專利名稱：表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種tapro基因的畢赤酵母工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程，具體地說(shuō)是一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus aurantiacus var. levisporus熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro的畢赤酵母工程菌株 Pichia pastoris GS_TAPR0_18。
(二)
技術(shù)背景蛋白酶又稱蛋白水解酶，是催化分解蛋白質(zhì)肽鍵的一群酶的總稱，它作用于蛋白 質(zhì)，將其分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸，與淀粉酶、脂肪酶并稱三大酶類，不僅參與生物 體的新陳代謝，而且與人們的社會(huì)生產(chǎn)和生活需求密不可分。 按照國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)的規(guī)定，蛋白酶屬于第3大類 水解酶類、4亞類肽水解酶，是一類復(fù)雜的水解酶。按催化機(jī)制，特別是根據(jù)酶活性中心起關(guān) 鍵作用的催化基團(tuán)，可將其分為四大類絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、 金屬蛋白酶。 蛋白酶是一類在生理學(xué)和商業(yè)領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的酶，其在食品和清潔劑 中的應(yīng)用具有悠久的歷史。微生物來(lái)源的蛋白酶，由于培養(yǎng)簡(jiǎn)便，產(chǎn)量豐富，適于工業(yè)化生 產(chǎn)而得以廣泛應(yīng)用。但一般的蛋白酶熱穩(wěn)定性較差，在應(yīng)用中易于失活，因此熱穩(wěn)定性蛋白 酶的研究和開(kāi)發(fā)具有重要的商業(yè)價(jià)值。對(duì)于熱穩(wěn)定蛋白酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)成為當(dāng)前 蛋白酶研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 嗜熱子囊菌光孢變種(T. aurantiacus var. levisporus)是一種生長(zhǎng)上限溫度較 高的嗜熱真菌，能夠在45t: 5(rC的高溫下很好的繁殖生長(zhǎng)。其以酪蛋白為誘導(dǎo)物培養(yǎng)可 分泌蛋白酶，但要使之用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，還存在一些尚未解決的問(wèn)題。如嗜熱子囊菌光 孢變種培養(yǎng)條件比較苛刻，高溫發(fā)酵需要特殊設(shè)備，產(chǎn)酶效率低，造成成本增加，因此限制 了它的應(yīng)用。解決這一問(wèn)題的有效途徑是應(yīng)用分子生物學(xué)手段，將嗜熱子囊菌光孢變種熱 穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因?qū)虢湍钢懈咝П磉_(dá)，利用酵母生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，使熱穩(wěn)定 絲氨酸蛋白酶基因在常溫和短時(shí)間內(nèi)快速、大量表達(dá)，期望達(dá)到降低能耗和提高經(jīng)濟(jì)效益 的目的。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從嗜熱子囊菌光孢變種獲得絲氨酸蛋白酶基因t即ro的全長(zhǎng)cDNA，命名 為tapro(EU364816)，嗜熱子囊菌光孢變種tapro全長(zhǎng)的cDNA為1837bp，包括起始密碼 子和多聚A尾。開(kāi)放閱讀框(0RF)部分為1485bp，編碼494個(gè)氨基酸的一段序列，將此 氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，該蛋白酶為絲氨酸蛋白酶枯草桿菌S8家族，含有 Aspl83/Ser384/His215催化三聯(lián)體，并具有枯草桿菌蛋白酶家族的保守區(qū)DTG、 DG-GHGTH 和GTSMA-ra。 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9K/tapro，利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115，在MD和匪培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母工程菌株GS-TAPR0-18。該工程菌株接種于含BMGY培 養(yǎng)基中，在3(TC 250rpm/min搖床培養(yǎng)7d后，絲氨酸蛋白酶表達(dá)量為1. 15mg/mL，分子量為 59kDa，酶在6(TC是穩(wěn)定的，在7(TC保溫60min，仍有60%的活性，80°C的半衰期為50min，具 熱穩(wěn)定性，在工業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
(四)


圖1絲氨酸蛋白酶基因t即ro PCR產(chǎn)物電泳圖譜 泳道M :Marker-DL5000 泳道1 :cDNA(ORF) 圖2絲氨酸蛋白酶TAPRO的SDS-PAGE分析 (a)泳道M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 泳道1-7 :酵母工程菌Pichia pastoris GS-TAPR0-18的誘導(dǎo)1-7天的表達(dá)情況 泳道8 :轉(zhuǎn)化pPIC9K質(zhì)粒的酵母菌株發(fā)酵液 (b)泳道M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 泳道1、2 :純化的重組絲氨酸蛋白酶TAPRO
(五)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :嗜熱子囊菌光孢變種T. aurantiacus var. levisporus的分離鑒定
(1)標(biāo)本采集從堆肥中采集。 (2)分離培養(yǎng)將采集標(biāo)本取0. 5克放置在PDA平板上5(TC培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離 純化。操作步驟參考Cooney and Emerson(1964)文獻(xiàn)。 (3)鑒定:參考Cooney and Emerson (1964)和LaTouche (1950)文獻(xiàn)。
實(shí)施例2 :絲氨酸蛋白酶基因t即ro的克隆 (1)嗜熱子囊菌光孢變種T. aurantiacus var. levisporus總RNA的提取參照 Trizol試劑盒說(shuō)明。 (2) cDNA第一條鏈的合成按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. 0 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行取1 2 ii g總RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 y L，將RNA樣品在 75t:變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種 成分10mmol/L dNTP Mixture 2iiL，10XRT Buffer (Mg2+) 2 ii L， 25mmol/L MgCl2 4yL， Oligo d(T)-Adaptor Primer 1 li L，RNaselnhibiter 0. 5uL，AMV Reverse Transcriptase 1 ii L (Final Volume 20 y L)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42。C溫育60min，再煮 沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 y L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 y L，混勻，稍微離心， 保存于-2(TC，備用。
(3)絲氨酸蛋白酶中間片斷序列的分離上游引物序列為PS1 : 5， -GGYCAYGGHACTCACTGC-3'，下游引物為PA1 :5' -GGRGTGGCCATRGARGTACC-3，。
(4)3'禾P5'序列的分離按照TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0使用說(shuō)明進(jìn)行。 蛋白酶基因3'-RACE所用引物為P3-l、P3-2、01igo dT-Ad即torprimer和M13 Primer M4， 其序列為P3-1 :5' -CTCGGTGGAGGCAAATC-3，
P3-2 :5' -GGCATCCACTTCGCTGT-3'M13 Primer M4 :5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3'Oligo dT-Adaptor primer :包含dT區(qū)域及M13Primer M4序列。 蛋白酶基因5'端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，以基因組DNA為模版，所用引
物為3個(gè)向外的特異巢式引物P5-l、P5-2、P5-3，以及上游公共兼并引物ADpAD2、AD3、AD4、
ADs，其序列為P5-1 :5' -ACCGGCACCAACATCGACCATG-3'
P5-2 :5' -ACGCTGCCAATGACGGTGAGG-3'
P5-3 :5' -AGATTCGCAGGCATCCGGACG-3'AD丄5，-NTCGASTWTSGWGTT-3'
AD25，-NGTCGASWGANAWGAA--3，AD35，-WGTGNAGWANCANAGA--3，AD45，-TGWGNAGSANCASAGA--3，AD55，-AGWGNAGWANCAWAGG--3， (5)基因克隆取0.5iU PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按照 TAKARA公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，在表面涂有X-gal 和IPTG的含氨卞青霉素(lOOyg/mL)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。 (6)質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。 (7)序列測(cè)定DNA雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進(jìn)行，序
列引物為M13啟動(dòng)子引物。嗜熱子囊菌光孢變種t即ro全長(zhǎng)的cDNA為1837bp，包括起始
密碼子和多聚A尾。開(kāi)放閱讀框部分為1485bp，編碼494個(gè)氨基酸的一段序列，將此氨基
酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)該蛋白酶為絲氨酸蛋白酶枯草桿菌S8家族，含有
Aspl83/Ser384/His215催化三聯(lián)體，并具有枯草桿菌蛋白酶家族的保守區(qū)DTG、 DG-GHGTH
和GTSMA-ra。 該序列如下 (A) SEQ ID NO 1的信息 (a)序列特征*長(zhǎng)度1837堿基對(duì)；*類型核酸；*鏈型雙鏈；*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否 (e)最初來(lái)源嗜熱子囊菌光 包變種T. aurantiacus var. levisporus
(f)序列描述 1 CGTCTCTCCA ACTTCCATCG TTCATCTTGA ATCTCCTGCA CTCATCTATC
TCTCTGGTCC61 AGCGGTGTTC CTTCCCTTGT CCGCCATCAT GAAAGGCATC CTTGGCCTTT
CTCTCCTCCC 121 GCTGCTGACC GCTGCGTCAC CCGTCGTCGT AGACTCGATT CACAACGGGG CAGCTCCAGT
181 TCAAGAAGCA
241 ACCTGGAGTT
301 ACGATGCCTT
361 CGGGACACTT
421 TTGAGAGAGA
481 GGGGTCTGGC
541 TGTACGCTGC
601 TCGACCATGT
661 AAGACGTTGA
721 ACGGTGTCGC
781 GAACCATGTC
841 TCGAAGCCGC
901 TCGGTGGAGG
961 TCCACTTCGC
1021 CTGCGGAGAA
1081 CCAACTATGG
1141 TCGGCAGCAA
1201 CGGGTCTGCT
1261 ACAAGCTTAC
1321
CCTCTCATCG TGTCACCCCG CGAGAACCAG CGGGGGCCTG CGATGAGAGT CTCGGAGGTC CCGTATCTCG CAATGGCGGT CGACTTCGAA TGGTAATGGT CAAGAAGGCC CGATGTCGTC CAAGAAGGGC CAAATCCGTG TGTCGCCGCT GGCCATCACC CAAGTGCAAC GTATGCAGTG GGCCTACTTC CCCCAAGAAG
TCGAACGCGA
GAATCCGCTG
CGGACGGAGC
AAACACACAT
GTCATCGAGC
CACACCATGG
CATCGGGACA
GAGGGCGTTG
GGCCGTGCAT
CATGGCACCC
AACGTCTACG
AAGGGTGTCG
AAGGCCAAGG
ACTCTCGACA
GGCAACGACA
GTTGGTGCCT
GACATCTTTG
AACACCATCT
CTCTCCCTCC
CTGAAGGAGA 6
AGGAAATTCC CCGCTCACCA TGCGGAAGCG ACAACATCGC AGATTCGCAG AGGACCCAGA GCCTGAGCTT ACGTCTACGT CCTGGGGAAA ACTGCTCCGG CCGCCAAAGT AATGGGAGGC GCTTCAAGGG TGGCTGTCAA ACGCTGACTC CGACTCTCGC CCCCTGGTCT CTGGTACCTC AGCCCTCAAA CTATCATCTC
CGACTCCTAC GAGCTGGGTG CTCCCGGTTC TGGCTCGCTC GCATCCGGAC GATTGAAAGG CGGTACCTTT CATCGACACC GACTATTCCG CACCATCGCT GCTCAAGTCC TCAGGCTCAC AAGTGTTGCC CGCAGCTGTT GTGCAACTTC AGATGAGCGT GAACATCCTC GATGGCCTCT GGATTCTGCC CATTGCTACC
ATCGTCGTGT CAGGACATCC CCCTTCAGGG CTGGGCTACT GTTGACTTCG AACGCCCCTT AACAAGTACC GGCACCAACA ATTGGCGATG GGTAAGAAGT AACGGCTCCG CTCCAGAAGG AACATGAGTC GACGCTGGCA TCTCCTGCCG GCTTATTTCT TCCACCTGGA CCCCACATTG TTTGCTGTTG GAGGGAGCTCTCACTGATGT
1381 ACTACACCGA
1441 AGGGTATCAT
1501 TCAAGGATGC
1561 ACACTATATA
1621 GCAGCTTGCT
1681 TTATCCTCAT
1741 AGAAGTATAC
1801
CCCAGAGGAC ACCCCCAACC TCCTGGCCTG GAACGGCGGT GGCTCTTCTA
CATCGTGTCC AAGGGCGGCT ACAAGGTGGC TACCTTCGAA AACAAGGTCG
GAGCAAGGCT GAGAAGCTCA GAGAGGAGCT TCATGCCATC TACAGCGAGA
TGTTACTGCG TAGATTAATG ATTGGAGCAT GTCACGACCG TCACGACCGA
TTTTGTTCGC TGCTGATGCA TGGAATGGAT AGCTGGATAC ACTCCCCGGC
TTTTACGCCT TTAATATTGA CTTCCCCAGA CCCTAGATTC AATGGTTGCA
TGTATGTGTC CTGTTTTCGG TCTTATTGTT ATCCTAGCAT ACACGCCGAG
性
ATTTGAGCAC GGTATTTACA GCAAAAAAAA AAAAAAA (B) SEQ ID NO 2的信息
(a) 序列特征*長(zhǎng)度494氨基酸；*類型氨基酸；*鏈型單鏈；*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線
(b) 分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述1MKGILGLSLLPLLTAASPVVVDSIHNGAAPVLSSS薩EIPDSYIVVFKKHVTPESAMH61QSWVQDIHLEFENQRTELRKRSRFPFRDDAFGGLKHTYNIAGSLLGYSGHFDESVIEQIR121RHPDVDFVERDSEVHTMEDPEIERNAPWGLARISHRDSLSFGTFNKYLYAANGGEG麗Y181VIDTGTNIDHVDFEGRASWGKTIPIGDEDVDGNGHGTHCSGTIAGKKYGVAKKA證AAK241VLKSNGSGTMSDVVKGVEWEAQAHLQKVEAAKKGKAKGFKGSVA醒SLGGGKSVTLD廳301NMVDAGIHFAVAAGNDNADSCNFSPAAAEKAITVGASTLADERAYFSNYGKCNDIFAPG361LNILSTWIGSKYAVNTISGTSMASPHIAGLLAYFLSLQPSKDSAFAVDKLTPKKLKETII421SIATEGALTDVPEDTPNLLA麗GGGSSNYTDIVSKGGYKVATFENKVEGIMSKAEKLREE481LHAIYSEIKDAVTA 實(shí)施方式3 :表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)根據(jù)分離出的t即ro基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，在引物的5'端分別引
入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)
上游引物5' -CCG GAATTC TCACCCGTCGTCGTAGACTCGAT-3' (EcoR I) 下游引物5， -TT]GCGGCCGQCTACGCAGTAACAGCATCCTTGAT-3， (Not I) (2)嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取利用Trizol試劑提取。 (3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈按照TaKaRa公司的TaKaRa RNA PCR kit (AMV)
Ver3. 0試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以O(shè)ligo dT-Adaptor primer為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件為42t:溫育60min，再煮沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 y LDEPC處理的ddH20，稀釋 至200 ii L，混勻，稍微離心，保存于_20°C ，備用。 (4)PCR反應(yīng)(25iiL) :cDNA 2 ii L， lOXBuffer 2. 5 ii L， 1Ommol/L dNTP2 ii L， 25mmol/L MgCl2 2 ii L，上、下游弓|物各1 ii L， Taq DNA聚合酶0. 5 ii L(5U/ ii L) ， ddH20 14ii L。 94t:預(yù)變性4min ;然后進(jìn)行以下循環(huán)94"C變性lmin，58t:退火lmin，72t:延伸 2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72"延伸10min ;1(TC保溫。 (5)基因克隆取O. 5iiL PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì) 粒pMD18-T/tapro操作步驟按TAKARA公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 a ，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過(guò)夜。 (6)質(zhì)粒DNA提取堿法提取質(zhì)粒DNA 。 (7)用EcoR I和Not I對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T/t即ro產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用EcoR I和Not I雙酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K， DNA膠回收試劑盒回收純化t即ro基因及載體 pPIC9K片斷。然后進(jìn)行體外連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K/t即ro，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，在含Amp的LB轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，測(cè)序確 認(rèn)重組質(zhì)粒的讀碼框正確。 實(shí)施例3.表達(dá)絲氨酸蛋白酶基因t鄰ro的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選 (1)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/t即ro用限制性內(nèi)切酶Xba
I線性化。 (2)轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法 參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。 (3)篩選用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在匪和MD平板上，3(TC培養(yǎng)2-4d， 挑取在MD/匪平板上均生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于 1. 00mg/mL， 2. 00mg/mL， 3. 00mg/mL， 4. 00mg/mL G418的YPD平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施方式4 :畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導(dǎo)表達(dá)和活性檢測(cè)
(1)將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，28 3(TC振蕩培 養(yǎng)(200 250rpm)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(0D6。。達(dá)2 6，約16 18h)。離心收集菌體，將細(xì)胞重懸 于適當(dāng)體積的B匪Y培養(yǎng)基中，至OD,值為1. 0 2. O(約100 200mL) ;28 30。C 250rpm/ min繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為1 %以維持誘導(dǎo)，每24h取樣，直至192h。 每次取誘導(dǎo)培養(yǎng)液lmL于1. 5mL離心管中，室溫下以最大轉(zhuǎn)速離心2 3min，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE分析。 (2)酶活性檢測(cè)采用Rich法(1974)，稍加改進(jìn)，測(cè)定誘導(dǎo)上清液中的蛋白酶活 性。反應(yīng)體系如下0. lmL酶液加入0. 2mL 0. 5%酪蛋白溶液、0. 05MTris-HCl (pH 8. 0)或 者0.2M CH3C00H/CH3C00Na(pH 5. 0)緩沖液中，50。C保溫30min。加入0. 2mL 10%三氯乙 酸(TCA)溶液終止反應(yīng)，室溫下靜置30min后，將反應(yīng)液離心，取上清0. 5mL加2. 5mL的蒸 餾水，在280nm處用日本產(chǎn)UV-1601比色測(cè)光密度，對(duì)照在加酶液前加10% TCA，其余相同。 在上述反應(yīng)條件下，酶活性單位定義為lmin水解酪蛋白釋放1 P g酪氨酸所需的酶量。蛋 白含量測(cè)定采用Bradford法。 (3)重組絲氨酸蛋白酶TAPRO的最適反應(yīng)溫度、pH及熱穩(wěn)定性誘導(dǎo)表達(dá)的重組絲氨酸蛋白酶經(jīng)過(guò)DEAE-S印harose陰離子交換柱層析，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組絲氨酸蛋白酶測(cè)定其性質(zhì)。在不同溫度和pH條件下分別測(cè)定重組絲氨酸蛋白酶的酶活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同溫度條件下絲氨酸蛋白酶的相對(duì)酶活性；將重組絲氨酸蛋白酶在不同的溫度下保溫不同的時(shí)間(10min，20min，30min，40min，50min，60min)后，檢測(cè)剩余酶活力。 實(shí)施方式5 :表達(dá)t即ro基因的畢赤酵母工程菌株GS-TAPR0-18的保藏表達(dá)tapro基因的畢赤酵母工程菌株GS-TAPR0-18的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通
微生物中心(CGMCC);地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期
2009年9月1日；酵母工程菌株編號(hào)為CGMCC No. 3257 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為
巴氏畢赤酵母Pichi即astoris。 序列表 〈110〉山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 〈120〉表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種t即ro基因的畢赤酵母工程菌株 〈140〉 〈141〉 〈160>1 〈170>pantent In 3. 1 〈210>1 〈211〉 〈212>cDNA 〈213>Thermoascus aurantiacus var. levisporus 〈221>1_1837 〈400〉 1 1 CGTCTCTCCA ACTTCCATCG TTCATCTTGA ATCTCCTGCA CTCATCTATC
TCTCTGGTCC
61CTCTCCTCCC
121CAGCTCCAGT
181TCAAGAAGCA
241ACCTGGAGTT
301ACGATGCCTT
361CGGGACACTT
421TTGAGAGAGA
AGCGGTGTTC CTTCCCTTGT CCGCCATCAT GAAAGGCATC CTTGGCCTTT
GCTGCTGACC GCTGCGTCAC CCGTCGTCGT AGACTCGATT CACAACGGGG
CCTCTCATCG TCGAACGCGA AGGAAATTCC CGACTCCTAC ATCGTCGTGT
TGTCACCCCG GAATCCGCTG CCGCTCACCA GAGCTGGGTG CAGGACATCC
CGAGAACCAG CGGACGGAGC TGCGGAAGCG CTCCCGGTTC CCCTTCAGGG
CGGGGGCCTG AAACACACAT ACAACATCGC TGGCTCGCTC CTGGGCTACT
CGATGAGAGT GTCATCGAGC AGATTCGCAG GCATCCGGAC GTTGACTTCG
481 GGGGTCTGGC
541 TGTACGCTGC
601 TCGACCATGT
661 AAGACGTTGA
721 ACGGTGTCGC
781 GAACCATGTC
841 TCGAAGCCGC
901 TCGGTGGAGG
961 TCCACTTCGC
1021 CTGCGGAGAA
1081 CCAACTATGG
1141 TCGGCAGCAA
1201 CGGGTCTGCT
1261 ACAAGCTTAC
1321 TCACTGATGT
1381 ACTACACCGA
1441 AGGGTATCAT
1501 TCAAGGATGC
1561 ACACTATATA
1621
CTCGGAGGTC CCGTATCTCG CAATGGCGGT CGACTTCGAA TGGTAATGGT CAAGAAGGCC CGATGTCGTC CAAGAAGGGC CAAATCCGTG TGTCGCCGCT GGCCATCACC CAAGTGCAAC GTATGCAGTG GGCCTACTTC CCCCAAGAAG CCCAGAGGAC CATCGTGTCC GAGCAAGGCT TGTTACTGCG TTTTGTTCGC
CACACCATGG
CATCGGGACA
GAGGGCGTTG
GGCCGTGCAT
CATGGCACCC
AACGTCTACG
AAGGGTGTCG
AAGGCCAAGG
ACTCTCGACA
GGCAACGACA
GTTGGTGCCT
GACATCTTTG
AACACCATCT
CTCTCCCTCC
CTGAAGGAGA
ACCCCCAACC
AAGGGCGGCT
GAGAAGCTCA
TAGATTAATG
TGCTGATGCA 10
AGGACCCAGA GCCTGAGCTT ACGTCTACGT CCTGGGGAAA ACTGCTCCGG CCGCCAAAGT AATGGGAGGC GCTTCAAGGG TGGCTGTCAA ACGCTGACTC CGACTCTCGC CCCCTGGTCT CTGGTACCTC AGCCCTCAAA CTATCATCTC TCCTGGCCTG ACAAGGTGGC GAGAGGAGCT ATTGGAGCAT TGGAATGGAT
GATTGAAAGG CGGTACCTTT CATCGACACC GACTATTCCG CACCATCGCT GCTCAAGTCC TCAGGCTCAC AAGTGTTGCC CGCAGCTGTT GTGCAACTTC AGATGAGCGT GAACATCCTC GATGGCCTCT GGATTCTGCC CATTGCTACC GAACGGCGGT TACCTTCGAA TCATGCCATC GTCACGACCG AGCTGGATAC
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編碼的氨基酸序列為1MKGILGLSLLPLLTAASPVVVDSIHNGAAPVLSSSNAKEIPDSYIVVFKKHVTPESAAAH61QSWVQDIHLEFENQRTELRKRSRFPFRDDAFGGLKHTYNIAGSLLGYSGHFDESVIEQIR121RHPDVDFVERDSEVHTMEDPEIERNAPWGLARISHRDSLSFGTFNKYLYAANGGEGVDVY181VIDTGTNIDHVDFEGRASWGKTIPIGDEDVDGNGHGTHCSGTIAGKKYGVAKKANVYAAK241VLKSNGSGTMSDVVKGVEWEAQAHLQKVEAAKKGKAKGFKGSVA醒SLGGGKSVTLDMAV301NMVDAGIHFAVAAGNDNADSCNFSPAAAEKAITVGASTLADERAYFSNYGKCNDIFAPG361LNILSTWIGSKYAVNTISGTSMASPHIAGLLAYFLSLQPSKDSAFAVDKLTPKKLKETII421SIATEGALTDVPEDTPNLLA麗GGGSSNYTDIVSKGGYKVATFENKVEGIMSKAEKLREE
481LHAIYSEIKDAVTA
權(quán)利要求
一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種tapro基因的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過(guò)RT-PCR及RACE，TAIL-PCR等方法從嗜熱子囊菌光孢變種(T.aurantiacus var.levisporus)獲得熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K/tapro，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro的畢赤酵母工程菌株GS-TAPRO-18。
全文摘要
本發(fā)明是一種表達(dá)嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro的畢赤酵母工程菌Pichia pastorisGS-TAPRO-18。通過(guò)RT-PCR及RACE，TAIL-PCR等方法從嗜熱子囊菌光孢變種(T.aurantiacus var.levisporus)獲得熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K/tapro，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶基因tapro的畢赤酵母工程菌株GS-TAPRO-18。該工程菌蛋白酶表達(dá)量高達(dá)1.15mg/mL，酶活為178.92U/mL，酶在60℃是穩(wěn)定的，在70℃保溫60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期為50min，具熱穩(wěn)定性，在工業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101717734SQ20091023014
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者張佳, 張婕, 李多川, 李安娜, 謝晨 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)