專利名稱：人乳腺癌高轉移細胞亞系及其建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及癌細胞系，具體涉及人乳腺癌高轉移細胞亞系及其建立方法，屬于動 物細胞系的技術領域。
背景技術：
腫瘤的侵襲與轉移時惡性腫瘤最基本的生物學特性之一，原發(fā)性腫瘤致死是較為 罕見的，90%以上腫瘤患者的死于腫瘤細胞在人體內的轉移時。乳腺癌是危害女性身心健康的主要疾病之一，成為女性最常見的惡性腫瘤。在美 國，每年有4. 5萬名乳腺癌患者因腫瘤遠處轉移而死亡。然而目前腫瘤轉移的確切機制尚不十分清楚，關于腫瘤轉移一直是腫瘤學研究的 熱點。在有關乳腺癌浸潤、轉移研究中，MDA-MB-435是較為常用的人乳腺癌細胞株。文獻 報道，裸鼠乳腺癌脂肪墊原為接種該細胞4周、8周和12周時，鼠肺的轉移率分別是30%、 70%和100%。由此可見，雖然該細胞株最終可以有較高的肺轉移率，但需要較長的實驗周 期和較高的實驗投入。所以在本領域的研究中較大的局限性，制約了對乳腺癌轉移機制的 研究的進展。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種高轉移人乳腺癌細胞系，以解決現有技 術所存在的諸多不足之處，如人乳腺癌細胞株MDA-MB-435實驗周期較長和實驗投入較高 的缺陷。本發(fā)明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發(fā)明的第一方面，一種人乳腺癌高轉移細胞亞系是MDA-MB-231sci，具有生 物學和病理學特征，還具備特殊轉移表型。所述生物學特征是，MDA-MB-231sci細胞為典型的多邊形上皮樣細胞；胞漿豐富，胞核大而圓，保持了 MDA-MB-231細胞系的形態(tài)學特點；
貼壁生長，大小較一致，排列緊密，界線清楚。所述病理學特征是所述轉移使用裸鼠，所述裸鼠體內轉移部位腫瘤細胞與皮下腫 瘤的細胞結構相似，轉移時間縮短，轉移率高。所述轉移時間縮短至沈-42天。所述裸鼠轉移率為100%。人乳腺癌高轉移細胞亞系MDA-MB-231sci，包藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏 地址中國湖北省武漢市武漢大學生命科學學院武漢市武昌珞珈山，郵編430072。保藏日 期2009年7月四日。保藏編號CCTCC NO :C200955。作為本發(fā)明的第二方面，人乳腺癌高轉移細胞亞系(MDA-MB-231sci)的建立方 法，其特征在于，
(1)人乳腺癌原位移植瘤模型的建立取裸小鼠5只，收集體外培養(yǎng)生長旺盛的連 續(xù)傳代人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，調整細胞濃度為每毫升1 X IO7個，每只小鼠取0. 2ml 接種于裸小鼠右背側近腋部皮下；當移植瘤長至直徑15mm左右時，頸椎脫臼法處死小鼠，剝取出移植瘤，清除外周 血塊及結締組織，用含抗菌素的生理鹽水沖洗，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將 其剪切成直徑約1. 5mm的小塊，用20號套管針移植至另外裸小鼠右前側乳腺脂肪墊部位， 建立乳腺癌原位移植瘤模型；(2)原位移植肺靶向轉移模型的篩選建立原位移植瘤模型后，待瘤徑長至1. 5 2. Ocm時手術切除腫瘤及相應乳腺，待動物處于瀕死狀態(tài)時犧牲小鼠進行系統(tǒng)解剖，取肉眼 明顯可見的肺轉移灶移植至另外裸小鼠乳腺脂肪墊進行原位移植，按乳腺原位移植、手術 切除腫瘤及相應乳腺、肺轉移灶、乳腺原位移植的體內篩選方式進行高轉移循環(huán)篩選；原代10只裸小鼠，其他每代4 6只裸小鼠，循環(huán)篩選至肺轉移達100%，此時取 腫瘤組織建立相應的高轉移細胞亞系；(3)人乳腺癌肺靶向高轉移細胞系的建立及傳代將荷瘤裸小鼠頸椎脫白法處 死，無菌條件下取出皮下移植瘤，剔除壞死組織、纖維包膜及血管；用含雙抗的PBS洗2次，向組織滴1-2滴含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用顯微 剪刀和顯微鑷將其盡量剪成小塊；用顯微鑷將剪切好的組織塊在6cm培養(yǎng)皿上均勻放置，每一小塊間距0. 5cm左 右；然后在培養(yǎng)皿內注入適量培養(yǎng)液，放置在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內。以后所建 立的原代細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。所述步驟O)中所述循環(huán)篩選至第四代時肺轉移達100%，同時伴部分動物腋下 淋巴結轉移。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明采用體內篩選每代手術切除腫瘤及相應乳腺，提高成功率。2、本發(fā)明的轉移率提高達100%，同時伴部分動物腋下淋巴結轉移。
以下結合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明。

圖1為乳腺癌原位移植瘤模型的照片。圖2為MDA-MB_231sci細胞的形態(tài)照片。人乳腺癌高轉移細胞亞系MDA-MB_231sci。保藏日期2009年7月29日。保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC。保藏編號CCTCC NO :C200955。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具 體圖示，進一步闡述本發(fā)明。
一、材料1.腫瘤細胞人乳腺癌高轉移細胞MDA-MB-231由和記黃埔(上海)醫(yī)藥有限公司惠贈(原始來 源于 ATCC 美國菌種保藏中心 American Type Culture Collection 編號 ATCC HTB16 )， 皮下移植瘤MDA-MB-231由上海市腫瘤研究所保存和傳代。2.細胞培養(yǎng)試劑Dulbecco MEM(DMEM)培養(yǎng)基購自 SIGMA-ALDRICH 公司；胎牛血清購自 PAA laboratories GmbH公司；胰蛋白酶購自GIBCO BRL公司；生理鹽水，慶大霉素，10%中性甲 醛溶液，PBS緩沖液等均為進口分裝或國產分析純試劑。3.儀器與設備超凈工作臺由蘇州凈化設備有限公司生產，型號為SW-CJ-2FD ；CO2培養(yǎng)箱為 Heraeus產品，型號為BB16UV，以及Thermon公司產品，型號為eel 1150 ；恒溫水浴鍋為上海 精宏實驗設備有限公司產品，型號為DK-S22;倒置顯微鏡為重慶光電儀器有限公司產品， 儀器型號為》)S-1B ；數碼相機為NIKON產品；超低溫冰箱型號為Jouan，法國生產；移液槍 為GILSON公司產品；液氮罐型號為，MVE CRYSTEM 4000 ；培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶為Greiner公司 產品；小型電熱真空滅菌器，型號為XG1.UXD-0. 361B。4.實驗動物SPF級BALB/c-nu/nu裸小鼠，鼠齡6 7周，體重18_22g，雌性。實驗小鼠 由上海市腫瘤研究所提供，生產許可證號為SCXK(滬)2007-0001，使用許可證號為 SYXK (滬)2007-0001。所用墊料、飲水、全價顆粒飼料及其他與動物接觸的物品均經高壓滅 菌處理。實驗和飼養(yǎng)條件嚴格按照SPF動物的規(guī)范要求。二、方法1.人乳腺癌原位移植瘤模型的建立取裸小鼠5只，收集體外培養(yǎng)生長旺盛的連續(xù)傳代細胞，調整細胞濃度為每毫升 1 X IO7個，每只小鼠取0. 2ml接種于裸小鼠右背側近腋部皮下。當移植瘤長至直徑15mm左 右時，頸椎脫白法處死小鼠，剝取出移植瘤，清除外周血塊及結締組織，用含抗菌素的生理 鹽水沖洗，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將其剪切成直徑約1. 5mm的小塊，用20 號套管針移植至另外裸小鼠右前側乳腺脂肪墊部位，建立乳腺癌原位移植瘤模型(圖1)。2.原位移植肺靶向轉移模型的篩選建立原位移植瘤模型后，待瘤徑長至1. 5 2. Ocm時手術切除腫瘤及相應乳腺，待 動物處于瀕死狀態(tài)時犧牲小鼠進行系統(tǒng)解剖，取肉眼明顯可見的肺轉移灶移植至另外裸小 鼠乳腺脂肪墊進行原位移植，按乳腺原位移植、手術切除腫瘤及相應乳腺、肺轉移灶、乳腺 原位移植的體內篩選方式進行高轉移循環(huán)篩選。原代10只裸小鼠，其他每代4 6只裸小 鼠，循環(huán)篩選至第四代時肺轉移達100%，此時取腫瘤組織建立相應的高轉移細胞亞系。3.人乳腺癌肺靶向高轉移細胞系的建立及傳代將荷瘤裸小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出皮下移植瘤，剔除壞死組織、纖維 包膜及血管。用含雙抗的PBS洗2次，向組織滴1-2滴含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用 顯微剪刀和顯微鑷將其盡量剪成小塊。用顯微鑷將剪切好的組織塊在6cm培養(yǎng)皿上均勻放 置，每一小塊間距0. 5cm左右。然后在培養(yǎng)皿內注入適量培養(yǎng)液，放置在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內。以后所建立的原代細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。三、結果1.體內篩選結果隨著篩選代數的增加，轉移時間縮短，轉移率提高達100%，同時伴部分動物腋下 淋巴結轉移。2.細胞培養(yǎng)建系表1細胞培養(yǎng)建系
權利要求
1. 一種人乳腺癌高轉移細胞亞系是MDA-MB-231sci，具有生物學和病理學特征，還具 備特殊轉移表型。
2.根據權利要求1所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系，其特征在于，所述生物學特征是，MDA-MB-231sci細胞為典型的多邊形上皮樣細胞；胞漿豐富，胞核大而圓，保持了 MDA-MB-231細胞系的形態(tài)學特點；貼壁生長，大小較一致，排列緊密，界線清楚。
3.根據權利要求1所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系，其特征在于，所述病理學特征是 所述轉移使用裸鼠，所述裸鼠體內轉移部位腫瘤細胞與皮下腫瘤的細胞結構相似，轉移時 間縮短，轉移率高。
4.根據權利要求3所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系，其特征在于，所述轉移時間縮短 至26-42天。
5.根據權利要求1所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系，其特征在于，所述裸鼠轉移率為 100%。
6. 一種根據權利要求1所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系的建立方法，其特征在于，(1)人乳腺癌原位移植瘤模型的建立取裸小鼠5只，收集體外培養(yǎng)生長旺盛的連續(xù)傳 代人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，調整細胞濃度為每毫升1 X IO7個，每只小鼠取0. 2ml接種 于裸小鼠右背側近腋部皮下；當移植瘤長至直徑15mm左右時，頸椎脫臼法處死小鼠，剝取出移植瘤，清除外周血塊 及結締組織，用含抗菌素的生理鹽水沖洗，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將其剪 切成直徑約1. 5mm的小塊，用20號套管針移植至另外裸小鼠右前側乳腺脂肪墊部位，建立 乳腺癌原位移植瘤模型；(2)原位移植肺靶向轉移模型的篩選建立原位移植瘤模型后，待瘤徑長至1.5 2. Ocm時手術切除腫瘤及相應乳腺，待動物處于瀕死狀態(tài)時犧牲小鼠進行系統(tǒng)解剖，取肉眼 明顯可見的肺轉移灶移植至另外裸小鼠乳腺脂肪墊進行原位移植，按乳腺原位移植、手術 切除腫瘤及相應乳腺、肺轉移灶、乳腺原位移植的體內篩選方式進行高轉移循環(huán)篩選；原代10只裸小鼠，其他每代4 6只裸小鼠，循環(huán)篩選至肺轉移達100%，此時取腫瘤 組織建立相應的高轉移細胞亞系；(3)人乳腺癌肺靶向高轉移細胞系的建立及傳代將荷瘤裸小鼠頸椎脫白法處死，無 菌條件下取出皮下移植瘤，剔除壞死組織、纖維包膜及血管；用含雙抗的PBS洗2次，向組織滴1-2滴含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用顯微剪刀 和顯微鑷將其盡量剪成小塊；用顯微鑷將剪切好的組織塊在6cm培養(yǎng)皿上均勻放置，每一小塊間距0. 5cm左右；然后在培養(yǎng)皿內注入適量培養(yǎng)液，放置在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱內。以后所建立的 原代細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。
7.根據權利要求6所述的人乳腺癌高轉移細胞亞系的建立方法，其特征在于，所述步 驟O)中所述循環(huán)篩選至第四代時肺轉移達100%，同時伴部分動物腋下淋巴結轉移。
全文摘要
一種人乳腺癌高轉移細胞亞系MDA-MB-231sci，具有生物學和病理學特征、特殊轉移表型。生物學特征是MDA-MB-231sci細胞為典型的多邊形上皮樣細胞；胞漿豐富，胞核大而圓；貼壁生長，大小較一致，排列緊密，界線清楚。病理學特征是裸鼠體內轉移部位腫瘤細胞與皮下腫瘤的細胞結構相似，轉移時間縮短，轉移率高。轉移時間縮短至26-42天；肺轉移率為100％，同時伴部分動物腋下淋巴結轉移。高轉移人乳腺癌細胞系的建立方法，(1)人乳腺癌原位移植瘤模型的建立；(2)原位移植肺靶向轉移模型的篩選；(3)人乳腺癌肺靶向高轉移細胞系的建立及傳代。本發(fā)明采用體內篩選每代手術切除腫瘤及相應乳腺，提高成功率。
文檔編號C12R1/91GK102071168SQ20091022384
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權日2009年11月24日
發(fā)明者劉蕾, 姚明, 孔韓衛(wèi), 朱淼鑫, 王曉敏, 趙方瑜, 閆明霞 申請人:上海市腫瘤研究所