2個新的無毒基因，用這10個無毒基因構(gòu)建了一系列鑒別菌株，通過農(nóng) 桿菌介導(dǎo)瞬時表達的方法快速鑒定抗性寄主。分別將候選基因全長片段克隆到雙元載體 PBI121上，然后通過三親接合法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中構(gòu)建鑒別菌株。用無針頭注 射器分別將這些帶有不同效應(yīng)物基因或無毒基因的農(nóng)桿菌懸液注滲到寄主葉片脈間，檢測 過敏反應(yīng)。若能引起過敏反應(yīng)，就表明應(yīng)試寄主植物對這個無毒基因發(fā)生了識別作用，提示 該寄主植物具有針對該無毒基因的抗病基因。其具體操作方法如下(1)在十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中搜索已注釋的無毒基因和驗證的新 的無毒基因的編碼區(qū)；該)(cc8004 菌株全基因組信息(NC_007086. 1)已公布在 NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)白勺 GenBank 數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genbank/index. html)，這些無毒基因的基因序號和GenBank的GeneID號分別為XC_0052(GeneID :3382689)，XC_0542(GeneID :3381550)，XC_1553 (GeneID 3380160)， XC_1716(GeneID :3380265), XC_2004(GeneID :3380545), XC_2602(GeneID 3381136)，XC_2081 (GeneID :3380621)，XC_2082(GeneID :3380622)，XC_3802(GeneID 3379421)，XC_4318(GeneID :3379936)。(2)采用PCR方法，分別擴增上述無毒基因，并克隆于表達載體pBI121中，構(gòu)建含 有無毒基因的表達載體；(3)分別將含有無毒基因的表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，構(gòu)建鑒別菌株；(4)分別將鑒別菌株在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB中，于培養(yǎng)M小時，離心收集 菌體，再用無菌水稀釋成0D_ = 1. 0的菌體懸液；(5)用無菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液約10微升，從十字花科植物的葉背 注滲入葉脈間；接種后的植物在^°C，80%濕度的環(huán)境中，交替進行連續(xù)光照1 及連續(xù)黑 暗他，共觀察48小時；若引起了過敏反應(yīng)(如圖4A-2所示)，就表明應(yīng)試寄主植物對這個無毒基因發(fā)生 了識別作用，提示該寄主植物具有針對該無毒基因的抗病基因。下面以無毒基因中之一 XC_0542基因(GeneID :3381550)為例，進行更詳細地說明。實施例1XC_0542基因的克隆并構(gòu)建表達載體pBI0M2根據(jù)XC_0542的基因序列，設(shè)計引物正向引物F，5‘ -GGGTCTAGAATGGAGATCAAGAAAGCGCAGTCC-3 ‘，反向引物R，5‘ -GGGGGATCCTCAGCCGGAGCGCGGCGGGTC-3 ‘。以十字花科黑腐病菌總DNA為模板，PCR擴增該基因全長序列，并將其克隆至 PBI121中，構(gòu)建表達載體pBI0542并酶切驗證，請參見圖1。序列被亞克隆于pK18mob中， 并進行了測序驗證，該序列與XC_0542基因(GeneID :3381550)序列一致。圖1為PCR克隆XC_0542基因的電泳圖譜，M :0321標準DNA (片段大小從大到小 依次為3kb，2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb,0. 8kb,0. 7kb,0. 6kb,0. 5kb,0. 4kb,0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb，)；泳道1 :PCR克隆XC_0542基因的片段。實施例2、將表達載體pBI0542導(dǎo)入農(nóng)桿菌將pBI0542三親導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，將得到的三親接合子命名為EHA105/ PBI0M2，三親接合子PCR驗證，請參見圖2和圖3。圖2為pBI0542表達載體的酶切電泳圖譜，M :0321標準DNA(片段大小從大到小 依次為3kb，2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb,0. 8kb,0. 7kb,0. 6kb,0. 5kb,0. 4kb,0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb,)；泳道1 基因克隆pBI0542用Xbal/BamHI的酶切片段。圖3為EHA105中pBI0 2的PCR驗證電泳圖譜，M:0321標準DNA(片段大小從大到 小依次為:3kb, 2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb，0. 8kb，0. 7kb，0. 6kb，0. 5kb，0. 4kb，0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb,)；泳道 1 :EHA105 中 pBI0542 的 PCR 驗證片段。實施例3農(nóng)桿菌過敏反應(yīng)(HR)試驗所用的植物材料為椰菜花，A為抗病品種，B為感病品種。選取健康的椰菜花全展 葉片供試。(1)接種農(nóng)桿菌至加有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。(2) OD600 為 0. 4 0. 5 時收集 ImL 的菌液于 1. 5mL 的 EP 管，5000rpm 離心 5min,倒
6掉上清液，用2mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IOmM MgCl2, 5mM MESpH5. 6，150 μ M AS)重懸，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 5h。(3)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)OD6tltl至0. 4 0. 5，以十字花科黑腐病菌野生型)Ccc 8004作 陽性對照(如圖4中Al和Bi)，EHA105/pBI121作陰性對照(如圖4中A3和B3)。用無針 頭的針筒吸取菌液注滲到辣椒苗葉片背面的葉肉中，形成一個可見的浸潤斑。(4)將椰菜花放在，80%濕度的環(huán)境中，連續(xù)光照16h黑暗8h，交替進行，連續(xù) 觀察48小時。EHA105/pBI0542農(nóng)桿菌過敏反應(yīng)試驗請參見圖4A-2，是快速壞死斑，但病斑不 擴展，表明XC_0542基因在椰菜花A上能引起過敏反應(yīng)，初步確認椰菜花A相對無毒基因 XC_0542的抗病品種。圖4A-1是he 8004引起的HR反應(yīng)，菌體同樣不能在椰菜花A葉內(nèi)擴 展；圖4B-1結(jié)果表明)(cc 8004能在椰菜花B葉內(nèi)擴展；圖4B-2結(jié)果表明EHA105/pBI0M2 農(nóng)桿菌不能引起椰菜花B產(chǎn)生HR反應(yīng)。圖4為EHA105/pBI0542菌株在椰菜花上的過敏HR反應(yīng)，圖中A抗病品種；B感病 品種。1為Xcc 8004陽性對照，2為EHA105/pBI0M2(意為含有pBI0542的EHA105菌株) HR反應(yīng)，3為EHA105/pBI121(意為含有pBI121的EHA105菌株)陰性對照，4為無菌水。
權(quán)利要求
1.一種十字花科作物抗病品種的鑒定方法，包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中的無毒基因；用所述8004菌株基因組中的所述無毒基因構(gòu)建系列的鑒別菌株；將至少帶有所述無毒基因的農(nóng)桿菌懸液注滲到十字花科應(yīng)試寄主葉片脈間，并檢測所 述應(yīng)試寄主的過敏反應(yīng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，若在所述應(yīng)試寄主上檢測到所述過敏反應(yīng)，則表明所述應(yīng)試寄主對所述無毒基因發(fā)生 了識別作用，提示所述寄主具有針對該無毒基因的抗病基因。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述找出十字花科黑腐病菌8004菌 株基因組中的無毒基因，具體包括在所述十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中搜索已注釋的無毒基因，并驗證的新的 無毒基因的編碼區(qū)。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，用所述8004菌株基因組中的所述無 毒基因構(gòu)建鑒別菌株，具體包括分別擴增所有找出的所述無毒基因全長序列作為候選基因，并將所述候選基因克隆于 表達雙元載體PBI121中，構(gòu)建含有所述無毒基因的表達載體；通過農(nóng)桿菌注滲法分別將含有所述無毒基因的表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株 中，構(gòu)建所述系列的鑒別菌株。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將至少帶有所述無毒基因的農(nóng)桿菌懸液 注滲到十字花科應(yīng)試寄主葉片脈間，具體包括分別將所述鑒別菌株在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB中，于培養(yǎng)M小時，離心收集菌體， 再用無菌水稀釋成0D_ = 1. 0的菌體懸液；用無菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液約10微升，從所述十字花科寄主的葉背注滲 入葉脈間，形成一個可見的浸潤斑；將接種后的所述十字花科寄主置于28。C及80%濕度的 環(huán)境中，交替進行連續(xù)光照16小時及連續(xù)黑暗8小時，共觀察48小時。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，檢測所述應(yīng)試寄主的過敏反應(yīng)，具體 包括在所述十字花科寄主上以十字花科黑腐病菌野生型)(cc 8004作陽性對照，以含有所 述PBI121的所述EHA105菌株作陰性對照，觀察若所述十字花科奇主上產(chǎn)生含無毒基因表 達載體的鑒別菌株的過敏反應(yīng)，則確認所述十字花科寄主相對所述無毒基因的抗病品種。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種十字花科作物抗病品種的鑒定方法，包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中的無毒基因；用所述8004菌株基因組中的無毒基因構(gòu)建系列的鑒別菌株；將至少帶有所述無毒基因的農(nóng)桿菌懸液注滲到十字花科應(yīng)試寄主葉片脈間，并檢測應(yīng)試寄主的過敏反應(yīng)。本發(fā)明不僅能夠快速地鑒定出十字花科作物抗病品種，而且能提供十字花科作物抗病基因的相關(guān)信息，為快速分離、克隆抗病基因奠定了基礎(chǔ)，這無疑對十字花科作物抗病育種以及提高十字花科類蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有顯著的不可估量的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102071248SQ200910223808
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者何勇強, 劉嬌, 唐紀良, 姜偉, 姜伯樂, 岑衛(wèi)健, 黃俊錠 申請人:廣西大學(xué)