專利名稱：一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株微生物及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腐胺的化學(xué)名稱為1，4-丁二胺，生物化學(xué)試劑和藥物中間體。也是尼龍-46、尼 龍_6及尼龍-66的原料，尤其是尼龍-46廣泛用于汽車、摩托車的零部件材料，以代替金 屬；尼龍-66用于電子產(chǎn)品的材料；酸性氣體吸收劑。目前，制備方法有四種(l)丙烯腈與 氰化氫反應(yīng)，生成乙二氰，在催化劑作用下加氫而得；(2)以吡咯為原料，在碳酸鈉存在下 與鹽酸羥胺反應(yīng)，生成丁二肟，再在鈉汞齊作用下，在無水乙醇中加熱而得；(3)以2，5_二 氨基戊酸為原料，加熱催化脫羧而得。由此可見，目前腐胺的生產(chǎn)方式能源消耗量大，對環(huán) 境也有污染。我國腐胺需求量大，但國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量有限，從國外進(jìn)口價(jià)格很 高。 通過微生物代謝產(chǎn)生腐胺(鳥氨酸在微生物產(chǎn)生的鳥氨酸脫羧酶的作用下，脫羧 產(chǎn)生腐胺)，獲得高濃度腐胺液，然后分離腐胺，可降低腐胺的生產(chǎn)成本和能源消耗，也成為 研究的主要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前腐胺生產(chǎn)存在的問題，提供一種微生物并通過該微 生物代謝產(chǎn)生腐胺，獲得高濃度腐胺液。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一 株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) xlcad001，其特征在于保藏號(hào)為CGMCC No. 3162，菌落在VRBDA瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 24h，紅白色菌落，1.0-1. 5X0. 3-0.6ym，短桿，革蘭氏陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，該菌株在普 通顯微鏡下呈桿狀，該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ890353。 在本發(fā)明中，VRBDA培養(yǎng)基為酵母浸膏3g，蛋白胨7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖 10g，中性紅0. 03g，結(jié)晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
—株保藏號(hào)為CGMCC No. 3162的陰溝腸桿菌的應(yīng)用，其特征在于從斜面挑取菌 落接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時(shí)，試管中的接種量為105cfu/ml。在 相同培養(yǎng)基反復(fù)活化五次后；將最后活化后的菌液接種到B培養(yǎng)基中37t:靜止培養(yǎng)4天， 接種量為106cfu/ml ;將培養(yǎng)后的菌液10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液， 高濃度腐胺液的腐胺含量為4452. 74ii g/ml ; 所述的A培養(yǎng)基為加入O. 1% L-鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基；所述的B液體 培養(yǎng)基為加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基。
在本發(fā)明中，腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基為蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷 酸二氫鈉8g，蒸餾水1000mL，在115。C滅菌15min， pH值7. 2 7. 4。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)xlcad001產(chǎn)腐胺 能力強(qiáng)，在上述方法制得的培養(yǎng)液中，腐胺含量可達(dá)到4452. 74ii g/ml，用此方法生產(chǎn)腐胺將極大降低生產(chǎn)成本和減少污染。


圖1是陰溝腸桿菌在普通顯微鏡下的照片；
圖2是標(biāo)樣的高效液相色譜圖； 圖3是高效液相檢測陰溝腸桿菌培養(yǎng)液的色譜圖；
圖4是高效液相檢測腐胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 菌株的篩選和保藏 培養(yǎng)基 腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鈉8g，蒸 餾水1000mL，在115。C滅菌15min， pH值7. 2 7. 4。 下層培養(yǎng)基蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化鈉2. 5g，葡萄糖0. 5g，吐溫lg， 硫酸鎂0. 4g，硫酸錳0. 03g，磷酸氫二鉀2g，擰檬酸三銨2g，碳酸*丐0. lg，硫酸亞鐵0. 04g， 維生素BA Olg，磷酸吡哆醛0. 05g，瓊脂18克，鳥氨酸(115。C滅菌15min) ;5克，1000ml蒸 餾水，pH5. O，在115。C高壓滅菌15分鐘; 上層培養(yǎng)基溴甲酚紫0.06g，瓊脂20g，1000ml蒸餾水，pH5. 0，在121°C滅菌 10min j VRBDA瓊脂培養(yǎng)基為酵母浸膏3g，蛋白胨7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖10g，中 性紅0. 03g，結(jié)晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3_7. 5。 在無菌條件下取20克傳統(tǒng)中式香腸，無菌條件下剪碎后置于裝有180ml已滅菌生 理鹽水的三角瓶中，室溫230轉(zhuǎn)搖床搖10分鐘，取lml接種于腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基中， 37t:培養(yǎng)24小時(shí)，取lml培養(yǎng)液用9ml生理鹽水逐級(jí)稀釋到10-100cfu/ml濃度，涂布于產(chǎn) 腐胺檢測下層培養(yǎng)基上，37t:培養(yǎng)48小時(shí)。緩慢傾入一薄層上層培養(yǎng)基，10分鐘內(nèi)結(jié)果記 錄完畢，顯紫色的菌落為陽性，顯黃色為陰性，其中，陽性為能產(chǎn)生腐胺的菌株，陰性為不能 產(chǎn)生腐胺的菌株。 挑取陽性菌株，在VRBDA固體培養(yǎng)基純化三次以上，用腸細(xì)菌增生肉湯培養(yǎng)基 37。C培養(yǎng)24小時(shí)，離心后獲得陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)xlcadOOl菌株。
該菌株的菌落在VRBDA瓊脂培養(yǎng)基上，30 °C培養(yǎng)24h，紅白色菌落， 1.0-1.5X0. 3-0.6ym，短桿，革蘭氏陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，該菌株在普通顯微鏡下呈桿 狀。 該菌株根據(jù)Gen bank比對結(jié)果，命名陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae) xlcad001，2009年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保 藏號(hào)為CGMCC No. 3162。該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ890353。
該菌株加入無菌甘油，在-8(TC冰箱保存。
實(shí)施例2 高濃度腐胺培養(yǎng)液制備方法3/4頁 培養(yǎng)基 腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基(同實(shí)施例1);
制備方法 從斜面挑取菌落接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時(shí)，試管中的 接種量為105cfu/ml。在相同培養(yǎng)基反復(fù)活化五次后；將最后活化后的菌液接種到B培養(yǎng)基 中37t:靜止培養(yǎng)4天，接種量為106cfu/ml ;將培養(yǎng)后的菌液10000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，取上清 液，獲得高濃度腐胺液. 所述的A培養(yǎng)基為加入O. 1%鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基；所述的B液體培 養(yǎng)基為加入O. 005%磷酸吡哆醛和0. 1%鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基。
實(shí)施例3 腐胺含量檢測方法(高效液相檢測)
1 、生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亞精胺和精胺50mg，用0. 4mol/L的高氯 酸(HC104)定容至50mL，制成lmg/ml儲(chǔ)備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0. 4mol/L HC104配制成終濃度分別為5. 0、10、20、30、40、50ii g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光、4t:冰箱保存。
2、樣品溶液的衍生化 取實(shí)施例2的樣品lmL于5ml容量瓶中，加入200 ii L的2N NaOH使之呈堿性，然 后加入300iiL的飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行緩沖，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride) 溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然后放置于4(TC水浴黑暗中反應(yīng)處理40min。反應(yīng) 結(jié)束后加入100 ii L的氨水中止反應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。 衍生處理后用0. 22 ii m的有機(jī)濾膜過濾后，獲得樣品溶液的衍生物。
3、標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)樣的衍生化 分別取5. 0、10、20、30、40、50iig/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品lmL于5ml容量瓶中，加入
200 ii L的2N NaOH使之呈堿性，然后加入300 y L的飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行緩沖，再加入2ml
的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然后放置于4(TC水
浴黑暗中反應(yīng)處理40min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 ii L的氨水中止反應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯
溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生處理后用0. 22ym的有機(jī)濾膜過濾后，獲得六組樣品溶
液的衍生物。 4、檢測方法為 Agilent 1100檢測系統(tǒng)，AgilentZORBAX XDB-C18 (4. 6 X 250mm， 2， 5 ii m)，流速為 lmL *min-l，紫外檢測波長為254nm，進(jìn)樣量20 y L，柱溫30°C ，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙
腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序
洗脫時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/先
Elution timeMobile phase AMobile phase B
0.035.065. 0
5.030.070. 0
20.00.0100.0
24. 00.0100.0
25. 035.065.0
30.035.065.0 在圖2的生物胺標(biāo)樣的高效液相圖中1為色胺，2為苯乙胺，3為腐胺，4為尸胺， 5為組胺，6為酪胺，7為亞精胺，8為精胺。本發(fā)明的樣品溶液高效液相檢測結(jié)果如圖3所 示。由圖3可見，樣品溶液中含有腐胺。 利用上述的檢測方法檢測，響應(yīng)值為24296892. 9 (參見圖4)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 得到結(jié)果為445. 274p g/mg，但由于在檢測過程中把原樣稀釋了 10倍，所以最終腐胺含量 為4452.74ug/mg。 以上各實(shí)施例不是對本發(fā)明的具體限定。
權(quán)利要求
一株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于保藏號(hào)為CGMCC No.3162，菌落在VRBDA瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h，紅白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短桿，革蘭氏陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為GQ890353。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于 VRBDA瓊脂培養(yǎng)基為酵母浸膏3g，蛋白胨7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖10g，中性紅 0. 03g，結(jié)晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
3. —株保藏號(hào)為CGMCC No.3162的陰溝腸桿菌的應(yīng)用，其特征在于從斜面挑取菌落 接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中，37t:靜置培養(yǎng)24小時(shí)，試管中的接種量為105cfu/ml。在相 同培養(yǎng)基反復(fù)活化五次后；將最后活化后的菌液接種到B培養(yǎng)基中37t:靜止培養(yǎng)4天，接 種量為106cfu/ml ;將培養(yǎng)后的菌液10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液，高 濃度腐胺液的腐胺含量為4452. 74ii g/ml ;所述的A培養(yǎng)基為加入O. 1% L-鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基；所述的B液體培養(yǎng) 基為加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株保藏號(hào)為CGMCC No.3162的陰溝腸桿菌的應(yīng)用，其特征 在于所述的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基為蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鈉 8g，蒸餾水1000mL， pH值7. 2 7. 4， 115。C滅菌15min。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為CGMCC No.3162的一株陰溝腸桿菌，菌落在VRBDA瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h，紅白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短桿，革蘭氏陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，該菌株在普通顯微鏡下呈桿狀。應(yīng)用時(shí)，菌落接種于裝有A培養(yǎng)基的試管中，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，反復(fù)活化五次后，菌液接種到B培養(yǎng)基中37℃靜止培養(yǎng)4天，將菌液10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液，其中，A培養(yǎng)基為加入0.1％鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基；B液體培養(yǎng)基為加入0.005％磷酸吡哆醛+0.1％鳥氨酸的腸細(xì)菌增菌肉湯培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101701200SQ200910232710
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者劉登勇, 盧士玲, 周光宏, 徐幸蓮, 舒蕊華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)