專(zhuān)利名稱(chēng)：一種對(duì)蝦性別探針及其獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)蝦性別探針的開(kāi)發(fā)，具體地說(shuō)是利用分子生物學(xué)手段，通過(guò)PCR 擴(kuò)增，鑒定對(duì)蝦的性別。屬于海洋生物技術(shù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。利用此技術(shù)可以在對(duì)蝦 養(yǎng)殖的早期，通過(guò)分子生物學(xué)的方法有效地鑒定雌雄性別。此技術(shù)對(duì)于對(duì)蝦的性控研究和 養(yǎng)殖生產(chǎn)均具有重要意義。
背景技術(shù)：
對(duì)蟲(chóng)下的養(yǎng)殖在我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來(lái)，種質(zhì)退化、種苗質(zhì)量 下降、病害嚴(yán)重等問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展。通過(guò)生物技術(shù)改良種質(zhì)，培 育生長(zhǎng)快或抗逆能力強(qiáng)的新品種已成為海水養(yǎng)殖發(fā)展的迫切需求。由于對(duì)蝦性別二態(tài)性的 存在，對(duì)對(duì)蝦的性別進(jìn)行控制，培育單性群體，可以有效提高單位面積的養(yǎng)殖產(chǎn)量，在對(duì)蝦 養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。因而對(duì)蝦性別控制研究一直是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)和難 點(diǎn)。 區(qū)分對(duì)蝦性別通常的方法是通過(guò)外觀上觀察外部性征來(lái)區(qū)分對(duì)蝦性別，然而外觀 上觀察必須等對(duì)蝦的外部性征完全形成以后才能實(shí)現(xiàn)。而在實(shí)際工作中，為了研究對(duì)蝦的 性別決定和性別分化機(jī)制，需要在更早時(shí)期確定性別后才能進(jìn)行相關(guān)研究；另一方面，在對(duì) 蝦性別控制中，及早測(cè)定群體的性別比例，選擇有利于產(chǎn)量提高的群體進(jìn)行養(yǎng)殖，最大限度 地提高養(yǎng)殖產(chǎn)量。因而尋找合適的檢測(cè)方法，在對(duì)蝦的早期鑒別對(duì)蝦的性別，無(wú)論對(duì)對(duì)蝦性 別控制研究還是對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)均具有重要的意義。 有關(guān)對(duì)蟲(chóng)下性別標(biāo)記的篩選近幾年陸續(xù)有一些報(bào)道。從斑節(jié)對(duì)蟲(chóng)下的基因組中分離性 別相關(guān)的標(biāo)記沒(méi)有獲得成功，而從卵巢和精巢差異表達(dá)基因的篩選過(guò)程中獲得了斑節(jié)對(duì)蝦 性別相關(guān)的標(biāo)記(Khamnamtong， B. ， Supaporn Thumr皿gtanakit， S. ， Klinb皿ga， S. ， Aoki， T. ， Hirono， I and Menasvetal， P.2006. Identification of Sex_specificExpression Markers in the Giant Tiger Shrimp(Penaeus monodon). Journal ofBiochemistry and Molecular Biology, 39 (1) ， 37-45.。隨后，通過(guò)精巢和卵巢EST序列的分析，在斑節(jié) 對(duì)蝦獲得了一些性別相關(guān)的基因(Preechaphol， R. ， Leelatanawit， R. ， Sittikankeawl， K. ， Klinb皿ga， S. ， Khamnamtong, B. ， Puanlarp， N. and Menasveta， P. ，2007. Expressed Sequence Tag Analysis for Identification and Characterization ofSex—Related Genes in the Giant Tiger Shrimp Penaeus monodon. Journal of Biochemistryand Molecular Biology, 40 (4) ， 501-510)。促雄性腺作為對(duì)蟲(chóng)下雄性個(gè)體特有的腺體，其內(nèi)特異 表達(dá)的基因有可能開(kāi)發(fā)為性別相關(guān)的標(biāo)記，基于此，本發(fā)明通過(guò)篩選促雄性腺特異表達(dá)的 基因獲得了用于中國(guó)明對(duì)蝦性別鑒定的探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對(duì)蝦促雄性腺是對(duì)蝦雄性個(gè)體獨(dú)有的內(nèi)分泌腺這一特點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建消 減文庫(kù)，測(cè)序和生物信息學(xué)分析，獲得了促雄性腺高豐度表達(dá)的基因序列。通過(guò)在雌雄個(gè)體
3中的對(duì)比驗(yàn)證，獲得了只在雄性個(gè)體中具有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的引物序列，此引物可以用于 中國(guó)明對(duì)蝦的性別鑒定。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用篩選的雄性個(gè)體特有的cDNA序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，只在 雄性個(gè)體中具有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此可以在對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育早期，外觀上不能區(qū)分性別的情況下， 將雌雄個(gè)體進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明在對(duì)蝦性別控制中具有重要的應(yīng)用前景。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下 —種對(duì)蝦性別探針，包括特異性引物，所述的特異性引物為只能在雄性個(gè)體中擴(kuò) 增的引物序列， 正向弓| 物5， -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3，，反向弓| 物 5， -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3，。
所述對(duì)蟲(chóng)下是指中國(guó)明對(duì)蟲(chóng)下。
所述對(duì)蝦性別探針的獲取方法為 通過(guò)構(gòu)建對(duì)蝦促雄性腺的抑制性消減文庫(kù)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，篩選雄性個(gè) 體特異表達(dá)的cDNA，，通過(guò)驗(yàn)證獲得只在雄性個(gè)體具有特異性擴(kuò)增的引物，用于對(duì)蝦的性別 鑒定具體步驟如下 1)構(gòu)建對(duì)蝦成熟雄性個(gè)體第五對(duì)步足基部(促雄性腺及相關(guān)組織)和第四對(duì)步足 基部的正向抑制性消減文庫(kù)(PCR-Select cDNA Subtraction Kit,Clontech)，通過(guò)測(cè)序獲 得10-12條潛在的促雄性腺高豐度表達(dá)的序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物4對(duì)(第一對(duì)正 向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3'，反向引物5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT—3';第二 對(duì)正向引物5' -AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3'，反向引物5' -CATCACGGAGGCATCCATCT-3';第 三對(duì)正向引物5' -CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3'，反向引物5' -CTTACCCAGCAACTGCAC-3';第四 對(duì)正向引物5' -CTTCTCGCTGAACGTGATG-3'，反向引物5' -CTTACCCAGCAAGCGCAC—3');
2)用于PCR擴(kuò)增的cDNA樣品的制備取外觀上能區(qū)分性別的對(duì)蟲(chóng)下第五對(duì)步足基 部，記錄性別，分別提取每個(gè)個(gè)體的總RNA ;RNA提取按常規(guī)方法進(jìn)行，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
3)利用1)中設(shè)計(jì)的特異性引物，分別在2)中獲得的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選 出只在雄性個(gè)體中有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)；
所述的只能在雄性個(gè)體中擴(kuò)增的引物序列為
正向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3'
反向引物5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3';
其擴(kuò)增片段大小為539bp，其序列信息為
GCCAGCAC ; 4)將篩選的引物對(duì)在大量個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證。
本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn) 1.利用構(gòu)建促雄性腺相關(guān)組織消減文庫(kù)的方法，篩選雄性個(gè)體特異表達(dá)的cDNA 序列，在此基礎(chǔ)上獲得在雄性個(gè)體中有特異性擴(kuò)增的引物對(duì)。 2.利用篩選的引物對(duì)，通過(guò)提取對(duì)蝦第五對(duì)步足基部的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后， 利用一次PCR擴(kuò)增就可鑒別對(duì)蝦的雌雄，方法簡(jiǎn)單、可行。 3.在對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育的早期階段，外觀尚不能確定對(duì)蝦性別的情況下即可使用，以 利于相關(guān)的研究和生產(chǎn)。


圖1為Contigl6在對(duì)蝦早期發(fā)育階段不同性別中的表達(dá).其中M (Maker): DL2000 ;Female :1-19共19尾個(gè)體;Male :1-20共20尾個(gè)體 ， A. Contigl6在對(duì)蟲(chóng)下早期發(fā) 育階段雌性個(gè)體中的表達(dá)，B. Contigl6在對(duì)蝦早期發(fā)育階段雄性個(gè)體中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
構(gòu)建對(duì)蟲(chóng)下成熟雄性個(gè)體第五對(duì)步足基部和第四對(duì)步足基部的正向抑制性 消減文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序獲得12條潛在的促雄性腺高豐度表達(dá)的序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì) 特異性引物4對(duì)(第 一 對(duì)正向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3'，反向引物 5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3';第二對(duì)正向引物5' -AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT—3'，反向引 物5' -CATCACGGAGGCATCCATCT-3';第三對(duì)正向引物5' -CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3'，反向引 物5' -CTTACCCAGCAACTGCAC-3';第四對(duì)正向引物5' -CTTCTCGCTGAACGTGATG-3'，反向引 物5' -CTTACCCAGCAAGCGCAC-3'); 弓| 物(正向弓| 物5， -AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3', 反向弓| 物 5， -CATCACGGAGGCATCCATCT-3，)的擴(kuò)增片段(456)為AGTGTCCGCAGCAGCAAGATGTTTAAGAAA
AGGGACAAGCAGGACCATCCGAGATGGATGCCTCCGTGATG 弓| 物(正向弓| 物5， -CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3，， 反向弓| 物 5' -CTTCCCAGCAACTGCAC-3')的擴(kuò)增片段(285)為CTCCGTAGGAGTTTTGTCCTCAAGCCTCTCTCC
CATGTGCAGTTGCTGGGTAAG 弓| 物(正向弓| 物5， -CTTCTCGCTGAACGTGATG-3，， 反向弓| 物 5， -CTTACCCAGCAAGCGCAC-3，)的擴(kuò)增片段(240bp)為CTTCTCGCTGAACGTGATGTCTATCCCTCG
對(duì)蝦早期發(fā)育階段性別鑒別的具體步驟如下 1、2008年4月從青島市即墨對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)中國(guó)對(duì)蝦親蝦，運(yùn)回中國(guó)科學(xué)院海洋 研究所水族樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行養(yǎng)殖，對(duì)蝦排卵后收集受精卵，通過(guò)育苗培育獲得仔蝦后，在實(shí)驗(yàn) 室養(yǎng)殖獲得不同發(fā)育時(shí)期的幼蝦，保存在液氮中。 2、選取外觀上能明顯區(qū)分性別的雌雄個(gè)體，分別提取每個(gè)個(gè)體第5對(duì)步足基部的 總RNA。 RNA提取，利用上海博星生產(chǎn)的Unizol試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行；按下述方式反 轉(zhuǎn)錄為cDNA(25 ii 1反應(yīng)體系中含有1 y gRNA): 1) RNA中基因組DNA的消化在200 ii 1離心管中配制如下反應(yīng)體系 RNA x u 1 RNasin(promega) 0. 5ul RQ1 RNase-Free DNase(promega) lul 5XMLV Buffer 2. 5ul ddH20 8-x 共計(jì)12iU反應(yīng)體系 在PCR儀中37。C消化30min ; 2)在上述反應(yīng)體系中加入 Stop Buffer lul Hexomer(上海生工合成) lul 在PCR儀中70。C反應(yīng)5min后，置冰上2min ; 3)在上述反應(yīng)中加入 RNasin (promega) 0. 5ul 5 XMLV Buffer 2. 5ul M-MLV (TAKARA) lul ddH20 6ul 在PCR儀中37。C反應(yīng)90min反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ; 4)在PCR儀中95。C反應(yīng)5min后，把反應(yīng)體系置冰上。-2(TC保存?zhèn)溆谩?
3、根據(jù)對(duì)蝦促雄性腺中高豐度表達(dá)基因的部分序列設(shè)計(jì)特異性引物(第一對(duì)正 向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3'，反向引物5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT—3';第二 對(duì)正向引物5' -AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT-3'，反向引物5' -CATCACGGAGGCATCCATCT-3';第 三對(duì)正向引物5' -CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3'，反向引物5' -CTTACCCAGCAACTGCAC-3';第四 對(duì)正向引物5' -CTTCTCGCTGAACGTGATG-3'，反向引物5' -CTTACCCAGCAAGCGCAC-3')，分別 在雌雄個(gè)體第五對(duì)步足基部獲得的cDNA中進(jìn)行擴(kuò)增，并以18s rRNA作為內(nèi)參，篩選出只在 雄性個(gè)體中有特異性擴(kuò)增的一對(duì)引物對(duì)(正向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3';反 向引物5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT3')。其PCR反應(yīng)體系為25 ii l，成分為10XReaction Buffer，2.5ii 1 ;25mM MgCl2，1.5ii 1 ;10mM dNTP，0.5ii 1 ; 10 ii M正向引物，0. 5 ii 1 ;10yM 反向引物，O. 5ii 1 ;cDNA，lii 1 ;Taq酶(Promega) ，0. 25 ii 1 ;ddH20， 18. 25ii 1。 PCR程序?yàn)? 94°C 4min ;94。C 40s，59。C 40s，72。C 40s，35cycles ;72。C 10min。 4、將體長(zhǎng)為6cm左右的39尾幼蝦(19雌20雄)，按2中所述方法分別提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按3中PCR程序，將在3中篩選的一對(duì)引物分別在提取的不同個(gè)體的 cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1. 2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在雄性個(gè)體中均擴(kuò)增出 明顯的條帶，而在雌性個(gè)體未見(jiàn)擴(kuò)增(圖l)。說(shuō)明所篩選出的引物對(duì)可以用于對(duì)蝦的性別 檢測(cè)。
對(duì)蟲(chóng)下
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 〈120〉 一種對(duì)蝦性別探針及其獲取方法 〈130〉 〈160>4
〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211>539 〈212>DNA 〈213〉中國(guó)明對(duì)蝦














〈220〉 〈221>gene
(539)
〈223〉 〈400>1ttggttegatcggtg郷agtcccaatccagcgg郷雄cg皿ggccgagg卿郷ag60ggag卿tgaga卿郷aggg卿gtcgagacg皿gg皿120gtcg皿gg皿g郷卿cgagacg皿gg皿180gagg^^gagag皿gc皿g皿gatc3gct240gg皿C3Cg3Cgg皿g皿gccatcgcgg郷ga皿cgc皿cgaccaccatg300gagccatcgc皿cg皿ggteaccacgaccgcaagtccttccgacgacccc3603gC3Cg3CC3tggggccttcgcteggg皿ccccggg郷g皿3CC3Cg3Cagcg皿gccc420tccg皿gatgCC3CC3Cg3Caccggaaccctctg皿gatecc皿teccacg3ccategag■ccgtcgcctgg郷g皿gcc3Cg3CgCCg3teccctctgacgccagcac539 〈210>2 〈211>456 〈212>DNA 〈213〉中國(guó)明對(duì)蟲(chóng)下 〈220〉 〈221〉gene 〈222〉 (1) . (456) 〈223〉 〈400>2 agtgtccgca gcagcaagat
gttteagaaa gaggcgctgg ttgttgcctg catgttggcc
60
7
gtccaggtttcatcgcagcctctggttgcaggte皿ccattcactttggt g皿皿gag皿120ateggattccccatggcggaattcctcgatctgcag皿皿g郷tgcggg皿tgcracgt180ccagattccgattccaggctcatg^gcgaC3Cg皿g3ggtgccccactt ggaacgcctc240ctccttctgaa朋ggcgtecgccacgtctegagaccgattccggcatrat gaggagacac300agtgggcccccctccgteggcatgateccatgtggatgga tetccacggt360ctggagactegggEltgC朋gcacgccaagtccacagcccg皿ttCggtgt C3tgC3ggg3420C朋gC3gg3Ccatccgagatggatgcctccgtgatg456〈210>3〈211>285〈212>DNA〈213〉中國(guó)〖訴對(duì)蝦〈220〉〈221>gene〈222〉 (1) (285)〈223〉〈400>3ctccgteggagttttgtcctcaagcctctctccgagaggcatgacatcct cgatgaacgt60gatgtctetcccgcgg皿tgccaaggttctttcagcgtgcctgccttgca agcggtgaat120gatctetgtcttcaatgcgaa^cgteactcggcagcccgacactctegc caattgcaag180gcaaactgcttcagcaactctetcttcgtcggttgtctcg3tgtgCtgg3 3CtgCC3g皿240 [o川]〈210>4ctecgtecagcagttgctgg285〈211>240〈212>DNA〈213〉中國(guó)〖訴對(duì)蝦〈220〉〈221>gene〈222〉 (1) (240)〈223〉〈400>4cttctcgctg皿cgtgatgtctetccctcgg皿tgcc皿ggttctttcag cgtgcctgcc60ttg腿gcggtgaatgatctatgtcttcaatgcg皿皿cg3皿ctcggga tcgcac皿ct120cteggca朋tctgcttcaacaactctetcttcgccggttg tctcgatttg180ctgcaactgcC3g皿3gCg3皿皿gctecgtecate皿gcatgtgcgctt gctgggt皿g240
8
權(quán)利要求
一種對(duì)蝦性別探針，包括特異性引物，其特征在于所述的特異性引物為只能在雄性個(gè)體中擴(kuò)增的引物序列，正向引物5’-TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3’，反向引物5’-GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3’。
2. 按照權(quán)利要求1所述的對(duì)蝦性別探針，其特征在于所述對(duì)蝦是指中國(guó)明對(duì)蝦。
3. —種權(quán)利要求1所述對(duì)蝦性別探針的獲取方法，其特征在于通過(guò)促雄性腺消減文庫(kù)的建立，篩選雄性個(gè)體特異表達(dá)的cDNA序列，通過(guò)設(shè)計(jì)引物， 利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)對(duì)蝦的性別；具體步驟如下，1) 構(gòu)建對(duì)蝦成熟雄性個(gè)體第五對(duì)步足基部和第四對(duì)步足基部的正向抑制性消 減文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序獲得10-12條潛在的促雄性腺高豐度表達(dá)的序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì) 特異性引物4對(duì)(第 一 對(duì)正向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3'，反向引物 5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3';第二對(duì)正向引物5' -AGTGTCCGCAGCAGCAAGAT—3'，反向引 物5' -CATCACGGAGGCATCCATCT-3';第三對(duì)正向引物5' -CTCCGTAGGAGTTTTGTC-3'，反向引 物5' -CTTACCCAGCAACTGCAC-3';第四對(duì)正向引物5' -CTTCTCGCTGAACGTGATG-3'，反向引 物5' -CTTACCCAGCAAGCGCAC-3');2) 用于PCR擴(kuò)增的cDNA樣品的制備取外觀上能區(qū)分性別的對(duì)蝦第五對(duì)步足基部，記 錄性別，分別提取每個(gè)個(gè)體的總RNA ;RNA提取按常規(guī)方法進(jìn)行，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;3) 利用1)中設(shè)計(jì)的特異性引物，分別在2)中獲得的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出只 在雄性個(gè)體中有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)；所述的只能在雄性個(gè)體中擴(kuò)增的引物序列為正向引物5' -TTGGTTAGATCGGTGAGGAGTC-3' 反向引物5' -GTGCTGGCGTCAGAGGGTAT-3'。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國(guó)明對(duì)蝦性別探針的開(kāi)發(fā)。即利用分子生物學(xué)手段篩選用于對(duì)蝦性別檢測(cè)的特異性引物，用于對(duì)蝦的性別檢測(cè)。具體地，包括用于檢測(cè)性別的序列篩選、對(duì)蝦RNA樣品的制備、RNA的反轉(zhuǎn)錄、PCR檢測(cè)等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用篩選的雄性個(gè)體特有的cDNA序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，只在雄性個(gè)體中具有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此可以在對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育早期，外觀上不能區(qū)分性別的情況下，將雌雄個(gè)體進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明在對(duì)蝦性別控制中具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101709332SQ20091022980
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者李富花, 李詩(shī)豪, 王兵, 相建海, 謝玉素 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所