專利名稱：：一種快速獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法一種快速獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體說是建立了一種簡單、快速、高效地獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，該方法在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面有廣泛的應用價值。
背景技術(shù)：
：:大豆(GlycinemaxL.)起源于我國，栽培歷史悠久，是人類主要植物性蛋白質(zhì)來源之一，又是重要的家畜飼料和許多工業(yè)的原料，在醫(yī)學上也有很大價值，因而是一種非常重要的農(nóng)作物。大豆的生產(chǎn)容易受到各種環(huán)境因素的影響，因此產(chǎn)量很不穩(wěn)定，常規(guī)育種技術(shù)由于受到物種雜交不親和性以及不良基因性狀連鎖等因素的影響，在引入其他物種優(yōu)良基因的同時也帶入了許多不良的基因，因而很難進一步利用。而利用大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以定向培育大豆優(yōu)良品種，并將對大豆產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改良起到重大的推動作用。自Hinchee等(1988)和McCabe(1988)分別用兩種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大豆成功得到轉(zhuǎn)基因植株以來，雖然也相繼有這方面的報告，但是大豆轉(zhuǎn)化一直沒有突破性的進展，具體來說就是轉(zhuǎn)化效率低、操作流程繁瑣，并且實驗結(jié)果的重復性差。目前應用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有根癌農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、真空抽濾法和花粉管導入法等，但其中獲得較為廣泛應用的只有根癌農(nóng)桿菌介導法和基因槍法。農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉(zhuǎn)化與其它方法比起來具有經(jīng)濟、操作簡單、能夠準確、完整地將T-DNA以單拷貝或低拷貝的形式插入到受體基因組中等優(yōu)點，因此仍然是大豆遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法。利用農(nóng)桿菌介導大豆遺傳轉(zhuǎn)化選用的外植體通常是分生能力較強，能夠在分生區(qū)的細胞整合外源基因到受體細胞的染色體中，如子葉節(jié)、胚尖、下胚軸、萌動的子葉等外植體，以子葉節(jié)外植體進行轉(zhuǎn)化是傳統(tǒng)的方法，這一系統(tǒng)由Hinchee等利用Peking無菌苗子葉節(jié)為外植體首次獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株，之后Olhoft等報告在共培養(yǎng)階段添加L-半胱氨酸等抗氧化劑可以使轉(zhuǎn)化率有顯著的提高。近年來用成熟的大豆胚尖、下胚軸和萌動的子葉做外植體進行轉(zhuǎn)化也有許多成功的報告。雖然大豆的遺傳轉(zhuǎn)化取得了一定的進展，但是利用這些外植體進行轉(zhuǎn)化存在外植體的制備比較煩瑣、轉(zhuǎn)化植株中嵌合體較多、后期篩選的工作量大等諸多問題一直制約著轉(zhuǎn)化效率的提高。植物的愈傷組織(callus)原指植物體的局部受到創(chuàng)傷剌激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源于植物體任何器官內(nèi)各種組織的活細胞。在組織培養(yǎng)中，將植物器官或組織(如芽、莖尖、根尖、下胚軸或花藥)的一部分切下來，在無菌的條件下放在適當?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上進行培養(yǎng)，這些器官或組織就會進行細胞分裂，形成一團沒有分化的薄壁細胞，叫做愈傷組織。從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個時期啟動期、分裂期和分化期。啟動期指細胞準備進行分裂的時期。外源植物生長激素對誘導細胞開始分裂效果很好。分裂期是指外植體細胞經(jīng)過誘導以后脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。分裂期的愈傷組織細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。分化期是指在分裂的末期，細胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細胞。愈傷組織在適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質(zhì)與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進而發(fā)育成一棵完整的植株。愈傷組織在快繁技術(shù)、單倍體育種以及人工種子的制備等有廣泛的應用價值。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程給人類帶來了許多社會和經(jīng)濟效益。許多研究者通過在植物細胞中轉(zhuǎn)入外源基因來調(diào)控作物的農(nóng)藝生產(chǎn)性狀，進一步達到改善作物品質(zhì)和提高產(chǎn)量的目的。如高越峰等(2001)將高賴氨酸蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻的愈傷組織通過再生獲得了賴氨酸含量大大提高的轉(zhuǎn)基因水稻植株；Fernandoetal.(2005)將crylC基因轉(zhuǎn)入玉米幼胚愈傷組織獲得了抗病性強的轉(zhuǎn)基因玉米；邢莉萍等(2008)將小麥類甜蛋白基因轉(zhuǎn)化小麥的愈傷組織獲得了抗白粉病的轉(zhuǎn)基因小麥植株。此外，通過轉(zhuǎn)基因手段可以在愈傷組織中增強某種關(guān)鍵酶基因的表達水平來提高有用次生代謝產(chǎn)物的含量，如姜楠等(2009)通過農(nóng)桿菌介導大豆子葉節(jié)細胞獲得了異黃酮合成酶基因高表達的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。在功能基因的研究中，利用轉(zhuǎn)基因愈傷組織可以避免葉綠素自發(fā)熒光的干擾來研究目的基因編碼蛋白的定位，如夏玉鳳(2006)建立了一個可以利用煙草的轉(zhuǎn)基因愈傷組織研究目的蛋白亞細胞定位的體系。目前，關(guān)于大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系的研究很少，在現(xiàn)有的幾篇報道中都使用大豆無菌苗子葉節(jié)作外植體，外植體的制備繁瑣，轉(zhuǎn)化效率低，并且在轉(zhuǎn)化的外植體只能誘導出一塊獨立的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。另外，以前的研究在外植體的取材上也僅僅限于國外幾個比較容易轉(zhuǎn)化的大豆品種，而利用轉(zhuǎn)基因愈傷組織獲得具有穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化大豆植株的研究在國內(nèi)外也屬空白，因此在很大程度上制約著大豆基因工程的發(fā)展。而建立一個簡單、快速、高效地獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系，不僅對于大豆功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測有重要的理論意義，而且對于大豆基因工程、細胞工程、代謝工程和高效大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的技術(shù)體系中，因外植體制備繁瑣，轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導效率低，外源基因難以轉(zhuǎn)化大豆受體細胞以及轉(zhuǎn)基因愈傷組織的純合困難，使得轉(zhuǎn)化工作強度大，實驗流程長，并且獲得的轉(zhuǎn)化愈傷組織難以滿足研究和應用的需求等問題，提供一種新的簡單、快速、高效地獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)簡單、快速、高效地獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織，具體包括以下步驟第一步外植體的制備將成熟的大豆種子經(jīng)過氯氣熏蒸2.5-5小時后轉(zhuǎn)于含有0.8-1.5mgL—16-BA的無菌水中，2『C黑暗條件下萌發(fā)10-18小時后去除種皮、子葉、原葉和胚根，剩余的下胚軸切段作為待轉(zhuǎn)化的外植體。第二步農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染將含有外源基因的農(nóng)桿菌LBA4404(農(nóng)桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28t:、200rpm振蕩12小時，然后以1/100的比例擴大培養(yǎng)，待菌液的濃度達到0D6。。=0.8時，4°C、4000rpm離心12分鐘，收集菌體并重懸于液體浸染培養(yǎng)基中至0D6。。=0.5，將制備好的外植體浸泡于菌液中浸染30分鐘。第三步外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染后用無菌濾紙吸干表面多余的菌液，然后切口向下平鋪于表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養(yǎng)基上，24t:黑暗條件下培養(yǎng)3天。第四步轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導將共培養(yǎng)3天的外植體切口向下轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，于25°C、光照強度100Em—2s—^光周期16h光/8h暗的條件下培養(yǎng)10天。第五步轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選及繼代待轉(zhuǎn)基因愈傷組織初步形成后，將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上，兩周后將其從外植體的兩端切下，轉(zhuǎn)入相同的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，以后每隔兩周，便將形成的轉(zhuǎn)基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉(zhuǎn)入新鮮的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次來保持轉(zhuǎn)基因愈傷組織的旺盛生長。在本發(fā)明中，所述的農(nóng)桿菌浸染下胚軸切段使用的液體浸染培養(yǎng)基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—工，NaH2P04H2015mgL—、KIO.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo。4*2H200.025mgL—、CoCl2*6H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸妣B多醇l.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL一、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL-、乙酰丁香酮O.04gL—、pH5.4。所述農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)的半固體共培養(yǎng)基組分如下KN03250mgL一1，CaCl2*2H2015mgL—、MgS。4*7H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—1，NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS04*7H202.78mgL—、肌醇100mgL一、煙酸l.OmgL一1，鹽酸吡眵醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL-、Na2S2030.25gL-、乙酰丁香酮0.04gL—、瓊脂粉5gL-、pH5.4。所述的轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30gL—^2，4-D2.OmgL—丄+6-BA0.5mgL—丄+MES0.6gL—丄+潮霉素10mgL—丄+瓊脂粉7gL—、pH5.8。所述的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—^6-BA0.5mgL—一MES0.6gL—一潮霉素50mgL—,瓊脂粉7gL—、pH5.8。本發(fā)明同時提供了用上述方法獲得的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中的應用。例如在檢測目的基因啟動子活性的應用利用一個與大豆葉片衰老相關(guān)的類受體蛋白激酶基因(GmSARK)啟動子與GUS報告基因構(gòu)建獲得"啟動子_目的基因"的融合基因，將其轉(zhuǎn)化大豆下胚軸切段外植體獲得了在愈傷組織中GUS基因高表達的大豆GmSARK::GUS轉(zhuǎn)基因愈傷組織。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明選用國內(nèi)主栽的大豆優(yōu)良品種"中黃13"的下胚軸切段為外植體，利用農(nóng)桿菌介導的方法可以將外源基因整合到大豆受體細胞的基因組中，通過對轉(zhuǎn)化細胞進行轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導和篩選，從而建立了一個簡單、快速、高效地獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系。該轉(zhuǎn)化體系適用于我國主栽大豆優(yōu)良品種，打破了目前國內(nèi)外在大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化研究中僅僅使用國外幾個較容易轉(zhuǎn)化的大豆品種的瓶頸；該轉(zhuǎn)化體系的外植體制備比較簡單，不需要轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)大豆無菌苗制備外植體，成熟的大豆種子在無菌水中浸泡10-18小時后就可以獲得下胚軸切段外植體，并且不必對外植體做精細的傷口處理，因此要比傳統(tǒng)的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)化體系中所用的子葉節(jié)外植體的制備省時省力；利用該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高，通過對轉(zhuǎn)基因愈傷組織GUS報告基因的檢測統(tǒng)計外源基因轉(zhuǎn)化效率高達87.7%，組織化學染色同時表明GUS報告基因在下胚軸切段外植體的上下兩端能同時各自獨立地誘導出轉(zhuǎn)基因愈傷組織。因此該大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法具有較廣泛的適用性和高效性。圖1是大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化流程。(a)大豆下胚軸切段外植體的制備過程；(b)農(nóng)桿菌浸染大豆下胚軸切段后外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；(c)外植體共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入含有10mgL—^朝霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基；(d)轉(zhuǎn)基因愈傷組織初步形成后轉(zhuǎn)入含有50mgL—1潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上篩選2周。圖2是轉(zhuǎn)基因愈傷組織在含有50mgL—1潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上篩選2周后GUS的染色結(jié)果，左為對照(CK)，右為轉(zhuǎn)基因愈傷組織(TR)。圖3是將GmSARK::GUS融合基因轉(zhuǎn)化大豆下胚軸切段誘導的轉(zhuǎn)基因愈傷組織在轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上篩選4周的GUS染色結(jié)果。(a)染色前的愈傷組織，左為對照(CK)，右為轉(zhuǎn)基因愈傷組織(TR);(b)對應GUS染色后的愈傷組織，左為對照(CK)，右為轉(zhuǎn)基因愈傷組織(TR)。具體實施方式實施例1:大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的獲得1、大豆下胚軸切段外植體的制備挑選健康成熟的"中黃13"大豆種子，放入含有氯氣(由10mlNaC10和1ml濃HCl反應生成)的密閉容器內(nèi)熏蒸2.5-5小時(此范圍內(nèi)的具體時間變動對結(jié)果無顯著影響)后浸泡于含有l(wèi)mgL—16-BA(取0.8、1.5mgL—16_BA的濃度對結(jié)果無顯著影響)的無菌水中，消毒好的大豆在28t:黑暗條件下萌發(fā)10-18小時(此范圍內(nèi)的具體時間變動對結(jié)果無顯著影響)，用io號手術(shù)刀片去除種皮和一片子葉，然后去除另外一片子葉和原葉，最后切掉胚根(圖la)，將制備好的外植體收集到一個含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中待浸染。2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染從YEP固體培養(yǎng)基(見附錄1)平板上用接種環(huán)挑取含有雙元表達載體pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404(購自中國科學研究院微生物研究所)單菌落接種于5mlYEP液體培養(yǎng)基(見附錄2)中[雙元表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404參見IKfgen和Willmitzer(1988)的方法]，在28。C環(huán)境下200rpm振蕩12小時。然后以1/100的比例第二次擴大培養(yǎng)，待菌液的濃度達到0D6。。=0.8時，4000rpm，4t:離心12分鐘，收集菌體，重懸于液體浸染培養(yǎng)基LIM(見附錄3)，然后將制備好的外植體浸泡于農(nóng)桿菌菌液中30分鐘。3、外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染后用無菌濾紙吸干表面多余的菌液，然后切口向下平鋪于表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養(yǎng)基CCM(見附錄4)上(圖lb)，24t:黑暗條件下培養(yǎng)3天。4、轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導將共培養(yǎng)3天的外植體切口向下轉(zhuǎn)于轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基CIM(見附錄5)上(圖lc)，25°C、100iiEm—2s—1光照強度、16h光/8h暗的光周期條件下培養(yǎng)10天。5、轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選及繼代待轉(zhuǎn)基因愈傷組織初步形成后，將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基CSM(見附錄6)篩選兩周(圖ld)，兩周后將其從外植體的兩端切下，轉(zhuǎn)入相同的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，以后每隔兩周，便將形成的轉(zhuǎn)基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉(zhuǎn)入新鮮的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次來保持轉(zhuǎn)基因愈傷組織的旺盛生長。實施例2:大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)化效率試驗選用我國主栽的"中黃13"大豆品轉(zhuǎn)化，按照實施例1中介紹的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法將含有GUS報告基因的雙元表達載體pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404(農(nóng)桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)浸染大豆下胚軸切段[雙元表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404參見H6fgen和Wfillmitzer(1988)的方法]，外植體經(jīng)過共培養(yǎng)后在轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基CIM(見附錄5)誘導10天，待轉(zhuǎn)基因愈傷組織初步形成后將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基CSM(見附錄6)篩選2周，通過統(tǒng)計GUS報告基因陽性率確定外源基因的轉(zhuǎn)化效率以及在一個外植體兩端同時形成轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率。GUS組織化學染色參考Bl咖e和Grierson(1997)的方法，染色時間為6小時，愈傷組織中的藍色為報告基因GUS組織化學染色，表明外源基因已經(jīng)整合到受體細胞的染色體中并表達，結(jié)果見表1。表l結(jié)果顯示，供試的"中黃13"大豆品種有較高的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率高達87.7%，遠遠高于目前所報道的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率。另外，目前在誘導大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的研究中通常使用子葉節(jié)作外植體，結(jié)果只能在子葉節(jié)處誘導出一塊愈傷組織，而本發(fā)明所使用的下胚軸切段外植體能夠在其兩端同時形成兩塊獨立的轉(zhuǎn)基因愈傷組織(圖2)，轉(zhuǎn)化效率為75.8%，說明本發(fā)明在農(nóng)桿菌介導大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)化方法的獨特性和高效性。表1大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率試驗i纖批次浸染外植GUS陽性愈傷轉(zhuǎn)化效率外植體兩端的愈傷組外植體兩端同時形體數(shù)組織的外植(%)織都顯示GUS陽性的離基因愈傷組織體數(shù)外植體數(shù)的轉(zhuǎn)化效率(%)1676191.15277.62544583.34074.13706288.65375.7平均87.775.8注(1)轉(zhuǎn)化效率=GUS陽性愈傷組織的外植體數(shù)/浸染外植體數(shù)X100%;(2)外植體兩端同時形成轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率=外植體兩端的愈傷組織都顯示GUS陽性的外植體數(shù)/浸染外植體數(shù)X100%8實施例3:大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的獲得在目的基因啟動子活性檢測中的應用選用我國主栽的"中黃13"大豆品種做實驗材料，按照實施例1中介紹的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法將含有"GmSARK啟動子-GUS"融合基因的農(nóng)桿菌LBA4404(農(nóng)桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)浸染大豆下胚軸切段外植體[GmSARK啟動子序列GeneBank登錄號AY870314;"GmSARK動子-GUS"融合基因的構(gòu)建參見本實驗室李鵬麗等(李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.)的方法；rlpk2后被命名為GmSARK;"GmSARK啟動子-GUS"融合基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404參見H6fgen和Willmitzer(1988)的方法]，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導和篩選，利用Blume和Grierson(1997)組織化學染色的方法，檢測篩選4周后轉(zhuǎn)基因愈傷組織中GmSARK啟動子驅(qū)動的GUS基因是否能夠表達。只有染色后呈現(xiàn)藍色的愈傷組織中才有GUS報告基因的表達，也代表著GmSARK啟動子在該愈傷組織中具有活性。染色時間為6小時，將材料的染色結(jié)果掃描成圖片后保存。染色結(jié)果如圖3:光周期16h光/8h暗條件下，在轉(zhuǎn)化"GmSARK啟動子-GUS報告基因"融合基因的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織中有很強的GUS活性，這與本實驗室前期研究GmSARK啟動子在微型番茄Micro-Tom的轉(zhuǎn)基因愈傷組織有很高活性的結(jié)果是一致的[李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.(rlpk2后被命名為GmSARK)]。該實驗結(jié)果也進一步驗證了本發(fā)明的適用性、可靠性和高效性。該大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立，在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了一條新的途徑。附錄1、YEP固體培養(yǎng)基成分蛋白胨10gL—、酵母膏10gL-、NaCl5gL—、瓊脂粉15gL-、pH7.0。2、YEP液體培養(yǎng)基成分蛋白胨10gL—、酵母膏10gL—、NaCl5gL—、pH7.0。3、LM(液體浸染培養(yǎng)基)大量營養(yǎng)成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量營養(yǎng)成份KIO.075mgL—SHsBOa0.3mgL—SMnSO**4H201.OmgL—SZnSO**7H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、鐵鹽Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有機營養(yǎng)成份肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸吡哆醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL—1;植物激素6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—1;附加成份蔗糖30gL-、MES0.6gL-、乙酰丁香酮0.04gL-1;pH5.4。4、CCM(半固體共培養(yǎng)基)大量營養(yǎng)成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量營養(yǎng)成份KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—1;鐵鹽Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有機營養(yǎng)成份肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—1，鹽酸吡哆醇1.OmgL—1，鹽酸硫銨素lOmgL—1;植物激素6-BA2.OmgL-、IBA0.2mgL-1;附加成份:蔗糖30gL—、MES0.6gL-、0.04gL-1乙酰丁香酮，O.4gL—^-半胱氨酸，0.15gL—力TT，0.25gL—Aa^A,凝固劑瓊脂粉5gL—、pH5.4。5、CIM(轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基)MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—、潮霉素lOmgL—、頭孢霉素400mgL—、瓊脂粉7gL—、pH5.8。6、CSM(轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基)MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—S潮霉素50mgL—、頭孢霉素400mgL—、瓊脂粉7gL—、pH5.8。7、MS基本培養(yǎng)基成分大量營養(yǎng)成份NH4N031650mgL—、KN031900mgL—、CaCl22H20440mgL—、MgS047H20370mgL—、KH2P04170mgL—1;微量營養(yǎng)成份KIO.83mgL—^H^C^6.2mgL—、MnS。4*4H2022.3mgL—、ZnS04*7H208.6mgL—、Na2Mo042H200.25mgL—、CuS045H200.025mgL—、CoCl26H200.025mgL—1;鐵鹽Na2-EDTA2H2037.3mgL—、FeS047H2027.8mgL—1;有機營養(yǎng)成份肌醇lOOmgL—、煙酸O.5mgL—、鹽酸吡哆醇O.5mgL—、鹽酸硫胺素0.lmgL—、甘氨酸2mgL—、[OO78]參考文獻高越峰，荊玉祥，沈世華，田世平，匡廷云，SamuelS.M.SUN.高賴氨酸蛋白基因?qū)胨炯翱捎D(zhuǎn)基因植株的獲得.植物學報，2001，43:506511.黃培堂，等譯.《分子克隆實驗指南》(第三版)，北京科學出版社，2002.姜楠，王東，崔征，鄭英秀.異黃酮合成酶基因高表達的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的研究沈陽藥科大學學報，2009，26:6368.李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.夏玉鳳.用于蛋白亞細胞定位研究的煙草愈傷組織培養(yǎng)條件優(yōu)化，河北師范大學學報，2006，30:343345.邢莉萍，王華忠，蔣正寧，倪金龍，曹愛忠，于玲，陳佩度.小麥類甜蛋白基因的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析.作物學報，2008，34:349354.Bl咖eB，GriersonD.ExpressionofACCoxidasepromoter_gusfusionsintomatoandnicotianaplumbaginifoliaregulatedbydevelopmentalandenvironmentalstimuli.PlantJournal,1997，12:731746.FernandoH.Valicente，NewtonP.etal.TransformationofMaizeEliteLineswithcrylCaofBacillusthuringiensistoControlSpodopterafrugiperda.6thPacificRimConferenceontheBiotechnologyofBacillusthuringiensisanditsEnvironmentalImpact.2005,8183.HincheeMA，ConnorWardDV，NewellCA.etal.ProductionoftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.Bio/Technology，1988，6:915922.H6fgenR，WillmitzerL.StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidsResearch，1988，16:9877.JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsystem.PlantMolecularBiologyReporter,1987，5:387405.LiuHK，YangC，WeiZM.EfficientAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregenerationsystem.Planta，2004,219:10421049.LodhiMA，YeGN，WeedenNF，ReischBI.AsimpleandefficientmethodforDNAextractionfromgrapevinecultivars，VitisspeciesandAmpelopsis.PlantMolecularBiologyReporter,1994，12:6—13.LuoG.，HepburnA，WidholmJ.Asimpleprocedurefortheexpressionofgenesintransgenicsoybeancallustissue.PlantCellReports,1994，13:632636.McCabeDE，SwainWF，MartinellBJ，ChristouP.Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology，1988，6:923926.OlthoftPM，SomerDA.L-cysteineincreasesAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotyledonarynodecells.PlantCellReports,2001，20:706711.OlhoftPM，F(xiàn)lagelLE，DonovanCM.EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary_nodemethod.Planta，2003，5:723735.TrickHN，DinkinsRD，SantarnER，DiR，SamoylovV，MeurerCA，WalkerDR，ParrottWA，F(xiàn)inerJJ，CollinsGB.Recentadvancesinsoybeantransformation.PlantTissueCultureandBiotechnology,1997，3:926。權(quán)利要求一種快速獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法，具體包括以下步驟第一步外植體的制備首先將成熟的大豆種子用氯氣熏蒸消毒2.5-5小時，然后將種子浸泡于含有0.8-1.5mgL-16-BA的無菌水中，28℃黑暗條件下萌發(fā)10-18小時之后，去除種皮、子葉、原葉和胚根，剩余的下胚軸切段作為待轉(zhuǎn)化的外植體；第二步農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染將含有外源基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時；然后以1/100的比例擴大培養(yǎng)；待菌液的濃度達到OD600＝0.8后，4℃、4000rpm離心12分鐘收集菌體，并將菌體重懸于液體浸染培養(yǎng)基中至OD600＝0.5，將上步制備好的外植體浸泡于菌液中浸染30分鐘；第三步外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)將第二步經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染后的外植體用無菌濾紙吸干表面多余的菌液，然后切口向下平鋪于表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養(yǎng)基上，24℃黑暗培養(yǎng)3天；第四步轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導將第三步共培養(yǎng)3天的外植體切口向下轉(zhuǎn)于轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，25℃、光照強度100μEm-2s-1、16h光/8h暗的光周期條件下培養(yǎng)10天；第五步轉(zhuǎn)基因愈傷組織的篩選及繼代待轉(zhuǎn)基因愈傷組織初步形成后，將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上，兩周后將其從外植體的兩端切下，轉(zhuǎn)入相同的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，以后每隔兩周，便將形成的轉(zhuǎn)基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉(zhuǎn)入新鮮的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次來保持轉(zhuǎn)基因愈傷組織的旺盛生長。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第二步農(nóng)桿菌浸染外植體使用的液體浸染培養(yǎng)基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸吡哆醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素lOmgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBAO.2mgL—、0.04gL—1乙酰丁香酮，pH5.4。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第三步農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)的半固體共培養(yǎng)基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—1，鹽酸吡哆醇1.OmgL—1，鹽酸硫銨素lOmgL—、蔗糖30gL-、MES0.6gL-、6-BA2.OmgL—1，IBAO.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL—、Na2S2030.25gL—、乙酰丁香酮0.04gL—、瓊脂粉5gL—、pH5.4。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，第四步所述的轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮霉素lOmgL—^頭孢霉素400mgL—^瓊脂粉7gL—、pH5.8。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第五步所述的轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮霉素50mgL—^頭孢霉素400mgL—^瓊脂粉7gL—、pH5.8。6.權(quán)利要求1所述方法獲得的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中的應用。全文摘要一種快速獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化方法，利用該方法可以成功解決外源基因難以導入大豆的難題。本發(fā)明以大憶豆下胚軸切段為外植體，用含有外源基因的根癌農(nóng)桿菌浸染后共培養(yǎng)，將共培養(yǎng)后的外植體經(jīng)過轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導和篩選后統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高達87.7％。該轉(zhuǎn)化方法的外植體制備簡單、實驗流程短、轉(zhuǎn)化效率高。該大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立，在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面有廣泛的應用價值。文檔編號C12N15/84GK101717786SQ20091022911公開日2010年6月2日申請日期2009年12月11日優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日發(fā)明者劉棟,常大松,王寧寧,石強,龔清秋申請人:南開大學