專利名稱：植物乳桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一株優(yōu)良乳酸菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物胺是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類有機(jī)化合物。主要有酪胺、組胺、腐 胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺。在人體內(nèi)積累到較高數(shù)量時(shí)就會(huì)產(chǎn)生毒害，如外部 血管膨脹導(dǎo)致高血壓和頭痛，以及腸道平滑肌的收縮造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等，嚴(yán)重的 還會(huì)危及生命。
食品中常見的8種生物胺中精胺和亞精胺是原料中帶來的，其它生物胺均由微生
物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶催化氨基酸脫羧產(chǎn)生的，主要存在于蛋白質(zhì)含量高的發(fā)酵食品中。
發(fā)酵肉制品中生物胺含量已受廣大關(guān)注，國外學(xué)者已做了大量的調(diào)查，認(rèn)為生物胺在發(fā)酵
肉制品中普遍存在，特別是在發(fā)酵香腸中，一些產(chǎn)品中生物胺遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了FDA規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
例如，傳統(tǒng)中式香腸屬自然發(fā)酵香腸，其中微生物菌系及其復(fù)雜。在本課題組的調(diào)查研究中
發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中式香腸中生物胺含量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高國外學(xué)者報(bào)道，生物胺含量達(dá)1651.84mg/kg。對(duì)
消費(fèi)者的健康有重要影響。發(fā)酵肉制品中主體生物胺一般為酪胺，腐胺和尸胺。 目前在傳統(tǒng)肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中對(duì)生物胺的控制主要從兩方面可以實(shí)現(xiàn)一是控制
產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，另一方面采用能夠產(chǎn)生物胺氧化酶的微生物產(chǎn)生的生物胺氧化酶，減少生
物胺積累。例如，在傳統(tǒng)中式香腸中主要的產(chǎn)胺菌是腸細(xì)菌，腸細(xì)菌產(chǎn)生生物胺是在對(duì)數(shù)生
長(zhǎng)后期，并且菌數(shù)達(dá)到一定濃度時(shí)才協(xié)同產(chǎn)生生物胺。所以抑制腸細(xì)菌的生長(zhǎng)，把腸細(xì)菌控
制在最低濃度，是有效控制生物胺產(chǎn)生的重要措施。 因此，為控制傳統(tǒng)中式香腸中生物胺的產(chǎn)生和累積，以生長(zhǎng)能力強(qiáng)，抑制腸細(xì)菌能 力強(qiáng)，產(chǎn)生物胺氧化酶為目的，從生物胺含量低的傳統(tǒng)中式香腸樣品中分離篩選出一株植 物乳桿菌，可有效控制生物胺的產(chǎn)生和累積。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中產(chǎn)胺菌會(huì)產(chǎn)生生物胺，篩選一種能夠 在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生生物胺氧化酶，氧化酪胺，組胺，苯乙胺和色 胺的植物乳桿菌菌株及其應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一 種植物乳桿菌(Lactobaci 1 lusplantarum) xlbf001菌株，其特征在于菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 3166，菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上， 37t:培養(yǎng)36h，在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集，白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭 毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，發(fā)酵核糖時(shí)產(chǎn)生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽；該菌株在 普通顯微鏡下呈桿狀形，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ890357。
在本發(fā)明中所述的MRS瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸 檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳 0. 25g，瓊脂18克，蒸餾水1000mL，pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液體培養(yǎng)基為蛋白胨
310g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4。 —種上述植物乳桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于將菌株活化、擴(kuò)培、菌體收集后形成發(fā)酵劑，在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺，組胺，苯乙胺和色胺。 在所述植物乳桿菌菌株的應(yīng)用中所述的菌株活化是指從斜面挑取菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時(shí)，試管中的接種量為106cfu/ml，取菌液接種活化至少反復(fù)三次；所述的擴(kuò)培是指將活化的菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶中的接種量為106cfu/ml，37t:靜置培養(yǎng)22小時(shí)，形成富集菌種的菌液；所述的菌體收集是指取富集菌種的菌液于無菌離心管中，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，在無菌條件下棄去上清液獲得菌體； 在所述植物乳桿菌菌株的應(yīng)用中所述的發(fā)酵劑是指將收集到的菌體用無菌生理水洗出直接作為發(fā)酵劑，或?qū)⑹占降木w加入保護(hù)劑冷凍干燥，制成的干粉發(fā)酵劑。 保護(hù)劑為15%的脫脂乳+甘油50mL/L+蔗糖30g/L5+麥芽糊精10g/L+谷氨酸鈉20g/L+酵母浸提膏20g/L。 在所述植物乳桿菌菌株的應(yīng)用中所述的產(chǎn)胺菌是指屎腸球菌，糞腸球菌，產(chǎn)氣腸桿菌，大腸埃希桿菌，陰溝腸桿菌；所產(chǎn)生的生物胺分別是酪胺，腐胺，尸胺，苯乙胺；產(chǎn)生的生物胺氧化酶可氧化降解的生物胺為酪胺，苯乙胺，色胺和組胺。 在所述植物乳桿菌菌株的應(yīng)用中在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)的配方中發(fā)酵劑的加入量為106—7cfu/g，同時(shí)需要加入1. 5%的葡萄糖。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001生長(zhǎng)能力強(qiáng)，富集培養(yǎng)后培養(yǎng)基中菌體濃度達(dá)1(^cfu/ml，發(fā)酵劑制備工藝簡(jiǎn)單，將獲得的菌體置于保護(hù)劑，可以在生產(chǎn)干粉發(fā)酵劑時(shí)減少植物乳桿菌的失活率，發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中能有效抑制腸細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，控制生物胺的產(chǎn)生，另外本菌株產(chǎn)生的生物胺氧化酶，可減少生物胺的累積。


圖1是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbfOOl菌株在普通顯微鏡下的圖片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l 菌株的篩選和保藏 本菌株是從傳統(tǒng)中式香腸中分離出來不產(chǎn)生物胺的菌株，將分離到菌株培養(yǎng)液離心，取上清液，觀察上清液對(duì)五種產(chǎn)胺菌的抑制能力。并將其接入含有生物胺的培養(yǎng)基中，檢測(cè)氧化減少生物胺能力。 該菌屬革蘭氏陽性菌，白色菌落，直桿，成短鏈，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，發(fā)酵核糖時(shí)產(chǎn)生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，硫化氫產(chǎn)生陰性，凝固酶 陰性；該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀(見圖1)。 該菌株根據(jù)Gen bank比對(duì)結(jié)果，命名植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) xlbf001，于2009年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 號(hào)為CGMCC No. 3166。以U968和L1401為引物擴(kuò)增的該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào) 為GQ890357。
實(shí)施例2 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001對(duì)產(chǎn)胺菌的抑制作用
實(shí)驗(yàn)用產(chǎn)胺菌屎腸球菌 培養(yǎng)基MRS瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g， 葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，瓊脂18克， 蒸餾水1000mL， pH值6. 2-6. 4)
實(shí)驗(yàn)方法 將傳統(tǒng)中式香腸中優(yōu)勢(shì)產(chǎn)胺腸細(xì)菌屎腸球菌涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基；將24小時(shí) 37t:培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001菌液，8000轉(zhuǎn)離心10分鐘， 用無菌槍頭吸取上清液于無菌離心管中。取已滅菌的直徑為0. 6cm濾紙沾取此上清液，并 放置于上述接種腸細(xì)菌的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，觀察抑菌圈。抑菌圈直徑為大于1. Ocm，說明 xlbf001對(duì)屎腸球菌有抑制作用。 用同樣的方法分別對(duì)糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希桿菌以及陰溝腸桿菌，抑菌 圈均大于1. Ocm，證明xlbf001對(duì)上述產(chǎn)胺菌具有相同的抑制作用。
實(shí)施例3植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001氧化生物胺的作用。
生物胺酪胺、苯乙胺、色胺和組胺。 培養(yǎng)基改良MRS液體培基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨 2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣 0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4)
實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分成五個(gè)組，在各組改良MRS液體培養(yǎng)基中分別加入500ug/ml的酪胺、苯乙 胺、色胺、組胺和對(duì)照組，115t:滅菌15min ;冷卻后實(shí)驗(yàn)組接入植物乳桿菌(Lactobacillus plantar咖)xlbf001，接種量為106cfu/ml， 37°C ，搖床(85轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)72小時(shí)，HPLC測(cè) 各組生物胺濃度的變化，其中酪胺減少了 227. 32ug/ml，苯乙胺減少了 255. 09yg/ml，色胺 減少了 178. 36/ml，組胺減少了 210. 8ii g/ml。說明植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) xlbf001對(duì)酪胺、苯乙胺、色胺和組胺氧化降解作用明顯。
實(shí)施例4
菌體的收集 培養(yǎng)基改良MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨 2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，碳酸鈣 0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml ，蒸餾水1000mL， pH值6. 2 6. 4。
稱取上述培養(yǎng)基，放800ml蒸餾水中，加熱并攪拌均勻至完全溶解后，補(bǔ)水至lOOOml。再次攪拌均勻后，分裝于試管中，并用橡皮篩塞緊后，滅菌，以備活化用。將做好的
培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，滅菌后用于擴(kuò)培。 1、活化 從斜面挑取菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時(shí)，試管中的接種量為1(fcfu/ml，取菌液接種活化至少反復(fù)三次。
2、擴(kuò)培 將活化的菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶中的接種量為1(fcfu/ml，37t:靜置培養(yǎng)22小時(shí)，形成富集菌種的菌液。
3、菌體收集 取富集菌種的菌液于無菌離心管中，10000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，無菌條件下棄去上清
液。即收集到菌體。
實(shí)施例5
發(fā)酵劑的制備 1、將收集到的菌體用無菌生理水洗出，形成發(fā)酵劑。 2、將收集到的菌體置于保護(hù)劑中，制成干粉發(fā)酵劑，其中，保護(hù)劑為15%的脫脂乳+甘油50mL/L+蔗糖30g/L5+麥芽糊精10g/L+谷氨酸鈉20g/L+酵母浸提膏20g/L。
實(shí)施例6 在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用(以廣式香腸為例) 配方去皮豬肉，肥瘦比為1 : 3，含硝精鹽2.5% (每公斤食鹽中加入6g亞硝酸鈉)，葡萄糖1. 5 % ，蔗糖2 % ，生抽1 % ，汾酒4% ，香辛料適量，實(shí)施例5中制備的發(fā)酵劑106cfu/g。 加工方法 1.將肥肉切成約0. 5cm 放入IO(TC沸水中浸1小時(shí)，用冷水沖洗去浮油，瀝干，拌上汾酒，蔗糖，4°C 6°C腌制8小時(shí)。 2.把瘦肉用絞肉機(jī)絞碎或用刀切成黃豆粒大小的碎塊，加入含硝精鹽，香辛料，生抽和葡萄糖拌均，4t: 6t:腌制24小時(shí)后，加入發(fā)酵劑拌均。 3.將肥瘦肉放在一起拌勻，灌腸后，用溫水洗去腸體表面浮油，并用針在腸表面扎孔，便于放氣。 4.瀝水后，日曬或煙熏2 3天后，陰干成熟一個(gè)月，即可食用。 以本發(fā)明生產(chǎn)的廣式香腸樣品中，生物胺總量低于同期生產(chǎn)的未加發(fā)酵劑的廣式
香腸樣品(下稱對(duì)照組)的60%以上。本發(fā)明生產(chǎn)的樣品成熟結(jié)束時(shí)檢測(cè)不到腸細(xì)菌，而對(duì)
照組樣品中腸細(xì)菌量為102cfu/g。本發(fā)明生產(chǎn)的樣品中成熟結(jié)束時(shí)乳酸菌含量為108cfu/
g，對(duì)照組樣品中乳酸菌數(shù)為105cfu/g?？梢?，植物乳桿菌xlbf001的迅速繁殖可有效抑制
腸細(xì)菌，抑制生物胺產(chǎn)生，減少生物胺累積。 以上各實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的具體限制。
權(quán)利要求
一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其特征在于菌株的保藏號(hào)為CGMCC No.3166，菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36h，在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集，白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，發(fā)酵核糖時(shí)產(chǎn)生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽；該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ890357。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其特征在 于所述的MRS瓊脂培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄 糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g，硫酸錳0. 25g，瓊脂18克，蒸餾 水1000mL， pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液體培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母 膏5g，檸檬酸氫三銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 5g， 硫酸錳0. 25g，碳酸鈣0. 4g，半胱氨酸鹽酸鹽，乳精粉7. 5g，啤酒65ml ，蒸餾水1000mL， pH值 6. 2 6. 4。
3. —種保藏號(hào)為CGMCC No. 3166的植物乳桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于將菌株活化、 擴(kuò)培、菌體收集后形成發(fā)酵劑，在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生生物胺氧化 酶，氧化降解生物胺。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的保藏號(hào)為CGMCC No. 3166的植物乳桿菌菌株的應(yīng)用，其特征 在于所述的菌株活化是指從斜面挑取菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置 培養(yǎng)24小時(shí)后，取菌液再接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的試管中37t:靜置培養(yǎng)22小時(shí)， 試管中的接種量為106cfu/ml，取菌液接種活化至少反復(fù)三次；所述的擴(kuò)培是指將活化的 菌液接種于裝有改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶中的接種量為1(fcfu/ml，37t:靜 置培養(yǎng)22小時(shí)，形成富集菌種的菌液；所述的菌體收集是指取富集菌種的菌液于無菌離 心管中，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，在無菌條件下棄去上清液獲得菌體；獲得的菌體可做為發(fā)酵 劑直接應(yīng)用，也可以制成干粉發(fā)酵劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的保藏號(hào)為CGMCC No.3166的植物乳桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵劑是指將收集到的菌體用無菌生理水洗出直接作為發(fā)酵劑，或在菌體中加入保護(hù)劑后冷凍干燥，制成干粉發(fā)酵劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的保藏號(hào)為CGMCC No.3166的植物乳桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的產(chǎn)胺菌是指屎腸球菌，糞腸球菌，產(chǎn)氣腸桿菌，大腸埃希桿菌，陰溝腸桿菌 (發(fā)酵肉制品中常見的產(chǎn)胺菌)；所產(chǎn)生的生物胺是指酪胺，腐胺，尸胺，苯乙胺；該菌株產(chǎn) 生的生物胺氧化酶可氧化降解的生物胺是酪胺，組胺，苯乙胺和色胺。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3 6之一所述的保藏號(hào)為CGMCC No. 3166的植物乳桿菌菌株的應(yīng) 用，其特征在于在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中發(fā)酵劑的加入量為106—7cfu/g，同時(shí)需要加入1. 5% 的葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為CGMCC No.3166的一種植物乳桿菌菌株，該菌株可在改良MRS液體培養(yǎng)基中富集。在MRS固體培養(yǎng)基上白色菌落，直桿，成短鏈，革蘭氏陽性，無鞭毛，同型發(fā)酵，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，發(fā)酵核糖時(shí)產(chǎn)生乙酸和乳酸，不還原亞硝酸鹽。應(yīng)用中將菌株活化、擴(kuò)培、菌體收集后形成發(fā)酵劑，在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生生物胺氧化酶，氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和組胺。其優(yōu)點(diǎn)是植物乳桿菌生長(zhǎng)能力強(qiáng)，發(fā)酵劑制備工藝簡(jiǎn)單，發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中能有效抑制腸細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，控制生物胺的產(chǎn)生，其產(chǎn)生的生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和組胺的含量，它作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵肉制品可有效減少生物胺的累積。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101724591SQ20091023240
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者劉登勇, 盧士玲, 周光宏, 徐幸蓮, 舒蕊華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)