專利名稱：：一種尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生化產(chǎn)品的制備方法，尤其涉及尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的新方法。
背景技術(shù)：
：尿苷磷酰類化合物和手性羥基酯都是極其重要的化合物，尿苷磷酰類化合物是核酸及寡糖合成的直接前體、重要的輔酶和能量載體，在細胞的生命代謝中起著十分重要的作用；而手性羥基酯主要用于藥物的合成，同時在殺蟲劑、昆蟲信息素、香料和食品添加劑、有機材料及光學(xué)材料中有較多的應(yīng)用。目前已報導(dǎo)的制備尿苷磷酰類化合物的方法主要有化學(xué)合成法和酶法，但是這些方法成本太高，常用的方法是微生物轉(zhuǎn)化法，利用微生物的細胞酶系合成，但是由于工藝原因，轉(zhuǎn)化率普遍偏低，發(fā)酵周期太長，致使成本太高。國內(nèi)的文獻報道了產(chǎn)氨短桿菌轉(zhuǎn)化乳清酸為尿苷一磷酸，突變株的轉(zhuǎn)化能力只有2.lg/L，得率僅0.5X李慧.產(chǎn)氨短桿菌Corynebacteriumammoniagenes轉(zhuǎn)化(OA)生成尿苷酸(UMP)的研究.上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文.(2005).。國內(nèi)UTP還未有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)報道，國外只有少量的相關(guān)文獻報導(dǎo)[StabilizingNucleotidesDerivatives.Japan.7，237，036，18Sep.(1972)。手性羥基酯的制備方法主要包括手性源合成法、外消旋體拆分法和不對稱合成法，其中采用不對稱合成法，通過e-酮酯類化合物的不對稱還原是制備手性羥基酯的一種最重要、最基礎(chǔ)和最實用的方法。生物催化劑因具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點而受到廣泛重視。然而進行生物催化合成手性羥基酯需要煙酰型輔酶II(NADPH)的參與，這種輔酶由于價格昂貴，所以需要通過添加輔助底物實現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生。國外文獻報道了通過基因工程改造的大腸桿菌用于還原4，4，4-三氟-乙酰乙酸乙酯(TFAAE)，反應(yīng)得到的(R)-(+)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯((R)-TFHBE)，對應(yīng)體過量值e.e超過99X，產(chǎn)率高于50XShawnM，RobinsKT，Kie證A丄onza.20yearsofBiotransformations[J].Adv.Synth.Catal.2003.4:425435.。國內(nèi)也有關(guān)于制備手性羥基酯的報道出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC1244可以將4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原為(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙酯，其濃度可達20.3g/L鐘萍，孫志浩.生物催化不對稱還原方法生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[J].過程工程學(xué)報，2005，5(6):665669.。然而，由于需要添加輔助底物，使得原料的利用率降低，并增加了生產(chǎn)成本及后分離的難度，使得生物催化手性羥基酯的一直未能實現(xiàn)工業(yè)化。綜上所述，現(xiàn)有的技術(shù)都是單獨合成尿苷磷酰類化合物或單獨合成手性羥基酯的方法，存在得率低、成本高等問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，該方法能克服現(xiàn)有技術(shù)中單獨合成尿苷磷酰類化合物或單獨合成手性羥基酯時得率低、成本高的問題。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是以乳清酸和13-酮酯類化合物為底物，以葡萄糖為能量供體，利用預(yù)處理的有透性的酵母來同時制備尿苷磷酰類化合物和手性羥基酯，基本思路如下反應(yīng)式所示。本發(fā)明直接利用了微生物體內(nèi)嘧啶核苷酸的從頭合成途徑，通過添加尿苷一磷酸的前體來進行催化反應(yīng)，在此過程中所產(chǎn)生的大量的具有還原力的輔酶II(NADPH)用于還原P_酮酯類化合物，最終實現(xiàn)了尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯。具體的制備方法如下—種尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法配制含50400g/L酵母、550g/L13-酮酯類化合物、110g/L乳清酸、50300g/L葡萄糖、0.012M磷酸根離子和1200mM鎂離子的水溶液，調(diào)節(jié)pH值至5IO，在1540。C下，反應(yīng)340h。其中所述的尿苷磷酰類化合物為尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、尿苷二磷酸D-葡糖(UDP-Glc)、尿苷二磷酸D-半乳糖(UDP-Gal)、尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨(UDP-GalNAc)。各種尿苷磷酰類化合物的結(jié)構(gòu)式見表l。表1尿苷磷酰類化合物的結(jié)構(gòu)式手性羥基酯OA+PRH>P-酮酯類化合物尿苷錄酰類化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>所述的手性羥基酯的通式為(如CH3、C2H5、C3H7、C4H9等)。所述的手性羥基酯可舉出的例子有4-氯-3羥基丁酸乙酯、4，4，4-三氟_3_丁酸乙酯、4-溴-3-羥基丁酸乙酯、4-氯-3-羥基丁酸丁酯、4-溴-3-羥基丁酸丁酯、4-氟-3羥基丁酸乙酯、4-氯-3-羥基丁酸甲酯等。所述的|3-酮酯類化合物通式為其中，&為鹵素(如F、Cl、Br、I等)，R2為烷基(如CH3、C2H5、C3H7、C4H9等)。所述的e-酮酯類化合物可舉出的例子有4-氯乙酰乙酸乙酯、4，4，4-三氟-乙酰乙酸乙酯、4-溴乙酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸丁酯、4-溴-乙酰乙酸丁酯、4-氟-乙酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸甲酯等等。所述的乳清酸(0A)結(jié)構(gòu)式如下所述的磷酸根離子可通過加入多磷酸或無機磷酸鹽的方式得到，多磷酸如正磷酸、焦磷酸或三聚磷酸等，無機磷酸鹽如磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉等。所述的鎂離子可通過加入無機鎂鹽的方式得到，無機鎂鹽如硫酸鎂、硝酸鎂或氯化鎂。所述的酵母細胞是指從酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中能夠利用嘧啶核苷前體合成尿苷磷酰類化合物及能將e-酮酯類化合物還原為手性羥基酯的微生物。如屬于酵母屬的微生物釀酒酵母，面包酵母等；屬于假絲酵母屬的微生物近平滑假絲酵母；屬于畢赤酵母屬的奧默列氏畢赤酵母；屬于球擬酵母屬的微生物白色球擬酵母；屬于德巴利酵母屬的類球形德巴利酵母；屬于接合酵母屬的魯氏接合酵母；屬于克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母；屬于漢遜酵母屬的杰丁漢遜酵母；屬于酒香酵母屬的異酒香酵母等。該酵母可以是經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后分離離心得到的酵母細胞、酵母細胞的干燥物、酵母細胞的凍干物和市售酵母粉中的任意一種。本發(fā)明利用了微生物自身的酶系EMP途徑酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶)、HMP途徑酶系(6磷酸葡萄糖脫氫酶、內(nèi)脂酶、6磷酸葡萄糖酸脫氫酶、磷酸戊糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮酶)、尿苷磷酰類化合物合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)和手性羥基酯的合成酶系(醛還原酶、醛糖還原酶、羰基還原酶、酮還原酶)進行催化反應(yīng)，由于細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統(tǒng)，各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態(tài)和特定位置，反應(yīng)所需要的能量和輔酶因子不需要外界供給，直接由細胞產(chǎn)生，因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應(yīng)，在大規(guī)模生產(chǎn)方面，有轉(zhuǎn)化效率高、成本低，以及污染小的優(yōu)點。通過大量的研究工作發(fā)現(xiàn)細胞膜的結(jié)構(gòu)特性決定了細胞膜一般不允許高極性分子通過，因此欲使其通過細胞膜積累于反應(yīng)液中，必須改變細胞膜的透性。另一方面，細胞內(nèi)固有的手性羥基酯合成酶系(醛還原酶、酮還原酶)必須與P-酮酯類化合物結(jié)合才能進行催化反應(yīng)。因此，細胞膜通透性的改變是尿苷磷酰類化合物積累于胞外及手性羥基酯合成的前提條件。通過改變微生物細胞膜的通透性，可加速反應(yīng)組分向微生物細胞的擴散、滲透，促進底物和酶系的接觸，可使最大轉(zhuǎn)化率以及最大得率出現(xiàn)的時間在一定限度內(nèi)縮短。改變酵母細胞壁通透性可向酵母中加入表面活性劑、有機溶劑或溶菌酶進行反應(yīng)，或?qū)⒔湍讣毎?jīng)超聲、風(fēng)干、凍融、凍干的方式處理。其中表面活性劑為聚環(huán)氧乙烷胺、曲拉通X-100等非離子型表面活性劑，十六烷基三甲胺*溴化物等陽離子型表面活性劑，月桂酰肌氨酸鹽等陰離子表面活性劑，通常以0.150g/L的濃度使用，優(yōu)選以120g/L的濃度使用。其中有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，通常以0.150mL/L的濃度使用，優(yōu)選以120mL/L的濃度使用。本發(fā)明所提供的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其中酵母的用量優(yōu)選100300g/L，13-酮酯類化合物的用量優(yōu)選1545g/L，乳清酸的用量優(yōu)選37g/L，葡萄糖的用量優(yōu)選100200g/L，磷酸根離子的用量優(yōu)選0.11M，鎂離子的用量優(yōu)選250mM，溶液pH值優(yōu)選69，反應(yīng)溫度優(yōu)選2030°C，反應(yīng)時間優(yōu)選1535h。通過本發(fā)明方法，采用同樣的反應(yīng)體系，只要改變具體的底物，改變具體的葡萄糖及磷酸鹽和鎂離子的含量即可生成相應(yīng)的尿苷磷酰類化合物與手性羥基酯。例如以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，即可反應(yīng)得到(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙酯，以4，4，4-三氟-乙酰乙酸乙酯為底物即可反應(yīng)得到(S)-(+)-4，4，4-三氟-3-丁酸乙酯，以4-溴乙酰乙酸乙酯為底物即可反應(yīng)得到(S)-(-)-4-溴-3-羥基丁酸乙酯，以4-氯-乙酰乙酸丁酯為底物即可反應(yīng)得到(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸丁酯，以4-溴-乙酰乙酸丁酯為底物即可反應(yīng)得到(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯，以4-氟-乙酰乙酸乙酯為底物即可反應(yīng)得到(S)-(-)-4-氟-3羥基丁酸乙酯，以4-氯-乙酰乙酸甲酯為底物即可得到(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸甲酯。對于目標(biāo)產(chǎn)物尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨(UDP-GalNAc)，需在上述反應(yīng)體系反應(yīng)了340h后，再加入50100g/L葡萄糖和15g/L乙酸鈉，繼續(xù)反應(yīng)120h，可得。本發(fā)明可通過優(yōu)化反應(yīng)物料的量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等參數(shù)，可得到不同的尿苷磷酰類化合物。本發(fā)明是建立在全細胞催化的基礎(chǔ)上的，其特點在于克服了其它方法底物轉(zhuǎn)化率不高、難于實現(xiàn)能量和輔酶再生的種間耦合，不易改變細胞膜的通透性等缺陷。特別是與酶催化相比，由于使用的是全細胞，胞內(nèi)的酶受細胞壁/細胞膜的保護，酶穩(wěn)定性更好，半衰期更長，更易實現(xiàn)能量和輔酶的再生；胞內(nèi)多種酶系的存在以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應(yīng)可以彌補酶法催化中級聯(lián)催化不易實現(xiàn)的不足，同時省去酶的純化過程，制備簡單，成本低廉。本發(fā)明主要涉及到的主要是輔酶的循環(huán)高效再生，在現(xiàn)有技術(shù)中，單獨合成尿苷磷酰類化合物與單獨合成手性羥基酯的酶催化反應(yīng)，在消耗一種形態(tài)輔酶的同時將另一種形態(tài)的輔酶浪費，而本發(fā)明將消耗兩種不同形態(tài)輔酶的催化反應(yīng)結(jié)合起來，通過反應(yīng)_反應(yīng)耦合，形成了一個多目標(biāo)產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)的生物轉(zhuǎn)化過程。有益效果本發(fā)明將酵母細胞以尿苷一磷酸的前體物質(zhì)為底物合成尿苷磷酰類化合物與以P_酮酯類化合物為底物制備手性羥基酯的反應(yīng)過程耦聯(lián)起來，形成反應(yīng)_反應(yīng)耦聯(lián)體系，合理的運用全細胞催化和代謝工程的原理，通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝流量分析、建立了輔酶的高效循環(huán)再生體系，提高了輔酶的再生效率，利用有透性的酵母細胞聯(lián)產(chǎn)尿苷磷酰類化合物與手性羥基酯，得率增高、生產(chǎn)成本降低、合成時間縮短、底物利用率大幅提高。具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1:尿苷一磷酸(UMP)聯(lián)產(chǎn)(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由乳清酸OA10克，4-氯乙酰乙酸乙酯50克，葡萄糖500克，市售面包酵母粉500克，硫酸鎂10mM，磷酸二氫鉀0.OIM，二甲苯12毫升和水組成的反應(yīng)液IOL，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.5，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)20h，通氣量為0.5(V/V*min)。反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酰乙酸萃取(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙酯，用HPLC和GC分別對尿苷一磷酸(UMP)和(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸乙酯的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UMP1.89克/升，(S)-(-)_4-氯-3羥基丁酸乙酯4.6克/升，對映體過量值為95%，UMP的得率達到91%(mol計)，(S)-(-)+氯-3羥基丁酸乙酯的得率為92%(mol計)。實施例2:尿苷二磷酸D-葡糖(UDP-Glc)聯(lián)產(chǎn)(S)-(+)_4，4，4_三氟_3_羥基丁酸乙酉旨((S)-TFHBE)。酵母培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氫鉀1.5，七水合硫酸鎂0.5，七水合硫酸鋅4.OX10—3，七水合硫酸亞鐵3.OX10—3，四水合氯化錳0.3X10—3，無水氯化鈣1.0X10—3，生物素0.05X10—3。釀酒酵母接種量10%(v/v)，于30。C下120rpm搖床培養(yǎng)24小時，離心4000rpm，20分鐘。取酵母泥，-7。C保藏備用。在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由0A100克，葡萄糖3000克，4，4，4-三氟-乙酰乙酸乙酯(TFAAE)500克，釀酒酵母泥5000克，風(fēng)干處理，硫酸鎂200mM，磷酸二氫鈉2M，曲拉通X-IOO10毫升和水組成的反應(yīng)液10L，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.5，通氣量為0.5(V/V*min)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度降低至25°C，用HC1調(diào)節(jié)pH至7.0，補加葡萄糖1000克，再反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酸乙酯萃取TFHBE，用HPLC和GC分別對UDP-Glc和TFHBE進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物TFHBE的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UDP-Glc33.17克/升，(S)-TFHBE46.8克/升，對映體過量8值為93%，UDP-Glc的得率達到91.5%(mol計)，(S)-TFHBE的得率為91.7%(mol計)。實施例3:尿苷三磷酸(UTP)聯(lián)產(chǎn)(S)-(-)_4-溴_3_羥基丁酸乙酯。容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由OA60克、葡萄糖1400克、4_溴乙酰乙酸乙酯200克，硫酸鎂20mM、利用實施例2所述方法培養(yǎng)面包酵母2700克，反復(fù)凍融3次，磷酸氫二鈉0.6M，十六烷基三甲胺溴化銨10克和水組成的反應(yīng)液IOL，用氫氧化鈉調(diào)pH為7，通氣量為1.0(V/Vmin)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度升高至37°C，用HC1調(diào)節(jié)pH至6.5，補加葡萄糖500克，再反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-溴-3-羥基丁酸乙酯，用HPLC和GC分別對尿苷三磷酸(UTP)和(S)-(-)-4-溴-3-羥基丁酸乙酯進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-(-)-4-溴-3-羥基丁酸乙酯的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UTP18.09克/升，(S)-(-)-4-溴-3-羥基丁酸乙酯19.25克/升，對映體過量值為95%，UTP的得率達到97%(mol計)，(S)-(-)+溴-3-羥基丁酸乙酯得率達到96%。實施例4:尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)聯(lián)產(chǎn)(S)-(-)-4-氯_3_羥基丁酸丁酯。在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由0A40克、葡萄糖1000克、葡萄糖銨30克、硫酸鎂25mM、4-氯-乙酰乙酸丁酯150克，利用實施例2所述方法培養(yǎng)面包酵母2000克，風(fēng)干處理，磷酸二氫鉀0.5M和水組成的反應(yīng)液IOL，用氫氧化鈉調(diào)pH為7，通氣量為0.7(V/V'min)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度降低至27°C，用HC1調(diào)節(jié)pH至6.0，補加葡萄糖700克，乙酸鈉50克，再反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸丁酯，用HPLC和GC分別對尿苷二磷酸乙酰葡糖氨(UDP-GlcNAc)和(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸丁酯定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸丁酯進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UDP-GlcNAc14.78克/升，(S)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸丁酯14.12克/升，對映體過量值96%，UDP-GlcNAc的得率達到95%(mol計)，(S)-(+)-3-羥基丁酸丁酯得率達到95%(mol計)。實施例5:尿苷二磷酸(UDP)聯(lián)產(chǎn)(S)_4-溴_(-)_3-羥基丁酸丁酯。容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由0A55克、葡萄糖1200克、4-溴-乙酰乙酸丁酯170克，硫酸鎂22mM、利用實施例2所述方法培養(yǎng)面包酵母2500克，磷酸氫二鈉0.5M，十六烷基三甲胺溴化銨10克和水組成的反應(yīng)液10L，用氫氧化鈉調(diào)pH為7，通氣量為0.7(V/V*min)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度升高至35°C，用HC1調(diào)節(jié)pH至6.0，補加葡萄糖600克，再反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酸乙酯萃取(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯，用HPLC和GC分別對尿苷二磷酸(UDP)和(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UDP14.25克/升，(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯16克/升，對映體過量值94%，UDP的得率達到94%(mol計)，(S)-4-溴-(-)-3-羥基丁酸丁酯得率達到94.1%。實施例6:尿苷二磷酸D-半乳糖UDP-Gal聯(lián)產(chǎn)(S)-(-)_4_氟_3_羥基丁酸乙酯。在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由乳清酸0A70克，4-氟-乙酰乙酸乙酯230克，葡萄糖1100克，市售面包酵母粉2200克，硫酸鎂15mM，磷酸二氫鉀0.4M，二甲苯12毫升和水組成的反應(yīng)液10L，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，通氣量為0.9(V/Vmin)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度降低至2(TC，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，補加葡萄糖900克，再反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酸乙酯萃取(S)-(-)-4-氟-3羥基丁酸乙酯，用HPLC和GC分別對尿苷二磷酸D-半乳糖UDP-Gal和(S)-(-)_4-氟-3-羥基丁酸乙酯進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-(-)-4-氟-3羥基丁酸乙酯的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UDP-Gal25.54克/升，(S)-(-)-4-氟-3羥基丁酸乙酯21.34克/升，對映體過量值為95%，UDP-Gal的得率達到94%(mol計)，(S)-(-)+氟-3羥基丁酸乙酯的得率為93%(mol計)。實施例7:尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨UDP-GalNAc聯(lián)產(chǎn)(S)-(-)-4-氯_3_羥基丁酸甲酯。在容量為15L的反應(yīng)槽中調(diào)制由乳清酸0A50克，4-氯-乙酰乙酸甲酯210克，葡萄糖1500克，利用實施例2所述方法培養(yǎng)面包酵母1700克，硫酸鎂30mM，磷酸二氫鉀0.33M，二甲苯12毫升和水組成的反應(yīng)液IOL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，通氣量為1.6(V/V*min)，于3(TC條件下高速攪拌反應(yīng)16h，然后停止通氣，降低攪拌速率，溫度降低至18°C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，補加葡萄糖900克，乙酸鈉20克，再反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸滅活，用乙酰乙酸萃取(S)-(-)_4-氯-3-羥基丁酸甲酯，用HPLC和GC分別對尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨UDP-GalNAc和(S)-(-)_4-氯-3-羥基丁酸甲酯進行定量分析，并用旋光儀對產(chǎn)物(S)-(-)_4-氯-3羥基丁酸甲酯的旋光值進行測定，轉(zhuǎn)化液中含UDP-GalNAc18.54克/升，(S)-(-)-4-氯-3羥基丁酸甲酯19.34克/升，對映體過量值為95%，UDP-GalNAc的得率達到95%(mol計)，(S)-(-)-3羥基丁酸甲酯的得率為94%(mol計)。權(quán)利要求一種尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于配制含50～500g/L酵母、5～50g/Lβ-酮酯類化合物、1～10g/L乳清酸、50～400g/L葡萄糖、0.01～2M磷酸離子和1～200mM鎂離子的水溶液，調(diào)節(jié)pH值至5～10，在15～40℃下，反應(yīng)3～40h。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的尿苷磷酰類化合物為尿苷一磷酸，尿苷二磷酸，尿苷三磷酸，尿苷二磷酸D-葡糖，尿苷二磷酸D-半乳糖，尿苷二磷酸乙酰葡糖氨或尿苷二磷酸乙酰半乳糖氨。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的手性羥基酯的通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，Ri為鹵素，I^為烷基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的P_酮酯類化合物通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，Ri為鹵素，l^為烷基。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的酵母細胞為釀酒酵母、近平滑假絲酵母、面包酵母、奧默列氏畢赤酵母、白色球擬酵母、類球形德巴利酵母、魯氏接合酵母、馬克斯克魯維酵母、杰丁漢遜酵母或異酒香酵母。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的酵母是經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后分離離心得到的酵母細胞、酵母細胞的干燥物、酵母細胞的凍干物和市售酵母粉中的任意一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的酵母細胞為經(jīng)加入表面活性劑、有機溶劑或溶菌酶反應(yīng)，或經(jīng)超聲、風(fēng)干、凍融、凍干處理，使細胞膜的通透性發(fā)生改變的酵母細胞。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的磷酸根離子可通過加入多磷酸或無機磷酸鹽的方式得到。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于所述的鎂離子可通過加入無機鎂鹽的方式得到。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，其特征在于在反應(yīng)了340h后，加入50100g/L葡萄糖，15g/L乙酸鈉，繼續(xù)反應(yīng)120h。全文摘要本發(fā)明公開了一種尿苷磷酰類化合物聯(lián)產(chǎn)手性羥基酯的方法，該方法以乳清酸和β-酮酯類化合物為底物，以葡萄糖為能量供體，利用有透性的酵母細胞同時制備尿苷磷酰類化合物與手性羥基酯。本發(fā)明運用全細胞催化和代謝工程的原理，通過建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝流量分析，利用有透性的酵母細胞聯(lián)產(chǎn)尿苷磷酰類化合物和手性羥基酯，得率增高、生產(chǎn)成本降低、合成時間縮短、底物利用率大幅提高。文檔編號C12R1/72GK101724670SQ20091023423公開日2010年6月9日申請日期2009年11月17日優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日發(fā)明者葉齊,應(yīng)漢杰,張月圓,曹厚,柏建新,栗西木,熊健,陳勇申請人:南京工業(yè)大學(xué)