專利名稱：通過定向進化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及酶活力提高的華根霉脂肪酶突 變體。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯 化、酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是脂 肪酶的一個重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過30種根霉 脂肪酶實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。根霉脂肪酶大都具有高度1，3_位置選擇性，因此常用于油脂加 工中。此外，根霉脂肪酶還具有穩(wěn)定性佳，轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于芳香酯、生物柴 油、手性化合物的生產(chǎn)中。目前為止，國內(nèi)外已報道了多個根霉脂肪酶的基因序列。日本、德國對米根霉 脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase，R0L)的基因序列和表達(dá)做了比較深入的研究，并 先后用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達(dá)了脂肪酶基因(Mirming S et al. J Biotechnol,1998,66 147-156 ；Beer HD et al.Biochim BiophysActa,1998, 1399 173-180 ；Ueda M et al. J Mol Catal B :Enzym，2002，17 :113_124)。發(fā)明人在前 期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M 201021)菌株，并從該菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登錄 號EF405962)，并實現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表 達(dá)(Yu Xiao-Wei et al. J MolCatal B :Enzym，2009，57 :304_311)。定向進化屬于非理性設(shè)計，是指通過在實驗室中模擬達(dá)爾文自然進化過程，針對 某一蛋白質(zhì)酶的基因，通過改進的誘變技術(shù)改造的酶的基因，然后根據(jù)特定的改造目的，篩 選有價值的天然酶。近10年來，定向進化技術(shù)已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得巨大 的成功，主要集中于提高酶的催化反應(yīng)活性，改進底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對映立體選 擇性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol，2006，9 :261_267)。酶活力的提高可以用酶的動力學(xué)參數(shù)K。at值來表示。K。at又稱轉(zhuǎn)化數(shù)，指每分子酶 或每個酶活性中心在單位時間內(nèi)能催化的底物分子數(shù)(TN)，也稱為催化常數(shù)。因此，K-值 的提高即代表了酶活的提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供酶活力提高的華根霉脂肪酶。本發(fā)明的技術(shù)方案通過定向進化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體，由華根霉 (Rhizopus chinensis) CCTCC M 201021 脂肪酶基因(Genbank 登錄號 EF405962)，運用易 錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經(jīng)定向進化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨 基酸序列中，包含氨基酸突變 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、 Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸兩個、三個或四個突變的組合；以轉(zhuǎn)換數(shù)Keat表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測序結(jié)果及其K。at提高的倍數(shù)為
Kcat提聞脂肪酶突變體氨基酸取代位置Kcat (A的倍數(shù)
出發(fā)菌株脂肪酶-1138
突變體1-1Alal29Ser1252
突變體1-2Lysl61Arg1479
突變體1-3Thrl95Tyr1479
突變體1-4Ala230Thr1821
突變體1-5Val261Gly1935
突變體1-6Lys322Arg1366
突變體1-7Ser373Asn1707
突變體2-1Alal29Ser/Lysl61Arg2278
突變體2-2Alal29Ser/Ala230Thr1365
突變體2-3Alal29Ser/Val261Gly1593
突變體2-4Lysl61Arg/Thrl95Tyr2845
突變體2-5Lysl61Arg/Lys322Arg1707
突變體2-6Lysl61Arg/Ser373Asn2048
突變體2-7Ala230Thr/Ser373Asn1707
突變體2-8Val261Gly/Ser373Asn3726
突變體3-1Alal29Ser/Ala230Thr/Val261Gly3186
突變體3-2Alal29Ser/Ala230Thr/Lys322Arg2278
突變體3-3Lys16lArg/Thr195Tyr/Ser373Asn2617
突變體3-4Lysl61Arg/Ala230Thr/Ser373Asn2278
突變體3-5Lysl61Arg/Val261Gly/Lys322Arg2731
突變體3-6Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn2845
突變體4-1Alal29Ser/Lysl61Arg/Ala230Thr/2073
Lys322Arg
華根霉脂肪酶氨基酸原始序列為SEQ ID NO=I ；華根·_脂肪酶
1. 0 1. 1 1. 3 1. 3 1. 6 1. 7 1. 2 1. 5 2 1. 2
1.4
2.5 1. 5 1. 8
1.5
3.3
2.8 2
2. 3 2
2. 4 2. 5 1. 8
為SEQ ID NO :2，7個突變氨基酸用底色標(biāo)記顯示。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明運用易錯PCR方法對華根霉脂肪酶基因(Genbank登 錄號EF405962)進行定向進化，通過多輪重組和定點突變，獲得華根霉脂肪酶突變體，這 些突變體包含氨基酸突變 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、 Lys322Arg,Ser373Asn以及上述氨基酸突變的組合。以轉(zhuǎn)換數(shù)K。at表示，脂肪酶突變體的酶 活得到了提高。
具體實施例方式實施例中涉及到的培養(yǎng)基配方如下LB液體培養(yǎng)基蛋白胨1 %，酵母提取物0. 5 %，NaCl 1 %，pH7. 0。YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) Yeast Extract 1 %, Trypton2%, Dextrose 2%，制作平板時加入Agar 2%。121°C高壓滅菌20min。用于篩選G418抗 性時加入G418至終濃度為0. 25mg/mL-l. Omg/mL,即YPD-G418平板。MD(Minimal Dextrose Medium) :YNB 1. 34%, Biotin 4X10_5%, Dextrose 2%, Agar 2%。MM (Minimal Methanol Medium) :YNB1. 34%, Biotin4X 10_5%, Methanol 0. 5%, Agar2%。BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, YNB 1. 34%, Biotin 4X 10_5%, Glycerol 1 %，磷酸鉀溶液 100mmol/L。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, 34%, Biotin 4X 10_5%, Methanol 0. 5%，磷酸鉀溶液 100mmol/L。 培養(yǎng)基中的單位為％ (W/V)。
實施例1、利用易錯PCR方法構(gòu)建華根霉脂肪酶突變文庫 利用易錯PCR技術(shù)在體外向華根霉脂肪酶基因proRCL引入核苷酸突變。 易錯PCR的反應(yīng)條件如下 YNB 1
dCTP(25mmol/L)2μ L
dTTP(25mmol/L)2μ L
dGTP(10mmol/L)1 μ L
dATP(10mmol/L)1 μ L
F(20pmol/y L)1 μ L
R(20pmol/y L)1 μ L
Mg2+ (25mM)14 μ L
Mn2+ (5mM)1. 5μ LpPIC9K-proRCL0· 5 μ L(攜帶有華根霉脂肪酶基因proRCL的質(zhì)粒)Taq DNA 聚合酶(2. 5U)1 μ L10 X PCR 緩沖液(不含 MgCl2)5 μ LddH2020 μ L其中，引物F和R序列為上游引物F:5' -TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3'下游引物R 5 ‘ -AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3 ‘。PCR 擴增條件94 "C 3min ；94 "C Imin, 59 "C Imin, 72 "C 2min，30 個循環(huán)； 720C IOmin。易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，限制性內(nèi)切酶Avr II和NotI分別對 易錯PCR擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9K進行消化，連接，轉(zhuǎn)化至E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。涂布 于LB (含100 μ g/ μ L的Amp)平板。生長12h后，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，
獲得突變質(zhì)粒。將突變質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞。 將轉(zhuǎn)化液涂布于MD平板上，30°C培養(yǎng)2天，構(gòu)成突變文庫。
5
利用上述同樣的方法，以突變體基因組為模版進行多輪易錯PCR，構(gòu)建突變文庫。實施例2、高酶活脂肪酶突變體的篩選用滅菌牙簽將MD平板上生長出的His+轉(zhuǎn)化子復(fù)制到Y(jié)PD和BMMY平板的相同位 置，同時將對照菌GS 115/pPIC9K-proRCL接種至BMMY平板上。30°C培養(yǎng)2天。平板初篩保存生長完畢的YPD平板。每12h向BMMY平皿蓋上補加200 μ L甲醇 誘導(dǎo)重組脂肪酶表達(dá)。誘導(dǎo)2-3天。向酶活測定底物ρΝΡΡ中加入0.6%瓊脂，混合均勻后， 倒于BMMY平板形成頂層瓊脂。2min內(nèi)出現(xiàn)明顯黃色的菌株為初篩目的突變菌株。相同條 件下，對照菌GS115/pPIC9K-proRCL不能顯示出明顯黃色。96孔板復(fù)篩向1.8mL/孔(平底)的96孔板中加入300 μ L BMGY培養(yǎng)基，121°C滅 菌20min。向其中接入保藏于YPD平板上的初篩目的菌株(同時接入GS115/pPIC9K-proRCL 作為對照)，30°C 250r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為2-6 (約16_18h)。離心，棄上清，用900 μ L BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，并加入(V/V)甲醇誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。此后每24h補加IOOyL BMMY培養(yǎng)基和1 % (V/V)甲醇，誘導(dǎo)4天。將誘導(dǎo)表達(dá)96h的96孔板發(fā)酵液3000r/min離 心lOmin，收集上清。取1 μ L上清液稀釋500倍后，取5 μ L于另一 96孔板中，用排槍加入 底物，振蕩混勻。2min內(nèi)迅速顯示明顯黃色的菌株為復(fù)篩目的菌株。相同條件下，對照菌 GS115/pPIC9K-proRCL的發(fā)酵上清液不能顯示明顯黃色。 以易錯PCR構(gòu)建的突變文庫為基礎(chǔ)進行篩選，獲得6株酶活明顯提高的菌株，測定 脂肪酶核苷酸序列，利用三聯(lián)體密碼子推測脂肪酶的氨基酸序列，脂肪酶突變體的氨基酸 取代及K。at值提高倍數(shù)如表1所示。根據(jù)實施例3的方法測定脂肪酶突變體的K。at值。表1突變體的測序結(jié)果 實施例3脂肪酶突變體的K。at值測定為測定脂肪酶的K。at值，需要對酶進行分離純化。搖瓶發(fā)酵將出發(fā)菌株以及各脂肪酶突變體，接種至25mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C振 蕩培養(yǎng)16 20h至OD6tltl為2 6，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD6tltl為1，每隔24h添加0. 5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)3-4天后，收集發(fā)酵上清液。分離純化將突變菌株的發(fā)酵上清液經(jīng)過IOKD超濾膜濃縮，SP-SepharoseFF強陽 離子交換層析和Phenyl-Si5Pharose 6FF疏水色譜柱層析后得到純化的突變脂肪酶活性組 分。具體操作參考文獻(xiàn) Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B :Enzym，2009，57 :304_311。測定方法脂肪酶活力的測定方法為pNPP法(Pencreach G et al. Enzyme and MicrobialTechnol. 1996，18 :417_422.)。酶活的定義為一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生 1 μ mol對硝基苯酚的酶量為一個脂肪酶水解酶活國際單位。在底物對硝基苯酚棕櫚酸酯濃 度為O 25mmol/L范圍內(nèi)，測定酶活力，計算獲得脂肪酶的動力學(xué)參數(shù)K。at。實施例4定點突變組合脂肪酶突變體的基因突變位點經(jīng)過多輪易錯PCR進行突變文庫構(gòu)建，得到包含有氨基酸突變位點Alal29Ser、 Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn 的 7 個突變株。為 了考察其中某一個突變及各突變的組合對脂肪酶突變株活力的影響，對發(fā)現(xiàn)的突變位點進 行定點突變組合，獲得多個脂肪酶突變體。(定點突變可以利用市售的試劑盒進行。)將含有上述突變位點組合的基因與載體pPIC9K連接，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，以 獲得脂肪酶的高效分泌表達(dá)。以與實施例3等同的方法測定脂肪酶突變體的K。at值。各突 變體酶的組合位點及其K。at提高的倍數(shù)如表2所示。表2突變體的測序結(jié)果及其K。at提高的倍數(shù)
0085]序列表
0086]<210>SEQ ID NO 1
0087]<211>389
0088]<212>PRT
0089]<213> 華根霉(Rhizopus
0090]<400>1
0091]Met Val Ser Phe Ile
0092]5
0093]Leu Val Ser Ser Met
0094]20
0095]Gly His Lys Gly Ser
0096]35
0097]Leu Pro Pro Leu lie
0098]50
0099]Glu Thr Thr Gly Asp
0100]65
0101]Ser Val Gln Trp Tyr
0102]80
0103]lie Lys Arg Asp Thr
0104]95
0105]Pro Glu Asn Pro Pro
0106]110
0107]Ser Asp Ser Gly Glu
0108]125
0109]Glu Leu Thr Asn Tyr
0110]140
0111]Ser Val Val Pro Gly
0112]155
chinensis)CCTCC M 201021 脂肪酶氨基酸
Ser lie Ser Gln Gly 10
Met Leu Gly Ser Ser 25
Val Lys Ala Thr Asn 40
Ser Ser Arg Cys Thr 55
Pro Asp Ala Glu Ala 70
Gln Ala His Gly Gly 85
Glu Thr Val Gly Gly 100
Pro lie Pro Ala Thr 115
Val Val Thr Ala Thr 130
Ala Gly Val Ala Ala 145
Thr Lys Trp Asp Cys 160
Val Ser Leu Cys Leu 15
Ala Val Pro Val Ala 30
Gly Thr Asp Phe Gln 45
Pro Pro Ser His Pro 60
Tyr Tyr lie Asn Lys 75
Asn Tyr Thr Ala Leu 90
Met Thr Leu Asp Leu 105
Ser Thr Ala Pro Ser 120
Ala Ala Gln lie Lys 135
Thr Ala Tyr Cys Arg 150
Lys Gln Cys Leu Lys 1650113]
0114]
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
Tyr Thr Ile Thr Ala Lys Asp Ala Ser Gly Phe Pro Lys Thr Asp
Val Asp Tyr Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Asn His Gln Glu Lys His
Pro Thr Val MET Val Tyr Lys Leu Lys Asn Arg Ala Asp Gln Leu
Asp Asn Thr Val His Phe Val Ala Asn Ala Thr Phe Pro Cys Thr
Gly 170 Gly 185 Phe 200 Phe 215 Ala 230 Pro 245 lie 260 Gly 275 Leu 290 Phe 305 Val 320 Gly 335 Ala 350 Ser 365 Tyr 380
Lys Phe Arg Thr Gly Val Val Met Ser Ala His Tyr Asp Asn Phe
Leu lie Gly Phe Phe Val Thr Asp lie Tyr Lys Leu Val Ser Gly
lie Lys Leu Arg Thr Asn Thr Asp Leu Ser Gln Asp Gly His Leu Tyr Tyr Thr Tyr Val Arg Asp His Pro Gln lie lie Val lie Asn
Thr 175 Ser 190 Ser 205 Tyr 220 Ser 235 Gln 250 Ser 265 Gln 280 Val 295 Asp 310 lie 325 Gly 340 Cys 355 Pro 370 Glu 385
Phe Asp Phe Ser Tyr Leu Leu Arg Gly Ser Val Val Thr Phe Gly
Thr Ala Arg Pro Asn Thr Gly Glu Cys Thr Pro Glu Ser Thr Ser
Ser Gln Ser Val Gln Ala Gly Lys Pro Gly His Ser Asn Ser Cys
Leu Lys Ala Lys Val Tyr Ala Arg Arg lie Val Trp lie lie Leu
Leu 180 Thr 195 lie 210 Gly 225 Val 240 Pro 255 Gln 270 Leu 285 Val 300 Pro 315 Pro 330 lie 345 Glu 360 Ala 375
389
<210>SEQ ID NO 2
<211>389
<212>PRT
<213> 華根霉(Rhizopus <400>2
Met Val Ser Phe lie
5
Leu Val Ser Ser Met 20
chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸突變體
Ser lie Ser Gln GlyVal Ser Leu Cys Leu
1015
Met Leu Gly Ser SerAla Val Pro Val Ala
25300152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158] 0159]
0160] 0161] 0162]
0163]
0164]
0165]
0166]
0167]
0168]
0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
0174]
0175]
0176]
0177]
0178]
0179]
0180] 0181] 0182]
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
Gly Leu Glu Ser Ile Pro Ser Glu Ser Tyr Thr Ile Thr Ala Lys Asp Ala Ser Gly Phe
His Pro Thr Val Lys Glu Asp Leu Val Val Asp Tyr Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Asn His
Lys Pro Thr Gln Arg Asn Ser Thr Val Pro Thr Val MET Val Tyr Lys Leu Lys Asn Arg
Gly Leu Gly Trp Asp Pro Gly Asn Pro Asp Asn Thr Val His Phe Val Ala Asn Ala Thr
Ser 35 lie 50 Asp 65 Tyr 80 Thr 95 Pro 110 Glu 125 Tyr 140 Gly 155 Gly 170 Gly 185 Phe 200 Phe 215 Thr 230 Pro 245 lie 260 Gly 275 Leu 290 Phe 305 Val
Val Ser Pro Gln Glu Pro Val Ala Thr Lys Phe Arg Thr Gly Val Gly Met Ser Ala His
Lys Ser Asp Ala Thr lie Val Gly Lys Leu lie Gly Phe Phe Val Thr Asp lie Tyr Arg
Ala Arg Ala His Val Pro Thr Val Trp lie Leu Thr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Tyr Arg
Thr Cys Glu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Lys Arg Asn Asp Ser Asp His Tyr Thr Val Asp
Asn 40 Thr 55 Ala 70 Gly 85 Gly 100 Thr 115 Thr 130 Ala 145 Cys 160 Thr 175 Ser 190 Ser 205 Tyr 220 Ser 235 Gln 250 Ser 265 Gln 280 Val 295 Asp 310 lie
Gly Pro Tyr Asn Met Ser Ala Thr Arg Phe Asp Phe Ser Tyr Leu Leu Arg Gly Ser Val
Thr Pro Tyr Tyr Thr Thr Ala Ala Gln Thr Ala Arg Pro Asn Thr Gly Glu Cys Thr Pro
Asp Ser lie Thr Leu Ala Gln Tyr Cys Ser Gln Ser Val Gln Ala Gly Lys Pro Gly His
Phe His Asn Ala Asp Pro lie Cys Leu Leu Lys Ala Lys Val Tyr Ala Arg Arg lie Val
Gln 45 Pro 60 Lys 75 Leu 90 Leu 105 Ser 120 Lys 135 Arg 150 Lys 165 Leu 180 Tyr 195 lie 210 Gly 225 Val 240 Pro 255 Gln 270 Leu 285 Val 300 Pro 315 Pro
320325330
ProGlnAlaPhe GlyTyrLeuHisProGlyValGluSerTrplie
335340345
LysGluAspProAlaAspValGlnlieCysThrSerAsnlieGlu
350355360
ThrLysGlnCysSerAsnSerlieValProPheThrAsnlieAla
365370375
AspHisLeuThr TyrPheGlylieAsnGluGlySerCysLeu
380385389
<210>SEQ IDNO 3
<400>3
F 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3'；
R 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3/ O
1權(quán)利要求
通過定向進化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體，其特征是由華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶基因(Genbank登錄號EF405962)，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經(jīng)定向進化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸兩個、三個或四個突變的組合；以轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測序結(jié)果及其Kcat提高的倍數(shù)為脂肪酶突變體 氨基酸取代位置 Kcat(/min) Kcat提高的倍數(shù)出發(fā)菌株脂肪酶11381.0突變體1 1Ala129Ser12521.1突變體1 2Lys161Arg14791.3突變體1 3Thr195Tyr14791.3突變體1 4Ala230Thr18211.6突變體1 5Val261Gly19351.7突變體1 6Lys322Arg13661.2突變體1 7Ser373Asn17071.5突變體2 1Ala129Ser/Lys161Arg 22782突變體2 2Ala129Ser/Ala230Thr 13651.2突變體2 3Ala129Ser/Val261Gly 15931.4突變體2 4Lys161Arg/Thr195Tyr 28452.5突變體2 5Lys161Arg/Lys322Arg 17071.5突變體2 6Lys161Arg/Ser373Asn 20481.8突變體2 7Ala230Thr/Ser373Asn 17071.5突變體2 8Val261Gly/Ser373Asn 37263.3突變體3 1Ala129Ser/Ala230Thr/Val261Gly31862.8突變體3 2Ala129Ser/Ala230Thr/Lys322Arg22782突變體3 3Lys161Arg/Thr195Tyr/Ser373Asn26172.3突變體3 4Lys161Arg/Ala230Thr/Ser373Asn22782突變體3 5Lys161Arg/Val261Gly/Lys322Arg27312.4突變體3 6Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn28452.5突變體4 1Ala129Ser/Lys161Arg/Ala230Thr/ 20731.8 Lys322Arg 。
全文摘要
通過定向進化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種由華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶基因經(jīng)定向進化而獲得的一系列脂肪酶突變體。在各突變體的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突變?yōu)锳la129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸兩個、三個或四個突變的組合。以轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat表示，這些突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高。
文檔編號C12N9/20GK101899427SQ20091023518
公開日2010年12月1日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者喻曉蔚, 徐巖, 王睿 申請人:江南大學(xué)