專利名稱：轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的核酸分子及其檢測方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的核 酸分子。本發(fā)明也涉及應(yīng)用前述序列的一種用于檢測對于木瓜環(huán)斑病毒具有廣泛抗性的轉(zhuǎn) 基因木瓜品系16-0-1的方法，以及依據(jù)前述序列所設(shè)計(jì)出的引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
木瓜(Papaya) (Carica papaya L.)生長于熱帶與亞熱帶地區(qū)。量產(chǎn)木瓜所面 臨的最大問題是在于木瓜環(huán)斑病毒(papaya ringspot virus, PRSV)造成的破壞性疾病 (Purcifull et al. 1984)。1975 年，PRSV 首次在南臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)(Wang et al. 1978)，至 今已經(jīng)摧毀了商業(yè)果園大部分的木瓜生產(chǎn)。I3RSV是屬于馬鈴薯Y群病毒(Potyvirus)的一 員，此族群病毒是最龐大且影響經(jīng)濟(jì)甚巨的植物病毒族群(Fauquetet al. 2005)。I3RSV可 以通過蚜蟲傳遞并且誘發(fā)葉部斑點(diǎn)以及變形、莖桿條紋以及生長停滯的發(fā)生，而導(dǎo)致果實(shí) 品質(zhì)及產(chǎn)量的驟減(Purcifull et al. 1984)。目前被使用來保護(hù)木瓜免于rasv感染的控制措施，主要包括選擇種植時間， 以避開蚜蟲生長高峰期；使用銀色覆蓋物(silver mulch)，以驅(qū)離蚜蟲遠(yuǎn)離種苗；以及 應(yīng)用減弱的PRSV病毒株的交叉保護(hù)作用(cross protection) (Yeh et al. 1988 ；Yehand Gonsalves,1994) 0然而，這些方法皆無法提供對抗I3RSV的長期有效的保護(hù)。目前在臺 灣，將木瓜種植于網(wǎng)室內(nèi)已經(jīng)變成用于避免木瓜遭受經(jīng)蚜蟲傳遞的I3RSV感染的最有效的 控制方法。然而，網(wǎng)室構(gòu)筑需要較高的成本，且所使用的塑料材料于自然中難以分解，這 將會對環(huán)境造成危害，且熱帶風(fēng)暴造成損害的高度風(fēng)險(xiǎn)亦為需要考量的重要問題(Bau et al. 2003)。近年來，以病源體衍生的抗性(pathogen-derived resistance, PDR)的觀念 (Sanfordand Johnson, 1985)為基礎(chǔ)，含有植物病毒基因組片段的轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)已經(jīng) 廣泛地被使用作為控制病毒的對策(Beachy，1997)。在大部分的實(shí)例中，會產(chǎn)生后轉(zhuǎn)錄性的 抗性(posttranscriptional resistance)機(jī)制，這是因一種以序列特異性方式針對病毒的 RNA 以及轉(zhuǎn)基因 mRNA 降解的 RNA 調(diào)節(jié)路徑所致(English et al. 1996 ；Lindboet al. 1993 ； Siien and Kooter 2000 ；Vaucheret et al. 1998)。PRSV 的外殼蛋白(coatprotein, CP)基 因通過粒子轟炸法(particle bombardment)予以轉(zhuǎn)移至木瓜中(Fitch etal. 1990)，并且 蹄選出對PRSV感染具有高度抗性的轉(zhuǎn)基因品系(Fitch et al. 1992 ；Lius et al. 1997)。轉(zhuǎn)基因木瓜自1998年起已成功地于夏威夷商業(yè)化(Gonsalves，2002 ；Tripathi etal. 2007)。在臺灣，帶有臺灣嚴(yán)重病毒株I3RSV (的CP基因的轉(zhuǎn)基因木瓜品系則通過 農(nóng)桿菌媒介的轉(zhuǎn)化方法(Agrobacterium-mediated transformation)已成功的被制造出 (Cheng et al. 1996)。當(dāng)前述轉(zhuǎn)基因木瓜被接種予PRSV (時，它們對病毒的反應(yīng)落在高 度易感性(high susceptibility)到具有完全抗性(complete resistance)的范圍內(nèi)(Bau et al. 2003) 0在溫室條件下，轉(zhuǎn)基因品系16-0-1、17-0-1、17_0_5以及18-2-4對于源自不 同地理來源的I3RSV具有廣泛的抗性(Bau et. al.，2003)，而于田野試驗(yàn)中則有高度的抗性(Bau et al. 2004)，顯示這些品系具有控制不同地理區(qū)域中的PRSV的能力。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)16-0-1、17-0-5以及18_2_4于植株生長至5公分高度時，會表現(xiàn) 高度的轉(zhuǎn)基因，然而其他諸如18-0-9、19-0-1則于相同階段完全沒有表現(xiàn)，可見16-0-1、 17-0-5以及18-2-4等轉(zhuǎn)基因木瓜品系中的轉(zhuǎn)基因插入于基因組的位點(diǎn)必然有其特殊性。 現(xiàn)有技術(shù)尚無法得知前述轉(zhuǎn)基因木瓜品系，特別是轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的轉(zhuǎn)基因插入 位置旁側(cè)的基因組序列，若能了解其插入基因組位置，將可針對各種品種的木瓜直接進(jìn)行 諸如以同源性的基因重組有效率的產(chǎn)生具有抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系，而無 需經(jīng)由長時間的篩選以及田間試驗(yàn)，以取得高抗病毒性的木瓜品系。另一方面，近年來，基因改造生物(genetically modified organism,GM0)的安全 性議題已引起相當(dāng)大的注意(Singh et al.，2006)。各國已經(jīng)實(shí)施各種不同的關(guān)于GM食物 認(rèn)證以及標(biāo)示(food apporval and labeling)的法規(guī)。歐盟法規(guī)第1830/2003條[European Union (EU) regulation (EC) No. 1830/2003]規(guī)定在生產(chǎn)至供應(yīng)鏈的市場中的各個階段必須 能夠追蹤基因改造生物及基因改造生物衍生的產(chǎn)品(EuropeanParliament and Council of European Union, 2003, p.1-5)。同樣的，臺灣對于基因改造作物(GM crop)的田間試驗(yàn)以及接續(xù)的品種權(quán)的法規(guī) 亦要求提供有關(guān)于特定轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因旁側(cè)的基因組序列的資訊。因此，用以鑒定特 定基因改造生物的具特異性且可信賴的方法對于符合法令規(guī)定而言是必要的，且對于監(jiān)測 未授權(quán)的基因改造生物的銷售與耕種而言是具有重要性的。因此，在此技術(shù)領(lǐng)域中，對于一種用以鑒定特定基因改造生物的方法存在有迫切 的需求，其中該方法對于前述的諸如16-0-1的轉(zhuǎn)基因木瓜品系而言必須是具有特異性、再 現(xiàn)性、高敏感度以及可信賴的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概要有鑒于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中的對于有效率的產(chǎn)生具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的 轉(zhuǎn)基因木瓜品系的需求，以及現(xiàn)有技術(shù)缺乏對于轉(zhuǎn)基因木瓜品系具有特異性的鑒定方法， 本發(fā)明的目的即在于解決現(xiàn)有技術(shù)必須經(jīng)由長時間的篩選以及田間試驗(yàn)，才能取得高抗病 毒性的木瓜品系的問題，以及提供針對轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1進(jìn)行鑒定的問題的各種相 關(guān)技術(shù)方案，例如具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系的核酸分子、相關(guān)轉(zhuǎn) 基因木瓜品系的檢測方法、引物、探針、試劑盒，而前述的技術(shù)方案對于16-0-1的轉(zhuǎn)基因木 瓜品系而言必須是具有特異性、再現(xiàn)性、高敏感度以及可信賴的。為了達(dá)到上述目的，在第一方面，本發(fā)明系提供一種分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán) 斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的核酸分子，其具有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū) 域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的 含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(PRSV CP gene)的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域包 含一與SEQ ID NO : 所示序列具有90%同源性的序列；左邊界旁側(cè)序列包含一與SEQ ID NO 31所示序列具有90%同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列系包括一木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白 基因以及一可操作的連結(jié)于木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因上游的啟動子。在第二方面，本發(fā)明系提供一種用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物，其系選自于由下列所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO : 所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個 連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO :31所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10 個連續(xù)序列的核酸片段。在第三方面，本發(fā)明系提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括 下列步驟提供一木瓜核酸樣品以及一引物對，其中該引物對包括一正向引物以及一反向引 物；令該木瓜核酸樣品與該引物對形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到 一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣 品含有源自于轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的基因組DNA ；其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO : 所示序列 之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列中的至少10個連 續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:31所示序列 的互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:33所示序列的互 補(bǔ)序列中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。發(fā)明的詳細(xì)說明在過去十年來，在夏威夷以及臺灣地區(qū)已成功培育出商業(yè)上可取得的轉(zhuǎn)基因木瓜 品系，其因帶有木瓜環(huán)斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)的外殼蛋白(coatprotein， CP)基因，而可具有對抗各種不同地域來源的PRSV病毒的廣泛性病毒抗性。然而要篩選出 一對木瓜環(huán)斑病毒具有高度廣泛穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系以現(xiàn)有技術(shù)的方法必須經(jīng)由 長時間的篩選、田間試驗(yàn)才能取得。有鑒于此，本發(fā)明利用分子生物技術(shù)成功解析出轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的含有 木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白的T-DNA插入的位點(diǎn)，并分析得到其右、左邊界旁側(cè)的基因組序列， 因而分離出一具有可適用于制造具有高度廣泛穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因木瓜的核酸分子，其具 有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁 側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(PRSV CP gene)的轉(zhuǎn)基 因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域包含一與SEQID NO 29所示序列具有同源性的序列；左邊界 旁側(cè)序列包含一與SEQ ID NO :31所示序列具有同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列系包括一 木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因以及一可操作的連結(jié)于木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因上游的啟 動子。另一方面，基于歐盟以及部分亞洲國家的法規(guī)對于基因改造生物的追蹤的 要求，本技術(shù)領(lǐng)域中迫切需要一種針對前述轉(zhuǎn)基因木瓜品系的事件特異性檢測方法 (event-specific detection)，此一事件特異性檢測方法具有高效率以及高靈敏度的特
點(diǎn)ο有鑒于此，本發(fā)明以聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)，針對rasv CP基因的轉(zhuǎn)基因木瓜品系的 特性研發(fā)出如前所述的檢測方法、引物及試劑盒。轉(zhuǎn)基因特異性產(chǎn)物可以通過使用針對轉(zhuǎn) 基因中的啟動子、終止子、篩選標(biāo)記以及轉(zhuǎn)基因的各種引物對予以擴(kuò)增出。此外，所述的利用接頭-接合聚合酶鏈反應(yīng)(adaptor ligation-PCR, AL-PCR)所擴(kuò)增出的植物基因組DNA 與T-DNA插入物之間的連接區(qū)域(junction)于本發(fā)明中被選殖(cloned)及定序。另外，本發(fā)明提供一種針對轉(zhuǎn)基因及其旁側(cè)序列的事件-特異性檢測方法，其系 可用于鑒定特定的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1。本發(fā)明中依據(jù)轉(zhuǎn)基因的左、右邊界的旁側(cè)序列 所設(shè)計(jì)出的引物，當(dāng)被使用于擴(kuò)增反應(yīng)中時，其所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的態(tài)樣系具有再現(xiàn)性 以及特異性。本發(fā)明亦證實(shí)I3RSV CP基因是插入至轉(zhuǎn)基因木瓜的基因組的不同位置中，且插 入的T-DNA的復(fù)本數(shù)目通過即時PCR被測定出。因此，本發(fā)明所提供的事件-特異性方法、 引物以及試劑盒對于法規(guī)要求需追蹤基因改造生物的國家以及對于保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)而言是 有用且重要的。此外，本發(fā)明所提供的方法、引物以及試劑盒有助于于育種計(jì)劃(breeding program)中迅速蹄選出純合子轉(zhuǎn)基因子代(homozygote-transgenic progeny)。依據(jù)本發(fā)明，用語“同源性(homology”意指二序列之間相關(guān)連的程度，其可以序列 間相同及/或保守(conservative)比率定的。由于核酸或氨基酸序列的變異并不必然影 響其所構(gòu)成的特性，因此只要核酸或其編碼出的氨基酸序列具有一定程度的同源性而不影 響核酸序列的特性或該蛋白質(zhì)的活性，即為本發(fā)明所涵蓋，上述一定程度的同源性優(yōu)選是 至少90%。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1 的核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，其中該啟動子為花椰菜鑲莰病毒35S啟動子(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter, CaMV 35S promoter)。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1 的核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，其中該轉(zhuǎn)基因序列系包含一與SEQ ID N0:34所示序列具有 90%同源性的序列。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的 核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，如前所述的核酸分子，其是由下列者所構(gòu)成一位于5’端的右 邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè) 區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域具有如 SEQ ID NO 29所示序列；左邊界旁側(cè)序列具有如SEQID NO 31所示序列；而該轉(zhuǎn)基因序列 具有如SEQ ID NO 33所示序列。依據(jù)本發(fā)明的方法，所述的用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物系選自于由下列 所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO 29所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列 的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO 31所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序 列的核酸片段。優(yōu)選的，前述引物是選自于由下列所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO : 所示序 列或其互補(bǔ)序列之中的至少15個連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQID NO :31所示序 列或其互補(bǔ)序列之中的至少15個連續(xù)序列的核酸片段。依據(jù)本發(fā)明的方法，前述用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物優(yōu)選的是選自于由 下列引物所構(gòu)成的群組Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；以及Papa57引 物，其具有如SEQ ID N0:20所示序列。依據(jù)本發(fā)明，“引物(primer)”可以利用此技術(shù)領(lǐng)域中所知的任何化學(xué)或生化的 合成方法制備。例如，當(dāng)引物為核酸所構(gòu)成時，其可通過遺傳工程領(lǐng)域中常見的核酸合成方法制備。例如，核酸可通過使用DNA合成儀直接合成。而為了使得到的核酸可于細(xì)胞 內(nèi)較為穩(wěn)定，可進(jìn)一步針對核酸的堿基、醣基以及磷酸部分進(jìn)行化學(xué)性修飾，諸如烷基化 (alkylation)、?；?acylation)或其他類似作用。用語“探針”意指可產(chǎn)生可辨識特定序列并且可產(chǎn)生供檢測的信號的材料，如此處 所示用的探針包括經(jīng)標(biāo)記的核酸片段，其中該標(biāo)記包括但不限于放射性物質(zhì)、熒光染料以
及受質(zhì)專一性酵素等。依據(jù)本發(fā)明的用于檢測轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸 樣品以及一引物對，其中該引物對包括一正向引物以及一反向引物；令該木瓜核酸樣品與 該引物對形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測擴(kuò)增 反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣品含有源自于轉(zhuǎn)基 因木瓜品系16-0-1的基因組DNA;其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具 有如SEQ ID NO 29所示序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個連 續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO 33介于第4468至M68核苷酸位點(diǎn)的序列 之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個連續(xù)序列的核酸片段；以及該反 向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO :31所示序列的互補(bǔ)序列之 中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有 如SEQ ID NO 33介于第1至1000核苷酸位點(diǎn)的序列的互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序 列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個連續(xù)序列的核酸片段。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施例中，前述的正向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群 組Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID N0:13所示 序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID NO :21所示序列；以及m引物，其具有如SEQ ID NO :16所示序列；而反向引物系選自于 由下列引物所構(gòu)成的群組S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示序列；Papa27引物，其具有 如 SEQ IDNO :12 ；以及 Papa57 引物，其具有如 SEQ ID NO :20。依據(jù)本發(fā)明，所述的擴(kuò)增片段(amplified fragment)意指利用前述引物以核酸樣 品為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)所擴(kuò)增出的特定片段，例如使用Papa31引物(SEQ IDNO 17)為 正向引物以及Papa27引物(SEQ ID NO 12)為反向引物，以轉(zhuǎn)基因木瓜品系16_0_1的基因 組DNA為模板，于適當(dāng)?shù)木酆厦告湻磻?yīng)條件下，則可擴(kuò)增出一 241堿基對的擴(kuò)增片段。依據(jù)本發(fā)明，所述的聚合酶鏈反應(yīng)混合物如此技術(shù)領(lǐng)域所知的包括引物、模板、聚 合酶、去氧核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP)以及反應(yīng)緩沖液，并可 進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的聚合酶鏈反 應(yīng)混合物更包含一染料，該染料系可與擴(kuò)增片段結(jié)合，并且接受適當(dāng)?shù)臒晒饧ぐl(fā)而放出可 檢測的熒光信號，例如，但不限于SYBR Green0依據(jù)本發(fā)明，所述的木瓜核酸樣品系可通過任何本技術(shù)領(lǐng)域中已知的核酸萃取方 法從木瓜的各個器官、部位(諸如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等)所制得。優(yōu)選的是從木瓜的 葉部利用溴化鯨蠟基三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)純化而得。依據(jù)本發(fā)明，檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物優(yōu)選的系包括通過電泳分析以及直接檢測擴(kuò)增反 應(yīng)的熒光信號等方式進(jìn)行，其中直接檢測擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號的方式系包括檢測經(jīng)染料標(biāo)記的特異性探針或使用SYBR Green等染料經(jīng)適當(dāng)熒光激發(fā)后所發(fā)射出的熒光信號。


圖1顯示轉(zhuǎn)基因木瓜品系中的T-DNA的旁側(cè)區(qū)域，其中圖1 (a)區(qū)顯示位于木瓜基 因組內(nèi)的T-DNA插入物，圖1 (b)區(qū)顯示右邊界旁側(cè)的基因組序列的擴(kuò)增策略，以及圖1 (c) 區(qū)顯示左邊界旁側(cè)的基因組序列的擴(kuò)增策略。圖2利用類型1、2、3的PCR檢測鑒定轉(zhuǎn)基因木瓜品系；其中圖2(a)區(qū)顯示針對35S啟動子的類型1檢測的結(jié)果，其利用35S啟動子特異性引 物對35S-F/35S-R擴(kuò)增而得一 836堿基對的產(chǎn)物；圖2(b)區(qū)顯示針對nptll的類型1檢測的結(jié)果，其利用nptll特異性引物對 npt-l/npt-2擴(kuò)增而得一 8 堿基對的產(chǎn)物；圖2(c)區(qū)顯示針對nos終止子之類型1檢測的結(jié)果，其利用nos終止子特異性引 物對nos-l/nos-2擴(kuò)增而得一 1 堿基對的產(chǎn)物；圖2(d)區(qū)顯示針對轉(zhuǎn)基因的類型2檢測的結(jié)果，其利用I5RSV CP基因特異性引物 對PRSV-F/PRSV-R擴(kuò)增而得一 840堿基對的產(chǎn)物；以及圖2(e)區(qū)顯示針對CaMV 35S啟動子以及I3RSV CP轉(zhuǎn)基因的類型3檢測的結(jié)果， 其利用引物對35S-F/PRSV-R擴(kuò)增而得一 700堿基對的產(chǎn)物。圖3顯示T-DNA右邊界/木瓜基因組DNA連接區(qū)域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其右邊界是以小寫表示，SspI的辨識位點(diǎn)(ATT)如箭頭標(biāo)示，此外Apl、Ap2、Papa27、 Papa31以及Papa32等引物位置如圖所標(biāo)示；其中圖3(a)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA右邊界的基因組旁側(cè)序 列(SEQ ID NO 29)；以及圖3 (b)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系18-2-4的T-DNA右邊界的基因組旁側(cè)序列(SEQ IDNO 30)。圖4顯示T-DNA左邊界/木瓜基因組DNA連接區(qū)域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其左邊界是以小寫表示，DraI以及EcoRV的辨識位點(diǎn)(TTT以及GAT)分別如箭頭標(biāo)示， 此外Apl、Ap2、Papa52、Papa56、Papa57、Papa58 Papa59以及附等引物位置如圖所標(biāo)示；其 中圖4(a)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA左邊界的基因組旁側(cè)序 列(SEQ ID NO 31)；以及圖4(b)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系18-2-4的T-DNA左邊界的基因組旁側(cè)序列(SEQ IDNO 32)。圖5顯示轉(zhuǎn)基因木瓜品系的事件特異性檢測，其是利用對基因組旁側(cè)序列以及 T-DNA序列具有特異性的引物對產(chǎn)生跨越T-DNA右邊界以及植物基因組的DNA產(chǎn)物或者跨 越T-DNA左邊界以及植物基因組的DNA產(chǎn)物；其中圖5 (a)區(qū)顯示針對16-0-1品系(右邊界)利用引物對Papa31/Papa27擴(kuò)增出一 241堿基對的特異性產(chǎn)物；圖5 (b)區(qū)顯示針對18-2-4品系(右邊界)利用引物對Papa32/Papa27擴(kuò)增出一 384堿基對的特異性產(chǎn)物；
圖5 (c)區(qū)顯示針對16-0-1品系(左邊界)利用引物對Papa56/Papa57擴(kuò)增出-106堿基對的特異性產(chǎn)物；圖5 (d)區(qū)顯示針對18-2-4品系(左邊界)利用引物對Papa58/Papa59擴(kuò)增出-140堿基對的特異性產(chǎn)物；
及

圖5(e)區(qū)顯示利用引物對Papa31/Papa57擴(kuò)增出一 227堿基對的特異性產(chǎn)物；以
圖5 (f)區(qū)顯示利用引物對Papa32/Papa59擴(kuò)增出一 345堿基對的特異性產(chǎn)物。 圖6顯示利用Southern印跡分析測定PRSV CP轉(zhuǎn)基因復(fù)本數(shù)目。 圖7顯示I3RSV CP轉(zhuǎn)基因的即時PCR擴(kuò)增圖，其中to數(shù)值差值(delta Rn value) 以報(bào)導(dǎo)子染劑從TaqMan :探針被釋放出來時的經(jīng)歸一化的熒光發(fā)射表示；其中圖7 (a)區(qū)顯示16-0-1雜合子Ttl植物體的典型擴(kuò)增曲線圖7 (b)區(qū)顯示16-0-1純合子T1植物體的典型擴(kuò)增曲線圖7 (c)區(qū)顯示18-2-4雜合子Ttl植物體的典型擴(kuò)增曲線；以及圖7(d)區(qū)顯示18-2-4純合子T1植物體的典型擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例來作說明，但應(yīng)明了的是，該等實(shí)施例僅為說 明之用，而不應(yīng)被視為本發(fā)明的實(shí)施上的限制。實(shí)施例一般材料與方法1.植物材料下述實(shí)施例中所使用的植物材料是具有rasv的CP基因以及對rasv具高度抗性 的轉(zhuǎn)基因木瓜(Cheng et al.，1996)，其中包括16-0-1、17-0-5以及18-2-4品系的T0植物 體以及16-0-1以及18-2-4品系雜合子或純合子子代的T1植物體，其皆以組織培養(yǎng)的方式 進(jìn)行微體繁殖(micropropagated) (Yang et al.，1996)。使用作為比較的非轉(zhuǎn)基因的物種 (varieties)為臺農(nóng)一號(Tainung No. 1，1^1)、臺農(nóng)二號(TainungNo. 2，TN2)、臺農(nóng)五號 (Tainung No. 5, TN5)、臺農(nóng)六號(Tainung No. 6, TN6)、日升(Sunrise)、紅妃(Red Lady)、 穗中紅(Red Ear)、馬大瓜(Mai Tai Kua)以及泰國(Thailand)。它們的種苗是由位于臺 灣行政院農(nóng)委會農(nóng)業(yè)試驗(yàn)所(Taiwan AgriculturalResearch Institute, TARI)的鳳山熱 帶園藝試驗(yàn)分所(Fengshan Tropical HorticulturalExperiment Branch)所提供。轉(zhuǎn)基 因品系與非轉(zhuǎn)基因品種的植物是于TARI附設(shè)的溫室中培育生長。2.木瓜基因組 DNA (genomic DNA)純化木瓜基因組DNA是從0. 5g轉(zhuǎn)基因木瓜品系以及非轉(zhuǎn)基因物種的新鮮葉片中所純 化出，其是以Dolyle等人所使用的方法(Doyle and Doyle, 1990)利用溴化鯨蠟基三甲基 銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)(SIGMA-ALDRICH Inc.，St. Louis, MO, USA) 純化而得。將聚乙烯基吡咯并吲哚[poly (vinylpolypyrrolidone)，PVPP) (SIGMA-ALDRICH Inc.)予以加入至萃取緩沖液，用以增加萃取的DNA的純度。DNA濃度通過光譜儀(U-3000 Spectrophotometer, Hitachi Instruments Inc. , SanJose, CA, USA)予以評估測量 OD260, 而DNA品質(zhì)是利用瓊脂醣凝膠進(jìn)行分析。
3.利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的轉(zhuǎn)基因特異性檢測作為類型1 的鑒定，引物對 35S-F/35S-R、npt-l/npt-2 以及 nos-l/nos-2， 如表1所示，分別被使用來檢測花椰菜鑲莰病毒35S啟動子(Cauliflower mosaic virus 35Spromoter, CaMV 35S promoter)、康納霄素蹄選標(biāo)記基因 npt II (kanamycin selectionmarker gene nptll)以及 i若中白林合成 Sl 終 it 子(nopaline synthase terminator, nosterminator) (Hoist-Jensen et al.,2003)。對于類型 2 鑒定，是使用如表 1所示的對PRSVCP基因序列具有特異性的引物對PRSV-F/PRSV-R(Bau et al.，2003)。對于 類型3鑒定，是使用對35S啟動子(35S promoter)具有特異性的引物對以及對I3RSV CP基 因具有特異性的引物對35S-F/PRSV-R。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物(最終體積30 μ L)含有USng HIS.DNA (template DNA) UR^] 1. 2unit FastStart Polymerase (RocheDiagnotics GmbH, Penzberg, Germany) ,2. 5mM MgCl2、200yM dNTP 以及 0. 2 μ M 引物，它們系配于 PCR 緩沖液 (50mM KCl ；IOmM Tris-HCl，pH9. 0 ；0. 1 % TritonX-100)中。PCR是以包括下列步驟的 30 個 循環(huán)利用一熱循環(huán)機(jī)(thermocycler) (Gene Amp PCR System 9700,Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)進(jìn)行于94°C下歷時1分鐘，用以裂解(melting)，于不同的黏合溫 度下歷時1分鐘，用以黏合(annealing)，以及于72°C歷時2分鐘，用以合成(synthesis)。 PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂醣凝膠于TAE緩沖液(Tris acetate, pH8. 0 ； ImM EDTA)中以電泳進(jìn) 行分析。PCR產(chǎn)物直接使用 310 Genetic Analyzer (ABI PRISM ,Applied Biosystems)予 以定序。PCR延長作用(PCR elongation)的定序過程是進(jìn)行于前述熱循環(huán)機(jī)中歷經(jīng)25個循 環(huán)。最后的延長作用之后，該定序的產(chǎn)物接而被沉淀、萃取以及復(fù)溶(redissolved)于定序 電泳緩沖液(sequencing running buffer) (Hi-Di Formamide,Applied Biosystems)。樣 品接而利用61公分毛細(xì)管被裝載至ABI 310，以進(jìn)行定序。Lasergen Software (DNASTAR, 2001，DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)被使用來排列比較(align)擴(kuò)增的序列與特定的已 知序列。表1本發(fā)明中所使用的引物的序列及其黏合溫度
權(quán)利要求
1.一種分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的核酸分 子，其具有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右 邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其 中右邊界旁側(cè)區(qū)域包含一與SEQ ID NO : 所示序列具有90%同源性的序列；左邊界旁側(cè) 序列包含一與SEQ ID NO :31所示序列具有90%同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列系包括一 木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因以及一可操作的連結(jié)于木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因上游的啟 動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該啟動子為花椰菜鑲崁病毒35S啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該轉(zhuǎn)基因序列進(jìn)一步包括一抗生素抗性基因 以及一終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該轉(zhuǎn)基因序列系包含一與SEQID N0:33所 示序列具有90%同源性的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其是由下列者所構(gòu)成一位于5’端的右邊界旁側(cè) 區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間 的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域具有如SEQ ID NO 29所示序列；左邊界旁側(cè)序列具有如SEQ ID NO 31所示序列；而該轉(zhuǎn)基因序列具有如SEQ ID NO 33所示序列。
6.一種用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物，其系選自于由下列所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO : 所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片 段；以及一具有如SEQ ID NO :31所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組Papa31引物，其 具有如SEQ ID NO 17所示序列；以及Papa57引物，其具有如SEQ ID NO 20所示序列。
8.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸樣品以及一引物對，其中該引物對包括一正向引物以及一反向引物；令該木瓜核酸樣品與該引物對形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò) 增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣品含 有源自于轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的基因組DNA ；其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO : 所示序列之中 的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列中的至少10個連續(xù)序 列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:31所示序列的互 補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列的互補(bǔ)序 列中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一 具有如SEQ ID NO : 所示序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33介于第4468至討68核苷酸位點(diǎn)的序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:31所示序列的互 補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:33介于第1至1000核 苷酸位點(diǎn)的序列的互補(bǔ)序列之中的至少10個連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組Papa31引物，其具有如SEQ IDNO 17 所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID NO 13所示序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO: 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID NO :21所示序列；以及m引物，其具有 如SEQ ID NO 16所示序列；而該反向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示 序列；Papa27引物，其具有如SEQ ID NO 12 ；以及Papa57引物，其具有如SEQ ID NO :20。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物為Papa31引物，其具有如SEQID NO 17所示序列；反向引物為Papa27引物，其具有如SEQ ID NO :12所示序列，而該擴(kuò)增片段的 預(yù)定大小為241堿基對。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物為Papa56引物，其具有如SEQID NO 19所示序列，反向引物為Papa57引物，其具有如SEQ ID NO :20所示序列，而該擴(kuò)增片段的 預(yù)定大小為106堿基對。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該木瓜核酸樣品來源系單一木瓜植物體；該正向 引物為Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；而反向引物為Papa57引物，其具有 如SEQ ID NO :20所示序列；并且該擴(kuò)增反應(yīng)系包括使用一聚合酶于具有一介于55至65°C 的黏合溫度的聚合酶鏈反應(yīng)條件下進(jìn)行；以及檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步包括檢測一 227 堿基對的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜植物體非為純合子轉(zhuǎn)基因木瓜品系。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的核酸分子及其檢測方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸樣品以及一引物對；令該木瓜核酸樣品與該引物對形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中當(dāng)有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該樣品含有轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的DNA。本發(fā)明也提供用于檢測轉(zhuǎn)基因木瓜品系16-0-1的引物、探針以及試劑盒。前述序列、方法、引物以及試劑盒有助于符合法規(guī)要求、知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)及迅速篩選出純合子轉(zhuǎn)基因子代。
文檔編號C12N15/40GK102071208SQ20091022618
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者包慧俊, 葉錫東, 蘇天財(cái), 范宗宸, 鄭櫻慧, 陳述, 龔怡蓉 申請人:包慧俊, 葉錫東, 蘇天財(cái), 范宗宸, 鄭櫻慧, 陳述, 龔怡蓉