專利名稱：一種醬香型白酒大曲的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白酒大曲中微生物的提取方法，特別是醬香型白酒大曲中真菌 DNA和細(xì)菌DNA的提取方法以及用該方法在鑒定白酒方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大曲是指含有大量能發(fā)酵的活微生物或酶類的糖化發(fā)酵劑。制曲技術(shù)是我國特有 的一份民族遺產(chǎn)，在曲與酒的關(guān)系上，曲是占先導(dǎo)地位的。俗語說“有美酒必備佳曲”，“曲為 酒骨”。而且更重要的是關(guān)系到香型風(fēng)味的重要成因。曲中的微生物不同，香型就不同，選 育優(yōu)良菌種應(yīng)用于白酒釀造一直是行業(yè)技術(shù)工作的重點(diǎn)。目前醬香白酒大曲中微生物的研究，主要是應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離、純化、鑒定等方 法。傳統(tǒng)的研究方法是首先從特定自然環(huán)境(如大曲房)中取樣，采用模擬自然環(huán)境的各 種培養(yǎng)基和條件進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過純培養(yǎng)獲得菌株后，再對其表型特征、細(xì)胞的性質(zhì)(形 態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)的觀察)進(jìn)行觀察收集，同時(shí)進(jìn)行一系列繁雜的 形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)，才能對其特性進(jìn)行描述，這種方法又被稱作經(jīng)典方法。應(yīng)用傳統(tǒng)方法可以分離培養(yǎng)的微生物不一定是優(yōu)勢菌群，只是它們適合并能夠在 人工培養(yǎng)條件下被分離純化，不能動態(tài)反映大曲微生物菌群的生長狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，大 曲研究仍停留在細(xì)胞水平，主要研究細(xì)菌、霉菌、酵母和放線菌單一的菌落形態(tài)和純種的生 長特性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正 概貌。因此傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的方法制約了人們對微生物生態(tài)的客觀認(rèn)識，對于人們正確認(rèn) 識微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，正確認(rèn)識微生物資源，正確開發(fā)并利用這些資源造成了嚴(yán)重的 障礙。變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用于基因的突變檢測，任意位點(diǎn)的單堿基突變 的DNA片段和原始的DNA片段能被分開，經(jīng)過序列測定和比較就可以找出突變的位點(diǎn)。變 性梯度凝膠電泳對不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長度但具 有不同序列的DNA片段能夠被分離，因?yàn)樵诤谐示€形增加梯度變性劑(尿素和甲酰胺) 的混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不 同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)自1993年以來被用于環(huán)境微生物領(lǐng)域來研究環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，它是 建立在PCR反應(yīng)對環(huán)境樣品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核 生物)等保守基因區(qū)間的DNA片斷的擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，這些被擴(kuò)增出的DNA片斷可以代表所 有不同微生物的信息，這些使用同一引物對擴(kuò)增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的堿 基數(shù)，因此一般的電泳無法將它們分離開，這就為后續(xù)的進(jìn)一步研究提出了新的問題。由 于變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同堿基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以 PCR-DGGE可以對環(huán)境樣品中的微生物群落進(jìn)行研究。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行醬香白酒大曲微生物群落構(gòu)成研 究的相關(guān)報(bào)道。然而醬香大曲與城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環(huán)境下的樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分 析時(shí)存在差異。由于醬香高溫大曲樣品中所含的成分復(fù)雜，含有多量的蛋白質(zhì)、氨基酸和多 糖等成分，微生物種類繁多，從中提取出高質(zhì)量的微生物總DNA的難度較大。經(jīng)過多次的實(shí) 驗(yàn)最終找到一種適合醬香高溫大曲的總DNA的提取方法，為了除去蛋白，以及多糖等雜質(zhì)， 本發(fā)明的方法只用氯仿抽提即可，用70%冷乙醇沖洗所得沉淀，節(jié)省時(shí)間，成本低，可以對 醬香大曲中的各種菌的總DNA無偏好的進(jìn)行提取。找到了利用PCR-DGGE技術(shù)對醬香白酒 大曲進(jìn)行鑒定的方法。本發(fā)明通過DNA的提取發(fā)現(xiàn)了醬香型白酒大曲中的優(yōu)勢菌群，包括真菌優(yōu)勢菌群 和細(xì)菌優(yōu)勢菌群。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以用于白酒的鑒定，如將待測白酒樣品通過提取總DNA確定優(yōu)勢 菌群，和已經(jīng)確定的白酒優(yōu)勢菌群(材料里有)進(jìn)行比對，以判斷待測白酒的種類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種白酒大曲的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟1)取已知類型的大曲樣品；用方法1進(jìn)行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜 進(jìn)行聚類及半定量分析；用方法2進(jìn)行總DNA序列測定，確定優(yōu)勢真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。2)取已知類型的大曲樣品；用方法1進(jìn)行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜 進(jìn)行聚類及半定量分析；用方法2進(jìn)行總DNA序列測定，確定優(yōu)勢真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。3)將待測樣品與已知類型的大曲的優(yōu)勢菌群比對，兩者相符為同類型。其中所述方法1包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA;以總DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE指紋圖譜；其中所述方法2包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，根據(jù)方法1的指紋圖譜聚類及半定量分析結(jié)果，回 收優(yōu)勢條帶，并以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對目的片段進(jìn)行序列測定；經(jīng)過以上測定方法測定，醬香白酒大曲中細(xì)菌的優(yōu)勢菌群是 Unculturedbacterium, Virgibacillus sp. , Bacillus sp.禾口 Thermoactinomyces sp.。 醬香白酒大曲中真菌的優(yōu)勢菌群是Saccharomyces sp. , Saccharomycopsis fibuligera strain和Mucor sp.。四個優(yōu)勢細(xì)菌的菌量比例是2 :1:1: 2 ；優(yōu)勢真菌菌量比例是 1:1: 4;優(yōu)勢細(xì)菌優(yōu)勢真菌的菌量比是4 1.5。本發(fā)明特別適合醬香白酒大曲的鑒定。本發(fā)明的方法，其中所述總DNA可以使樣品中真菌的總DNA，也可以是細(xì)菌的總 DNA，真菌DNA提取方法是提取緩沖液提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉淀過夜 ’離 心。其中提取緩沖液的加量是樣品量的3-6倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙 醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍。細(xì)菌DNA提取方法是提取緩沖液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提兩 次；異丙醇沉淀過夜。其中提取緩沖液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和 25mg/mL溶菌酶的加量分別是50-100 μ 1和0. 5_lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量 是上清液體積的0. 6-0. 7倍。
本發(fā)明的方法中，方法1中所述擴(kuò)增包括，以樣品的真菌的總DNA或細(xì)菌的總DNA 為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對目的片段進(jìn)行回收及純化。對于真菌總DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為(ie0A2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll :5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘。PCR 擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增先加入擴(kuò)增18S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增； PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s, 50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s， 50-55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35次，72°C終延伸IOmin0對于細(xì)菌總DNA 的 PCR 擴(kuò)增，其專用引物為 8-27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和1378-1401R 5，-TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增先加入擴(kuò)增16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變 性45s，50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取 其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件 為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循 環(huán) 30-35 次，72°C終延伸 IOmin0本發(fā)明所述序列測定，是對純化的目的片段進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，其點(diǎn) 樣量為600-1000ng，用E.B(溴化乙錠)染色后得到測序用指紋圖譜。為避免條帶缺失，可 先通過預(yù)試得到DGGE適宜的丙烯酰胺濃度梯度范圍及所用時(shí)間。制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為20^,40^,60%,80%，使用的 電泳緩沖液為0. 5XTAE，上樣量為200ng，電壓80-120V，60°C，電泳10h，溴化乙錠染色 20-30min，可得出清晰準(zhǔn)確的DGGE圖譜(見圖1)。得出制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變 性梯度為35% 60%。將電泳時(shí)間分別確定為4hJh，8h，10h, 12h，14h，16h，每隔4h進(jìn)樣一次，上樣量為 200ng，電壓80V，溫度60°C，得到DGGE譜圖(見圖2)?？梢源_定所用時(shí)間可以為8_12h。本發(fā)明所述對真菌DNA進(jìn)行的DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析，可確定醬香白酒 大曲不同生產(chǎn)時(shí)期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系及各個條帶所代表的真菌在全部優(yōu)勢真菌菌群中 的比例，即相對豐度。對細(xì)菌DNA進(jìn)行的DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析，可確定醬香白 酒大曲不同生產(chǎn)時(shí)期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系及各個條帶所代表的細(xì)菌在全部優(yōu)勢菌群中的 比例，即相對豐度；兩種微生物均可用Bio-ID++軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算公式為相對豐度Pi ) =lOOXODi/OD，其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶的光密度之和。本發(fā)明方法2中，根據(jù)DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析結(jié)果，回收相對豐度高于 的優(yōu)勢條帶，并以此為模板，在不含GC夾子的專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)
束后，對目的片段進(jìn)行回收、純化及測序。其中對于真菌DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3‘。為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上 游引物的5，端還添加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上游引物序NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'。其中對于細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為968FGC :5，-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3'禾P R1041 5’ -CGGTGTGTACAAGACCC-3’。為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上游引物的5’端還添 加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上游引物序968TOC :5，-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3，。本發(fā)明所述比較可采用Blast程序在線(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/)對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對分析，確定大曲優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的鑒定方法適用于所有釀造用曲，如釀酒用的高溫大曲，中溫大曲，低溫大 曲，小曲等及其醬油，醋等釀造過程中所有微生物的菌群分析和優(yōu)勢菌群的確定。優(yōu)選適用 于釀醬香高溫大曲，濃香高溫曲，中溫曲等。進(jìn)一步優(yōu)選適用于醬香型的白酒大曲，最優(yōu)選 適用于醬香型白酒高溫大曲。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用本發(fā)明直接提取醬香大曲樣品中的總DNA進(jìn)行鑒定，避免了在傳統(tǒng)培養(yǎng)過程 中的篩選和富集作用，能更直接真實(shí)地反應(yīng)大曲樣品中的微生物多樣性及種群分布情況， 較傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離和鑒定也更為簡易、準(zhǔn)確，尤其在大曲的鑒定上利用優(yōu)勢微生物的確定就 可以對大曲進(jìn)行鑒定。針對大曲有機(jī)物質(zhì)含量比環(huán)境中的多且成分復(fù)雜，在DNA提取過程中酚-氯 仿-異戊醇(體積比，25 24 1)抽提，異丙醇沉淀過夜，就能很好的提取總DNA，不經(jīng)試 劑盒純化直接用于后續(xù)的分子生物學(xué)分析。可以對醬香大曲中的各種細(xì)菌的總DNA無偏好 的進(jìn)行提取。大曲微生物中的數(shù)量一般在IO6-IO7,比環(huán)境中土壤和污泥中的數(shù)量相對少一些， 因此進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增；通過梯度凝膠電泳技術(shù)，可在適宜條件下對不同菌群實(shí)施分離。用 快速銀染法獲得DGGE指紋圖譜，通過E. B染色獲取測序用指紋圖譜，在一定程度上克服了 可恢復(fù)性銀染技術(shù)的不確定性；結(jié)合Bio-ID++軟件對優(yōu)勢菌群進(jìn)行半定量分析，以及通過測序比對完成的菌群 定性分析，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，逐步克服了常規(guī)的人工培養(yǎng)法對大曲菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的不 足。此方法除了可以醬香白酒大曲進(jìn)行鑒定外，還可以對不同區(qū)域不同大曲種類進(jìn)行 微生物群系分析?？朔诵枰泄俸透鞣N理化指標(biāo)來進(jìn)行模糊判斷的大曲鑒定方法。


圖1不同變性濃度的DGGE譜2不同時(shí)間下的DGGE譜3醬香高溫大曲生產(chǎn)過程及不同質(zhì)量成品曲中細(xì)優(yōu)勢真菌菌群及PCR-DGGE譜 圖E—出倉曲B—黑曲 Y—黃曲 W-白曲 S— 二次翻曲 0— —次翻曲I—入倉曲 M-母曲圖4醬香高溫大曲生產(chǎn)過程中細(xì)菌的優(yōu)勢菌群及PCR-DGGE譜圖
圖5醬香成品曲的PCR-DGGE譜圖Y-黃曲 M-母曲 B-黑曲 W-白曲圖6不同大曲樣品的PCR-DGGE譜圖
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1一、真菌 DNA1、準(zhǔn)備樣品對貴州茅臺鎮(zhèn)金士酒業(yè)有限公司醬香白酒大曲生產(chǎn)車間生產(chǎn)的大曲進(jìn)行取樣，在 制曲過程中按一個周期中的不同時(shí)間取樣，本實(shí)驗(yàn)用的醬香高溫大曲樣品是在貴州茅臺鎮(zhèn) 金士酒業(yè)有限公司大曲生產(chǎn)車間取樣。2、總DNA的提取及純化取3-6g 大曲 +25mL 磷酸緩沖液(ρΗ8· 0) +0. 1 % PVPP，+ImL 土 溫(80 或 60)搖 床30min,超聲6-7min,靜置2_5min，，沉淀低速(IOOOrpm)離心5min，取出上清，混合， 高速(9000rpm)離心8min，去除上清，再加入磷酸緩沖液(PVPP)，25mL，打散后高速離心 (9000rpm) 8min，去上清。加10-15mL提取液(提取液成分是100mM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽 酸鹽)ρΗ8· 0，IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)ρΗ8· 0，200mM NaCl,l% PVP,2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)pH8.0)，搖勻。在180run/min，37°C條件下振蕩30min，加 2mL 20% SDS繼續(xù)振蕩lOmin。65°C水浴Ih后6000g離心15min，收集上清液，加0. 5倍體 積PEG (聚乙二醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)，混勻后室溫下靜止2h，在IOOOOg離心20min, 加4MNaAC(pH5.4)至終濃度0. 3mol/L，用酚-氯仿-異戊醇(體積比，25 24 1)抽提一 次，0. 6倍體積異丙醇沉淀過夜，12000g離心20min，沉淀干燥后，20-200 μ L TE溶解，-20V 冰箱中保存?zhèn)溆??；蚪MDNA的純化方法為采用美國OMEGA BIO-TEK公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑 盒，按照用戶使用說明來進(jìn)行。3、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收、純化對純化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第一步擴(kuò)增采用的引物為GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘和 Geo11 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘第二步擴(kuò)增采用的引物為NS31_GC 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3 ‘ Glo 1:5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3‘。以上引物全部由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。先加入擴(kuò)增18S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，50 μ 1的PCR反 應(yīng)體系組成如下=IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引物、1 μ 1 dNTPs、5 μ 1的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2U. 5-3U 的 Taq DNA 聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足 50 μ 1。 PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù) 性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸IOmin, 16S rDNA全長序列擴(kuò)增產(chǎn)物用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA為目標(biāo)進(jìn)行 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，55°C引物復(fù)性45s，72°C引 物延伸lmin，循環(huán)35次，72°C終延伸lOmin，目的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩 沖液為IXTAE緩沖液。取全部樣品進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(80V，50min)，在紫外燈下切膠回收230bp的 目的條帶，用CyCle-Pure DNA純化試劑盒并按照試劑盒說明書對目的片段進(jìn)行純化，純化 后取3ul純化產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果表明獲得了純度較高的目的 片段。4、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析采用DCODE 系統(tǒng)(BIO-RAD)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為將等量的步驟三獲 得的樣品的18S擴(kuò)增純化產(chǎn)物(約230bp)混合，取200ng用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳 進(jìn)行分離(丙烯酞胺濃度0-100%，電泳緩沖液0.5 χ TAE，80V，Wh)，然后切下目的泳道區(qū) 域，用E. B對變性聚丙烯酞胺凝膠染色，用Vilber凝膠成像掃描系統(tǒng)對銀染條帶進(jìn)行照像， 結(jié)果如圖1所示，對圖1進(jìn)行分析，確定適宜的DGGE丙烯酰胺濃度范圍為35% -60%。再 取混合DNA樣品，按IOOng點(diǎn)樣量、200ng點(diǎn)樣量(3個平行)及300ng點(diǎn)樣量在上述丙烯酰 胺適宜的濃度范圍內(nèi)用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，其余操作同上。在Vilber 凝膠成像掃描系統(tǒng)中對銀染條帶進(jìn)行照像，結(jié)果顯示IOOng點(diǎn)樣量的泳道損失2條條帶， 200ng點(diǎn)樣量與300ng點(diǎn)樣量所得到的指紋圖譜一致，并且200ng點(diǎn)樣量3個平行樣的指紋 圖譜完全一樣，表明DGGE技術(shù)具有可重復(fù)性。取相同的點(diǎn)樣量200ng，做DGGE譜圖，找出最 佳電泳時(shí)間，見圖2，圖中可以看出IOh時(shí)，條帶最清晰，因此選用DGGE時(shí)間為10h。上述預(yù)試結(jié)果表明，將各樣品18S擴(kuò)增純化產(chǎn)物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙 烯酞胺濃度35% -60%，電泳緩沖液0. 5-1 χ TAE)，100V, 12h，樣品點(diǎn)樣量200ngDNA(重復(fù) I)、另設(shè)一組點(diǎn)樣量IOOOng DNA(重復(fù)II)。將重復(fù)I所在泳道區(qū)域切下，用快E. B染法對其進(jìn)行染色。在vilber凝膠成像掃 描系統(tǒng)中對染色條帶進(jìn)行照像，照相結(jié)果及其模式圖見附圖3所示，用BiO-ID++軟件對該 DGG E指紋圖譜進(jìn)行半定量分析，確定醬香高溫大曲生產(chǎn)過程中菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系及各個條 帶所代表真菌群在全部優(yōu)勢菌群的比例，即相對豐度，相對豐度？“％) = 100 X0D./0D其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶光密度之和。表1 ISSrDNA擴(kuò)增純化產(chǎn)物DGGE指紋圖譜中醬香高溫大曲在生產(chǎn)過程中及不同 質(zhì)量成品曲真菌優(yōu)勢菌群相對豐度(％ )條帶位置E B Y W S 0 I M1———————5. 02———9. 5——9. 5—3——————4. 5—49. 0——9. 5—9. 59. 5—5—————5. 0——6————9. 0 ———
7— — 6. 5 — — — — —將重復(fù)II所在泳道區(qū)域切下，按E. B染色。5、優(yōu)勢條帶的回收、測序與序列比對分析在紫外燈下將重復(fù)II所在泳道的明顯條帶用無菌手術(shù)刀小心割下，并在銀染 圖譜中標(biāo)記相應(yīng)位置，經(jīng)無菌水沖洗3遍后放入1. 5mLEP管中，用菌槍頭搗碎，加入30ul ddH20浸泡5小時(shí)。將EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的 針對18S rDNA片段設(shè)計(jì)的特異引物NS31 5 ‘-TGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3，；下游引物Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3 ’的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50ul PCR反應(yīng)體系為10ng的 DNA 模板(一般用 1 μ 1)、50pmol 每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補(bǔ)足50 μ 1。采用巢式PCR反應(yīng)程序94°C預(yù) 變性4min,然后在94°C變性45s, 50°C引物復(fù)性45s, 72°C引物延伸1. 5min,循環(huán)30次，72°C 終延伸IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后取3ul反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用CyCle-Pure DNA試劑盒對目的片段進(jìn)行回收及純化，并進(jìn)行測序。測序由天津生物芯片公司進(jìn)行。采用Blast 程序在線(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進(jìn)行序列比對分 析，分析結(jié)果見表2表2醬香大曲生產(chǎn)過程中及不同質(zhì)量成品曲的DGGE指紋圖譜對應(yīng)單個條帶的序 列比對分析
權(quán)利要求
1.一種白酒大曲的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟1)取已知類型的大曲樣品；用方法1進(jìn)行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜進(jìn)行 聚類及半定量分析；用方法2進(jìn)行總DNA序列測定，確定優(yōu)勢真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)；2)取已知類型的大曲樣品；用方法1進(jìn)行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜進(jìn)行 聚類及半定量分析；用方法2進(jìn)行總DNA序列測定，確定優(yōu)勢真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)；3)將待測樣品與已知類型的大曲的優(yōu)勢菌群比對，兩者相符為同類型；其中所述方法1包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE指紋圖譜；其中所述方法2包括以 下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；進(jìn)行變性梯度凝 膠電泳，根據(jù)方法1的指紋圖譜聚類及半定量分析結(jié)果，回收優(yōu)勢條帶，并以此為模板，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，對目的片段進(jìn)行序列測定。
2.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述總DNA包括樣品中真菌和細(xì)菌的總DNA。
3.權(quán)利要求2的鑒定方法，其特征在于，其中所述真菌總DNA提取方法是提取緩沖液 提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉淀過夜；離心。其中提取緩沖液的加量是樣品量的3-6 倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍；細(xì)菌總DNA提取方法是提取緩沖液提取一次，加蛋白酶K和溶菌酶，氯仿抽提兩次，異 丙醇沉淀過夜；其中提取緩沖液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL 溶菌酶的加量分別是50-100 μ 1和0. 5-lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量是上清液 體積的0. 6-0. 7倍。
4.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述方法1中所述擴(kuò)增包括，以樣品的真 菌的總DNA或細(xì)菌的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對目 的片段進(jìn)行回收及純化；對于真菌總DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘ 和Geoll 5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘ ；PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增先加入擴(kuò)增 18S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后 在94 V變性45s，50 V -55 V引物復(fù)性45s，72 °C引物延伸1. 5min,循環(huán)30次，72 V終延伸 IOmin ；取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸 lmin，循環(huán) 30-35 次，72°C終延伸 IOmin ；對于細(xì)菌總DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R 5' -TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR 擴(kuò)增條件為巢式 PCR 擴(kuò)增先加入擴(kuò)增 16S rDNA全長的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性％iin，然后在94°C變 性45s，50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環(huán)30次，72°C終延伸IOmin ；取 其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區(qū)為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件 為94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循 環(huán) 30-35 次，72°C終延伸 IOmin0
5.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述序列測定，是對純化的目的片段進(jìn)行 變性梯度凝膠電泳(DGGE)，其點(diǎn)樣量為600-1000ng，用Ε. B (溴化乙錠)染色后得到測序用指紋圖譜；為避免條帶缺失，可先通過預(yù)試得到DGGE適宜的丙烯酰胺濃度梯度范圍及所用 時(shí)間。制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為20 %，40 %，60 %，80 %，使用的電泳緩沖 液為0. 5XTAE，上樣量為200ng，電壓80-120V，60°C，電泳10h，溴化乙錠染色20_30min，可 得出清晰準(zhǔn)確的DGGE圖譜，得出制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為35% 60%;將電泳時(shí)間分別確定為4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，每隔4h進(jìn)樣一次，上樣量為 200ng,電壓80V，溫度60°C，得到DGGE譜圖，可以確定所用時(shí)間可以為8_12h。
6.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述對真菌DNA進(jìn)行的DGGE指紋圖譜聚 類及半定量分析，可確定醬香白酒大曲不同生產(chǎn)時(shí)期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系及各個條帶所代 表的真菌在全部優(yōu)勢真菌菌群中的比例，即相對豐度；對細(xì)菌DNA進(jìn)行的DGGE指紋圖譜聚 類及半定量分析，可確定醬香白酒大曲不同生產(chǎn)時(shí)期細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系及各個條帶所代 表的細(xì)菌在全部優(yōu)勢菌群中的比例，即相對豐度；兩種微生物均可用Bio-ID++軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算公式為相對豐度卩^^ )= lOOXODi/OD，其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶的光密度之和。
7.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中方法2中，根據(jù)DGGE指紋圖譜聚類及半定 量分析結(jié)果，回收相對豐度高于的優(yōu)勢條帶，并以此為模板，在不含GC夾子的專用引物 的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對目的片段進(jìn)行回收、純化及測序；其中對于真菌DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCMGTCTGGTGCC-3' Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3‘。為 獲得更好的檢測效果，所述第二步的上游引物的5’端還添加有40個GC夾子，添加有40個 GC 夾子的上游引物序 NS31-GC 5 ‘ -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3‘；其中對于細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增，其專用引物為968FGC 5，-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3'禾Π R1041 5’ -CGGTGTGTACAAGACCC-3’ ；為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上游引物的5’端還添 加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上游引物序968TOC :5，-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3，。
8.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述比較可采用Blast程序在線 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對分析，確定大曲優(yōu)勢菌 群結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于，其中所述鑒定方法適用于所有釀造用曲，如釀 酒用的高溫大曲，中溫大曲，低溫大曲，小曲等及其醬油，醋等釀造過程中所有微生物的菌 群分析和優(yōu)勢菌群的確定；優(yōu)選適用于釀醬香高溫大曲，濃香高溫曲，中溫曲等；進(jìn)一步優(yōu) 選適用于醬香型的白酒大曲，最優(yōu)選適用于醬香型白酒高溫大曲。
10.權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于醬香白酒大曲中細(xì)菌的優(yōu)勢菌群是: Uncultured bacterium，Virgibacillus sp.，Bacillus sp.禾口 Thermoactinomyces sp. 0 醬香白酒大曲中真菌的優(yōu)勢菌群是Saccharomyces sp.，Saccharomycopsis fibuligera strain 禾口 Mucor sp.。
11.權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于醬香白酒大曲中細(xì)菌的優(yōu)勢菌群中，四個優(yōu)勢細(xì)菌的菌量比例是2 :1:1: 2;優(yōu)勢真菌菌量比例是1 1 4;優(yōu)勢細(xì)菌優(yōu)勢 真菌的菌量比是4 1.5。
12. 一種白酒大曲總DNA DGGE指紋圖譜的測定方法，該方法包括以下步驟1)取大曲樣品，2)提取樣品的總DNA；3)以總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白酒大曲中微生物的提取方法，特別是醬香型白酒大曲中真菌DNA和細(xì)菌DNA的提取方法以及用該方法在鑒定白酒方面的應(yīng)用。
文檔編號C12R1/85GK102071249SQ20091022870
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者張春輝, 李季, 李長文, 梁慧珍, 閆希軍 申請人:貴州仁懷茅臺鎮(zhèn)金士酒業(yè)有限公司