專利名稱：一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物中，外源基因是被隨機地插入到植物基因組中的，而插入到不同或 相同位置染色體的多個轉(zhuǎn)基因拷貝經(jīng)常會導(dǎo)致基因沉默。只有插入單拷貝或雙拷貝的外源 基因的植物才能產(chǎn)生高水平的表達，所以檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，選擇單拷貝或雙拷貝轉(zhuǎn)基因 株系進行后期功能鑒定至關(guān)重要。 目前判斷基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern雜交、實時熒光定量PCR，還包括熒 光原位雜交、比較基因組雜交，對于Southern雜交，該方法通過基因組酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜 交等步驟，可判斷拷貝數(shù)；對于實時定量PCR，該方法通過監(jiān)測PCR過程中產(chǎn)物的實時變化， 可判斷基因拷貝數(shù)；而對于熒光原位雜交、比較基因組雜交該兩種技術(shù)，其工作量、費用和 困難程度比之Southern雜交有過之而不及。 煙草是一種轉(zhuǎn)基因研究的模式植物，轉(zhuǎn)化體系成熟，易于獲得陽性植株。本發(fā)明的 成功運用，將給今后運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因功能帶來極大的便利。
三、
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是公開一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法，為廣大轉(zhuǎn) 基因工作者提供一種快速而成本低廉的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測的方法，尤其是對單拷貝和雙拷 貝基因的鑒定。
技術(shù)方案 煙草純合微衛(wèi)星(SSR)位點的獲得一人工合成短截SSR核苷酸片段一將合成片段 插入含有欲轉(zhuǎn)入基因的植物雙元表達載體一采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草一煙草抗性 苗的獲得一煙草抗性苗DNA的提取一PCR擴增一判斷轉(zhuǎn)入外源基因拷貝數(shù)。
1、快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法，其具體步驟如下
1)人工合成序列'SSR-95'并加入HindIII、 Sphl酶切位點； 2)將步驟1)所述序列'SSR-95'插入到含有目的基因的植物雙元表達載體 pCAMBIA-1301的相應(yīng)酶切位點，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質(zhì) 粒，將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株；
3)將步驟2)所述陽性農(nóng)桿菌EHA105菌株采用葉盤法轉(zhuǎn)化至煙草'K326';
4)將步驟3)所述煙草進行GUS染色，獲得GUS陽性株系； 5)采用常規(guī)CTAB法提取步驟4)所述GUS陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/ y 1 ，用引物P-F : 5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'禾P P-R : 5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'進行 PCR擴增，經(jīng)2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)兩條條帶，其中一條為內(nèi)源SSR片段'SSR-168'，另一條為外源合成的短截片段'SSR-95';當'SSR-95'亮度低于'SSR-168'時，則表示與片 段'SSR-95' —同轉(zhuǎn)入煙草基因組的目的基因為單拷貝； 當'SSR-95'亮度高于'SSR-168'時，則表示轉(zhuǎn)入的目的基因為多單拷貝；當兩者 亮度一致時，則表示所轉(zhuǎn)入的目的基因為雙拷貝。
有益效果 使用Southern雜交檢測轉(zhuǎn)基因株系的拷貝數(shù)，DNA的需求量較大，同時也要花費 較長的時間，而采用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系的拷貝數(shù)，則需要昂貴的熒光定量 PCR儀，但本發(fā)明只需采用一對SSR特異引物對轉(zhuǎn)基因植物進行PCR檢測，就可以快速檢測 轉(zhuǎn)基因株系的拷貝數(shù)，簡單易行，尤其是對插入單拷貝和雙拷貝外源基因株系的檢測。
四

圖1為植物雙元表達載體'pSSR-C0PY' T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖
圖2為拷貝數(shù)檢測原理示意圖 圖3為轉(zhuǎn)基因煙草拷貝數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖 M :DNA分子量Marker ;1 :陽性外源SSR質(zhì)粒對照；2 :陰性內(nèi)源SSR片段對照；3-6 : 轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-D 圖4為轉(zhuǎn)MdCAXl基因煙草生根苗
五具體實施例方式
1、煙草品種'K326'純合微衛(wèi)星(SSR)位點'PT1199'的獲得 Bindler等(Bindler G，van der Hoeven R，Gunduz I et al. A microsatellite
marker basedlinkage map of tobacco [J]. Theor. Appl. Genet. ， 2007， 114 :341-349)獲得
一個一.倍體煙草品種'K326'純合微衛(wèi)星(SSR)位點'PT1199'，合成該位點的特異引物如下P-F :5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'
P-R:5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'
進行PCR擴增，反應(yīng)體系(25 ii 1)如下
煙草DNA(100ng/ii 1)1 ii 1HiFi Taq(5U/ii 1)0. 2ii 1上游引物(lOiiM)1 ii 1下游引物(lOiiM)1 ii 1Buffer I(IOX)2. 5ii 1d證(10mM)0. 5ii 1無菌ddH2018. 8ii 1反應(yīng)程序如下94°C 5min ;35個循環(huán):94°C 30s，54。C 30s，72。C 30s ;72。C 5min ;10。C 20min將擴增片段于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠回收試劑盒(愛思進生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))回收該片段，繼而連接到PMD18-T(購自大連寶生物有限公司)克 隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株(購自全式金生物技術(shù)有限公司)，經(jīng)藍白斑篩選，
4挑取白色菌落進行培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆，交由上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，獲得長度為168bp預(yù)期片段'SSR-168' (Bindler G， van der Hoeven R， Gunduz I etal. Amicrosatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theor. Appl. Genet. ，2007，114 :341-349)。 2、煙草品種'K326，純合微衛(wèi)星(SSR)位點'PT1199'短截片段'SSR-95'的獲得
根據(jù)測序獲得的片段'SSR-168'，從其中間截去長度為73bp序列，獲得片段'SSR-95'，在其兩端加入Hind III、 Sph I酶切位點，將該序列交由金斯特生物技術(shù)有限公司人工合成，獲得一個'PUC57-SSR'克隆載體質(zhì)粒(PUC57克隆載體，金斯特生物技術(shù)有限公司)。 3、載體構(gòu)建 將上述獲得的含有SSR短截片段的'PUC57-SSR'克隆載體質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶HindlII、Sph I(購自大連寶生物有限公司)進行雙酶切，反應(yīng)體系(50iU)如下
PUC57-SSR質(zhì)粒(50ng/ ii 1)38 ii 1 HindlII(15U/ii 1) 1 ii 1 Sphl(15U/ii 1) K Buffer (10 X) 5 ii 1 無菌ddH20 5 ii 1 將上述樣品混勻后，于37°C的水浴鍋中，酶切2-3h后，在2 %的瓊脂糖凝膠中進行檢測。使用凝膠回收試劑盒(愛思進生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))回收切下的小片段，將回收的該片段亞克隆到含有目的基因MdCAXl(NCBI登錄號為FJ008870)植物雙元表達載體pCAMBIA-1301的相應(yīng)酶切位點(圖l)，連接體系(20iU)如下 pCAMBIA-1301 (50ng/ ii 1) 1 ii 1 片段'SSR-95， (10ng/ii 1) 15 iU T4-連接酶(350U/ ii 1) 1 ii 1 Buffer (10 X) 2 ii 1 無菌ddH20 1 ii 1 將上述樣品混勻后，于PCR(型號為PTC-100)儀上16。C連接2h，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質(zhì)粒，進行酶切驗證，將該質(zhì)粒命名為'pSSR-COPY'。應(yīng)用凍融法將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105菌株，挑取陽性克隆進行PCR檢測檢測，獲得陽性菌株。 4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)'pSSR-COPY'轉(zhuǎn)化煙草'K326' 接種含有質(zhì)粒'pSSR-COPY'的農(nóng)桿菌EHA105單菌落于40ml含Km 50mg L—1的YEB液體培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)至0D600約0. 5，5000rpm離心10min，菌體用40ml MS液體培養(yǎng)基(不含激素，不調(diào)PH)重新懸浮；將煙草葉片剪成l-2cm2的葉塊，放入上述用無菌液體MS培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中，浸泡3min，其間不斷輕搖幾次；取出材料，放在無菌濾紙上吸去多余菌液，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+BA 1. Omg L—丄+NAA 0. 2mg L-、 pH 5. 8)中，28t:共培養(yǎng)2-3d ;共培養(yǎng)結(jié)束后，將煙草葉片轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS+BA 1. Omg L—^NAA0. 2mg L—'+hyg. 30mg L—、b 500mg L-、 pH 5. 8)中，直接置于25。C下光照培養(yǎng)，每天光照16小時，光強為40-50 ii mol *m—2 s—、經(jīng)過20-30天培養(yǎng)，在葉片邊緣出現(xiàn)抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)入新鮮的篩選培養(yǎng)基，待抗性芽長至3-5cm時，剪下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA
0. 2mg L—丄+hyg. 30mg L—丄+cb 200mg L—、 pH5. 8) ， 15-20天即可生根，共獲得了 48棵潮霉
素抗性植株。 5、GUS染色檢測 從抗性植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏捻敹擞兹~上剪取l-2cm2的葉塊，放入裝有GUS染色液的離心管中，37t:培養(yǎng)箱中進行GUS組織染色，6-10h后取出葉片，用70X的乙醇脫色，結(jié)果表明，在48棵潮霉素抗性植株中，共有4棵煙草潮霉素抗性苗呈GUS組織染色陽性，分別命名為A、B、C、D。
6、拷貝數(shù)檢測 圖2為拷貝數(shù)檢測原理示意圖，本文中轉(zhuǎn)入到煙草基因組中的SSR片段比內(nèi)源SSR片段短73bp，通過SSR片段兩側(cè)的引物PCR擴增后，轉(zhuǎn)基因陽性植株應(yīng)該有兩條片段出現(xiàn)，內(nèi)源SSR片段長度為168bp，外源SSR片段長度為95bp。因為本文中選擇的二倍體煙草品種'K326'的SSR位點是純和的，即該煙草染色體中有兩個相同的該SSR位點，在基因組中該位點是雙拷貝的，所以根據(jù)內(nèi)外源片段PCR擴增產(chǎn)物的亮度對比，即可判斷與其一同轉(zhuǎn)入煙草基因組的外源目的基因MdCAXl的拷貝數(shù)。當'SSR-95'亮度低于'SSR-168'時，則表示所轉(zhuǎn)入的目的基因MdCAXl為單拷貝；當'SSR-95'亮度高于'SSR-168'時，則表示所轉(zhuǎn)入的目的基因MdCAXl為多單拷貝；當兩者亮度一致時，則表示所轉(zhuǎn)入的目的基因MdCAXl為雙拷貝。 采用常規(guī)CTAB法提取步驟5所述GUS染色陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/iiL，進行PCR擴增，引物與反應(yīng)體系同步驟1，反應(yīng)程序如下94 °C 5min ;25個循環(huán)94。C 30s，54。C 20s，72。C 15s ;72。C 5min ;10。C 20min。結(jié)果如圖3所示，株系A(chǔ)、 C、 D中'SSR-95'擴增片段亮度弱于內(nèi)源SSR片段'SSR-168'，因此該3個株系中插入的目的基因MdCAXl為單拷貝；而株系B的'SSR-95'擴增片段亮度要遠遠高于內(nèi)源SSR片段'SSR-168'，這說明基因組中整合了多個拷貝的目的基因MdCAXl。序列表〈110〉南京農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉 一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法〈130〉說明書〈160>3〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-F左端〈222〉 (1) (20)〈223〉〈400>1
tcgggtcgtt acaactgatg20〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-R右端〈222>(1).. (20)〈223〉〈400>2ccacgtcatt cggagttgtt 20〈210>3〈211>95〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>SSR-95〈222>(1). . (95)〈223〉〈400>3tcgggtcgtt acaactgatg gttgtcttgt ggtcagaaca ggtccccaac accacacactc朋朋3ccte gacate3C3a ctccg朋tg3 cgtgg
權(quán)利要求
快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法，其具體步驟如下1)人工合成序列‘SSR-95’并加入HindIII、SphI酶切位點；2)將步驟1)所述序列‘SSR-95’插入到含有目的基因的植物雙元表達載體pCAMBIA-1301的相應(yīng)酶切位點，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株；3)將步驟2)所述陽性農(nóng)桿菌EHA105菌株采用葉盤法轉(zhuǎn)化至煙草‘K326’；4)將步驟3)所述煙草進行GUS染色，獲得GUS陽性株系；5)采用常規(guī)CTAB法提取步驟4)所述GUS陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/μl，用引物P-F5’-TCGGGTCGTTACAACTGATG-3’和P-R5’-CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3’進行PCR擴增，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)兩條條帶，其中一條為內(nèi)源SSR片段‘SSR-168’，另一條為外源合成的短截片段‘SSR-95’；當‘SSR-95’亮度低于‘SSR-168’時，則表示與片段‘SSR-95’一同轉(zhuǎn)入煙草基因組的目的基因為單拷貝；當‘SSR-95’亮度高于‘SSR-168’時，則表示轉(zhuǎn)入的目的基因為多單拷貝；當兩者亮度一致時，則表示所轉(zhuǎn)入的目的基因為雙拷貝。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種快速檢測轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法”，屬于基因工程領(lǐng)域。人工合成一條95bp中間短截片段，克隆到含有目的基因的植物雙元表達載體pCAMBIA-1301，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，再轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株再轉(zhuǎn)化至煙草‘K326’。將獲得的陽性植株，進行PCR擴增，根據(jù)擴增獲得的片段‘SSR-168’和‘SSR-95’電泳條帶的亮度比較就可以確定與片段‘SSR-95’一同轉(zhuǎn)入的外源基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明只需采用一對SSR特異引物對轉(zhuǎn)基因植物進行PCR檢測，就可以快速檢測轉(zhuǎn)基因株系的拷貝數(shù)，簡單易行，尤其是對插入單拷貝和雙拷貝外源基因株系的檢測。
文檔編號C12N15/84GK101717825SQ20091023438
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者喬玉山, 徐長寶, 渠慎春, 王三紅, 章鎮(zhèn), 蔡斌華, 許寬勇, 陶建敏, 高志紅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)