專(zhuān)利名稱(chēng)：一種組織工程化肺臟組織及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程化肺臟組織及其構(gòu)
建方法。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一 門(mén)新興交叉學(xué)科，近年來(lái)，隨著生命 科學(xué)、材料科學(xué)和工程科學(xué)的發(fā)展，科研人員相繼在骨骼、軟骨、皮膚、乳腺以及神經(jīng)等多種 組織、器官體外再造研究方面取得突破性進(jìn)展，其中，一些組織工程產(chǎn)品如軟骨、皮膚已實(shí) 現(xiàn)商品化。由于肺臟本身具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，再加上組織工程化肺臟的研究起步較晚， 目前在體外構(gòu)建的組織工程化肺臟組織還遠(yuǎn)不能實(shí)現(xiàn)商品化，但是在體外構(gòu)建組織工程化 肺臟組織是研究多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子與肺臟組織關(guān)系的基礎(chǔ)，也是動(dòng)物模型建立、肺臟 疾病機(jī)理研究或治療肺臟疾病藥物篩選等方面的基礎(chǔ)。Mondrinos. M. J等(Mondrinos， M.J.等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2007， 293， L639)應(yīng)用體外構(gòu)建的肺臟組 織研究成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGFIO、 FGF7和FGF2的作用機(jī)制，AndradeCF等(Andrade CF 等，Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol 2007， 292 :L510_L518)應(yīng)用體外構(gòu)建的三維組 織進(jìn)行體內(nèi)移植。總之，構(gòu)建的組織工程化肺臟組織有利于尋找肺臟疾病方面新的診斷技 術(shù)和治療藥物。 組織工程需要使用種子細(xì)胞來(lái)生成并維持組織特異性生物功能，同時(shí)使用合成的 或天然的基質(zhì)材料支持和引導(dǎo)組織發(fā)育。肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，若實(shí)現(xiàn)工程化組織 模擬正常組織有較大的困難，其中支架材料的選擇尤為重要。 多種材料單獨(dú)作為支架進(jìn)行肺臟的研究已有報(bào)道。Patty Chen (Chen P等，Tissue engineering, 2005， 11 :9-10) 、 Mondrinos， M. J (Mondrinos， M. J.等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2007， 293， L639) 、 Faraj KA (Faraj KA等，Tissue Eng. 2007， 13 (10): 2387-94) 、 Tome i AA(Tomei AA等，BiotechnolBioeng， 2009， 103 (1) :217-25)等人先后 將膠原應(yīng)用到肺臟組織工程研究中。Blau， H(Blau， H等，Cell Physiol, 1988， 136， 203)、 Mondrinos. M J (Mondrinos. M J等，Ti ssue Eng. ，2006， 12， 717 ;Tissue Eng Part A，2008， 14(3) :361-8)還將Matrigel基質(zhì)膠也引入到肺臟組織的工程化構(gòu)建中。在其它材料方面， Mondrinos. M. J (Mondrinos. MJ等，Tissue Eng. ， 2006， 12， 717)也采用PLLA和PLGA作為 支架材料體外構(gòu)建三維肺臟組織，也有研究者(Douglas, W.H.等，In Vitro， 1976 12,373; Am. Rev. Respir. Dis. ，1976，113，17 ;TCA Manual,1978，4，749 ;In Vitro，1980，16,306)采 用膠原海綿球(Gelfoam)進(jìn)行研究。 盡管作為肺臟組織工程的支架材料已有許多報(bào)道，但是這些材料都不能滿(mǎn)足肺臟 組織的囊性結(jié)構(gòu)，對(duì)肺泡樣結(jié)構(gòu)的形成不能在一定程度上進(jìn)行控制。 微囊技術(shù)(Encapsulation)是指用半透膜包被生物活性物質(zhì)以形成微囊的技術(shù)， 形成的微囊可以阻遏免疫細(xì)胞以及大分子抗體通過(guò)半透膜，同時(shí)允許氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一 些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由出入。微囊的物理參數(shù)如大小、膜通透性、機(jī)械強(qiáng)度等是可控的。微囊目前主要用于微囊化細(xì)胞技術(shù)，主要應(yīng)用在如糖尿病治療，嗜鉻細(xì)胞的鎮(zhèn)痛的 治療方面；微囊化細(xì)胞技術(shù)是目前細(xì)胞治療、組織和器官替代治療的主要方法之一。然而， 將微囊應(yīng)用于肺臟組織工程，尤其是將海藻酸鈉-多聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊/海 藻酸鋇_多聚賴(lài)氨酸_海藻酸鈉(BPA)微囊作為組織工程化肺臟的支架尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法。 本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述方法獲得的組織工程化肺臟組織，該方法 構(gòu)建的組織工程化肺臟組織具有肺泡樣結(jié)構(gòu)，肺泡樣結(jié)構(gòu)由APA或BPA微囊提供。
—種組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，按照如下操作步驟進(jìn)行
(1)制備肺細(xì)胞懸液 從肺臟組織中分離或誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞獲得肺臟細(xì)胞，然后用2XH-DMEM培養(yǎng)液重 懸細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5X 105 5X 106/mL的肺細(xì)胞懸液；
(2)微囊的制備 將1. 5-2. 0%海藻酸鈉溶液，在4-9kV/cm的電場(chǎng)作用下，通過(guò)靜電微囊制作儀以 5-35mL/h的速度推入到1. l-1.5X的氯化鈣/2X的氯化鋇溶液中，反應(yīng)8-12min，形成海 藻酸鈣/鋇膠珠，然后依次用0. 55%氯化鈣液、0. 28%氯化鈣液、生理鹽水、0. 1% (2-環(huán)己 烷)-l-乙磺酸(CHES)和1. 1-1. 5%的氯化|丐/2%氯化鋇溶液沖洗；沖洗后加入0. 05%多 聚賴(lài)氨酸(PLL)，反應(yīng)6min后依次用0. 1 % (2-環(huán)己烷)-1_乙磺酸(CHES)、1. 1-1. 5%的 氯化鈣/2%氯化鋇溶液和生理鹽水沖洗；再加入0. 05%的海藻酸鈉溶液反應(yīng)4min后用生 理鹽水沖洗；再加入1. 5%檸檬酸鈉溶液反應(yīng)2min后用生理鹽水沖洗3_5遍，得到海藻酸 鈉_多聚賴(lài)氨酸_海藻酸鈉(APA)微囊/海藻酸鋇-多聚賴(lài)氨酸_海藻酸鈉(BPA)微囊；
(3)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞_支架復(fù)合物的培養(yǎng) 將步驟(1)制得的細(xì)胞懸液與步驟(2)制得的微囊混合，再添加濃度為 1. 5-2. 5mg/mL的膠原與Matrigel基質(zhì)膠，混勻后，調(diào)節(jié)pH值至7. 2_7. 4，其中細(xì)胞懸液、膠 原和Matr igel基質(zhì)膠的體積比為5 : (4_3) : (2-1);然后將獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物 加至由細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5% C02、37t:的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì) 胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10X胎牛血清的H-匿EM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-14天，即得到 組織工程化肺臟組織。 步驟(3)所用APA和BPA微囊的直徑為100-400 y m。
所述肺臟組織來(lái)源于小鼠胚胎期肺臟。
所述胚胎干細(xì)胞來(lái)源于小鼠。
所述膠原為I型鼠尾膠原。 所述細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具是將細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入lml的濃度為 2%的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4根長(zhǎng)約lcm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30分 鐘，獲得靜態(tài)拉伸模具。 —種利用上述方法獲得的組織工程化肺臟組織。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用APA或BPA微囊，聯(lián)合膠原、Matrigel基質(zhì)膠作為 組織工程化肺臟的支架，同現(xiàn)有用于肺臟的支架材料相比，該支架體系能夠有效地促使肺泡樣結(jié)構(gòu)的形成，能夠?qū)崿F(xiàn)氣體以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，其中，APA或BPA微囊為肺泡樣結(jié)構(gòu) 的基本材料，液態(tài)膠原能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供三維的生長(zhǎng)環(huán)境，Matrigel基質(zhì)膠為體外構(gòu)建 三維的組織工程化肺臟組織提供各種必需的生長(zhǎng)因子。本方法操作簡(jiǎn)單、可實(shí)施性強(qiáng)，能夠 較好地控制肺泡樣結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)推進(jìn)組織工程化肺臟發(fā)展具有重要意義。


圖1.小鼠胎肺細(xì)胞組織學(xué)檢測(cè)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖； a. HE染色，X 20 ;b.免疫組織化學(xué)Vimentin， X40 ;c.免疫組織化學(xué)SpC， X40 圖2. APA空微囊圖X 50 ; 圖3.肺臟組織片層宏觀觀察圖； a.培養(yǎng)10h后肺臟組織生長(zhǎng)情況圖；b.培養(yǎng)7d后肺臟組織生長(zhǎng)情況圖 圖4.本發(fā)明肺臟組織片層組織學(xué)檢測(cè)(HE染色)結(jié)果圖；X 10 圖5.本發(fā)明肺臟組織片層免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖。 a. Vimentin， X 10 ;b. SpC， X 10
具體實(shí)施例方式
通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但是以下實(shí)施例僅僅是作為例證，并不 對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。以下實(shí)施例中未詳細(xì)說(shuō)明的部分請(qǐng)參閱RobertLanza， Robert Langer and Joseph Vacanti編寫(xiě)的《Pr inciples of TissueEngineering》第三片反禾口 Anthony Atala， Robert P丄anza編寫(xiě)的《Methods of tissueengineering》(2006)。
本發(fā)明構(gòu)建方法中使用的細(xì)胞分離、培養(yǎng)及組織鑒定所需試劑
1) H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基H-DMEM干粉培養(yǎng)基一袋，3. 7g NaHC03， 2. 383gHEPES， 10萬(wàn) 單位青霉素，10萬(wàn)單位鏈霉素，溶解于lOOOml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng)0. 22 y m 微孔濾膜過(guò)濾除菌，4t:保存。使用時(shí)添加10%胎牛血清(FBS)，用于肺臟細(xì)胞、組織工程化 肺臟組織及滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)。 2)濃縮培養(yǎng)基(2 XH-DMEM) :H-DMEM干粉培養(yǎng)基 一 袋，3. 7g NaHC03， 2. 383g HEPES， 10萬(wàn)單位青霉素，10萬(wàn)單位鏈霉素，溶解于500ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2_7. 4， 經(jīng)0. 22 ii m微孔濾膜過(guò)濾除菌，fC保存。 3)胚月臺(tái)干誘導(dǎo)培養(yǎng)基商品化液體培養(yǎng)基(knock-out serum r印lacement， KSR) 1000ml，添加103U/ml白血病抑制因子，50 ii M的PD98059。 4)胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基H-DMEM干粉培養(yǎng)基一袋，3. 7g NaHC03， 2. 383g HEPES， IO萬(wàn)單位青霉素，IO萬(wàn)單位鏈霉素，O. lmmol/L P -巰基乙醇，1 %非必需氨基酸，103U/ml白 血病抑制因子，溶解于1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng)0. 22 P m微孔濾膜過(guò)濾除 菌，4t:保存。使用時(shí)添加15% FBS，用于胚胎干細(xì)胞及組織工程化肺臟組織的培養(yǎng)。
5) PBS :稱(chēng)取8g NaCl，O. 2g KC1，3. 491g Na2HP04 12H20，0. 2g KH2P04，溶解于 lOOOml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4， 12rC高壓蒸汽滅菌20min，4t:保存。
6) 0. 25 %胰蛋白酶-EDTA消化液稱(chēng)取0. 25g胰蛋白酶，0. 04gEDTA，充分溶解于 100ml PBS中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于-20。C保存。
7)4%多聚甲醛固定液加熱O. lM的PB溶液至沸騰，加入20g多聚甲醛，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，過(guò)濾除雜質(zhì)，fC保存。
制備微囊所需試劑 1)海藻酸鈉溶液稱(chēng)取1. 3g， 1. 5g， 1. 8g和2. 0g海藻酸鈉粉末分別溶于lOOmL
D-Hank' s溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，采用抽濾法分別通過(guò)0. 45 y m和0. 22 y m的濾膜除菌，
即配置成1.3%，1.5%，1.8%和2.0%的海藻酸鈉溶液，用于液滴的形成。 2) 1. 5% CaCl2溶液和2% BaCl2溶液分別稱(chēng)取1. 5g的CaCl2和2g的BaCl2溶于
生理鹽水中，待充分溶解后，經(jīng)0. 22 ii m濾膜除菌，即配置成1.5% CaCl2和2% BaCl2溶液，
作為微囊形成第一步的固化液，使海藻酸鈉液滴形成海藻酸鈣和海藻酸鋇膠珠。 3)多聚賴(lài)氨酸溶液(PLL):稱(chēng)取O. Olg，O. 03g，0. 05g，0. 07g和0. 10gPLL溶于
100mlD-Hank' s溶液中，待充分溶解后經(jīng)0. 22 y m濾膜除菌，即配置成0. 01 %，0. 03 %，
0. 05%，0. 07%和0. 1%的多聚賴(lài)氨酸溶液，用于三層微囊結(jié)構(gòu)的第二層的形成。 4)0. 05%的海藻酸鈉溶液稱(chēng)取0. 05g海藻酸鈉粉末溶于100mLD-Hank' s溶液
中，待充分溶解后經(jīng)O. 22ym濾膜除菌，即配置成的海藻酸鈉溶液，用于三層微囊結(jié)構(gòu)的第
三層的形成。 5) 1. 5%檸檬酸鈉溶液稱(chēng)取1. 47g檸檬酸鈉粉末溶于100mL D-Hank' s溶液中， 待充分溶解后經(jīng)O. 22ym濾膜除菌，即配置成1.5%的檸檬酸鈉溶液，用于微囊制備時(shí)核芯 的液化。 6) CHES溶液稱(chēng)取lg CHES溶于1000ml三蒸水中，待充分溶解后經(jīng)0. 22 y m濾膜 除菌，即配置成0. 1%的CHES溶液，作為微囊制備過(guò)程中的洗液。 7)0. 28%、0. 55%0&(:12溶液分別稱(chēng)取O. 28g和0. 55g CaCl2溶于生理鹽水中，待 充分溶解后，經(jīng)0. 22 ii m濾膜過(guò)濾除菌，即配置成0. 28%和0. 55% CaCl2溶液，作為微囊制 備過(guò)程中的洗液。 實(shí)施例1以小鼠胎肺細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化肺臟組織
(1)小鼠胎肺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 胎肺來(lái)源于胚胎期為18天的昆明白小鼠的胎鼠。按常規(guī)方法分離胎肺，然后在 1XPBS中沖洗，剪碎并于室溫下，在0. 25X胰蛋白酶-EDTA消化液中消化20-25分鐘。然 后加入2倍體積的含10% FBS的H-匿EM培養(yǎng)基終止酶活性，接著用吸管吹打研磨。組織 勻漿用70 ii m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，800rpm離心5分鐘。細(xì)胞沉淀物用900 y 1的蒸餾水重懸 30-45秒，低滲除去紅細(xì)胞，然后添加100 iil的IOXPBS。細(xì)胞再次離心沉淀，用一定體積 的含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基重懸，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；用組織學(xué)HE染色表明細(xì)胞 活性良好，如圖1 (a)所示，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法鑒定Vimentin和SpC均有陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn) 圖1 (b)和(c)。 用2XH-DMEM重懸再次沉淀后的小鼠胎肺細(xì)胞，制得細(xì)胞密度為5X 106/mL的細(xì) 胞懸液。 (2) APA/BPA微囊的制備 將2. 0%海藻酸鈉溶液，在6kV/cm的電場(chǎng)作用下，通過(guò)靜電微囊制作儀以15ml/h 的速度勻速推入1.1%的氯化鈣/2%的氯化鋇溶液中，反應(yīng)10min，形成海藻酸鈣/鋇膠珠。 依次用0. 55%氯化鈣溶液、0. 28%氯化鈣溶液、生理鹽水、0. 1% CHES和1. 1%的氯化鈣溶 液沖洗；再加入0. 05% PLL反應(yīng)6min，依次用0. 1 % CHES、 1. 1 %的氯化鈣/2%的氯化鋇溶液和生理鹽水沖洗；再加入O. 05X的海藻酸鈉溶液反應(yīng)4min，生理鹽水沖洗；再加入1. 5% 檸檬酸鈉溶液反應(yīng)2min，生理鹽水沖洗3遍，再加入生理鹽水，置fC保存待用。通過(guò)上述 方法制得的微囊粒徑為200-300 ym，制得的APA空微囊表面光滑、大小均一，見(jiàn)圖2。
(3) I型液態(tài)鼠尾膠原的制備 從大鼠尾根部切斷鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min ;無(wú)菌條件下取出尾腱；剪 碎，浸入O. 1%的醋酸中；置于4t:冰箱；并用磁力攪拌機(jī)間斷進(jìn)行攪拌。48h后，4t:離心， 收集上清即得膠原溶液。制備的膠原溶液濃度約為2. Omg/ml。
(4)靜態(tài)拉伸模具的制備 將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入lml的濃度為2%的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插 入4根長(zhǎng)約lcm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30分鐘，獲得靜態(tài)拉伸模具。
(5)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及其復(fù)合物的培養(yǎng) 將0. 5ml步驟(1)制得的細(xì)胞懸液與步驟(2)制得的0. 5ml APA微囊(粒徑為 200-300 ii m)混合，再添加0. 4ml液態(tài)I型鼠尾膠原(2mg/ml)和100 y 1Matrigel基質(zhì)膠， 混勻，使用0. lmol/LNaOH調(diào)pH值為7. 2_7. 4，得到細(xì)胞與支架的復(fù)合物；將細(xì)胞與支架的 復(fù)合物加入至上述12孔靜態(tài)拉伸模具中，每孔注入復(fù)合物1. 5ml，以上操作在冰盒上進(jìn)行。 構(gòu)建的組織置于5% C02、37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30min后，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝固，加入含 10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3_14天，從圖3 (a)和(b)可見(jiàn)其生長(zhǎng)情況，在靜態(tài)拉伸模 具中可以構(gòu)建形成肺臟組織，并且能夠較好地生長(zhǎng)。 實(shí)施例2以誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞獲得的肺臟祖細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化 肺臟組織 (1)小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化肺臟祖細(xì)胞 (a)滋養(yǎng)層細(xì)胞，即原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的分離與培養(yǎng)昆明白孕小鼠 處死，75X灑精浸泡消毒30s，取出子宮，放在盛有PBS的100-mm組織培養(yǎng)皿中，取出胚胎， 去胚胎外組織，PBS沖洗去血。用無(wú)菌的鑷子去胚胎頭和內(nèi)臟，將胚胎轉(zhuǎn)移到60-mm組織培 養(yǎng)皿中，剪成lmm3左右的組織塊，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，再加PBS清洗。倒掉PBS，加入適量 胰酶溶液消化，反復(fù)吹打振蕩后，靜置片刻，將上清轉(zhuǎn)入血清中終止消化。重復(fù)上述步驟，直 至組織塊消化完全。收集所有消化上清，200日細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，移入離心管中1000rpm離 心5min。收集細(xì)胞，H-DMEM培養(yǎng)基洗一次后重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以5X 105個(gè)/ml細(xì) 胞密度接種于100-mm組織培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后更換新鮮的含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基。
(b)MEF滋養(yǎng)層的制備MEF傳至二代并等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，吸掉H-DMEM培養(yǎng)基，加入絲 裂霉素C，37t:孵育3h。孵育的同時(shí)準(zhǔn)備明膠處理的60-mm組織培養(yǎng)皿，明膠溶液覆蓋空的 組織培養(yǎng)皿底，室溫放置15min后，倒掉明膠溶液，晾干平放待用。上述絲裂霉素C處理的 MEF去掉H-DMEM培養(yǎng)基，PBS沖洗三次，完全去除絲裂霉素C，加入適量胰酶溶液消化，血清 終止消化后吹打分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min。收集細(xì)胞，重懸于含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以8X 105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于明膠包被的60_mm組 織培養(yǎng)皿中。 (c)小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)參考M. J. Evans (M. J. Evans等，Nature, 1981， 292 :154-156)從C57BL/6XDBA/2小鼠體內(nèi)分離胚泡，用鏈霉蛋白酶處理擴(kuò)增的胚泡，去除 透明帶，將無(wú)透明帶的胚泡轉(zhuǎn)移到上述MEF滋養(yǎng)層上，用胚胎干誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，5天后，將衍生物機(jī)械分離成碎片，繼續(xù)轉(zhuǎn)移到包被有滋養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。所得細(xì)胞即 為小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)。 吸掉MEF滋養(yǎng)層中的H-DMEM培養(yǎng)基，將上述分離的ESC加入5ml胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng) 培養(yǎng)基重懸。ESC的接種密度通常是2X 106/60-mm培養(yǎng)皿(接種有滋養(yǎng)層細(xì)胞)。細(xì)胞生 長(zhǎng)兩天后即需傳代。 (d)小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化肺臟祖細(xì)胞收集未分化ESC，離心，在明膠包被的 培養(yǎng)皿中差速貼壁1小時(shí)。吸取細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液置于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，即將一個(gè)T25瓶 的ESC接種于一個(gè)90mm培養(yǎng)皿中。于懸浮培養(yǎng)第2. 5天，開(kāi)始加入100ng/ml activinA， 繼續(xù)培養(yǎng)4天。于懸浮培養(yǎng)第6. 5天，更換為胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10% KOSR(KnockOut Serum R印lacement)，繼續(xù)培養(yǎng)3. 5天，收集擬胚體，后全部被置于涂有明膠的6孔板中(每 個(gè)90mm培養(yǎng)皿可置于兩個(gè)6孔板)，加入胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10 % KOSR，用于進(jìn)一步 貼壁培養(yǎng)分化。貼壁培養(yǎng)10天后，將培養(yǎng)基更換為小氣道基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SABM)中分化培養(yǎng) 15-25天。得到的祖細(xì)胞用2XH-DMEM重懸，制得細(xì)胞密度為5X 106/ml的細(xì)胞懸液。
(2)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及其復(fù)合物的培養(yǎng) 將0. 5ml本實(shí)施例步驟(1)制得的細(xì)胞懸液與實(shí)施例1步驟(2)制得的0. 5mlBPA 微囊(粒徑為200-300 ii m)混合，再添加實(shí)施例1制得的液態(tài)I型鼠尾膠原(2mg/ml) 0. 3ml 和200iU Matrigel基質(zhì)膠，混勻，使用O. lmol/LNaOH調(diào)pH值為7. 2-7. 4，得到細(xì)胞與支架 的復(fù)合物；將細(xì)胞與支架的復(fù)合物加入至實(shí)施例1制得的12孔靜態(tài)拉伸模具中，每孔注入 復(fù)合物1. 5ml，以上操作在冰盒上進(jìn)行。構(gòu)建的組織置于5% C02、37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30min 后，待細(xì)胞_支架復(fù)合物凝固，加入含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3_14天，可見(jiàn)肺臟組 織片層能夠較好地生長(zhǎng)。 實(shí)施例3體外構(gòu)建的組織工程化肺臟組織的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)
HE染色使用4X的多聚甲醛溶液固定采用實(shí)施例l方法體外培養(yǎng)7天的細(xì)胞-支 架復(fù)合物，濃度梯度酒精脫水，石蠟包埋，制備4 ii m厚度的切片。常規(guī)HE染色，光鏡觀察， 從圖4中可見(jiàn)細(xì)胞活性良好，并能夠形成肺泡樣的組織結(jié)構(gòu)。 免疫組織化學(xué)染色取采用實(shí)施例1方法體外培養(yǎng)7天的細(xì)胞_支架復(fù)合物進(jìn)行 石蠟包埋，切片，厚度為4 ii m，脫蠟。切片微波修復(fù)后用PBS漂洗5minX 3次，在H202孵育 10min，PBS漂洗5minX3次，山羊封閉血清作用20min。分別使用Vimentin抗體(1 : 1000)
和spc(i : 1200)作為一抗，陰性對(duì)照組使用pbs代替一抗，置于4t:，過(guò)夜孵育。pbs漂洗
3minX3次，加入二抗，即生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37。C孵育20min，PBS漂洗3minX3 次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37t:孵育20min， PBS漂洗3minX3次。DAB顯色5 10min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察 Vimentin和SpC均有陽(yáng)性表達(dá)，可見(jiàn)圖5 (a)和(b)。
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權(quán)利要求
一種組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，其特征在于，按照如下操作步驟進(jìn)行(1)制備肺細(xì)胞懸液從肺臟組織中分離或誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞獲得肺臟細(xì)胞，然后用2×H-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5×105～5×106/mL的肺細(xì)胞懸液；(2)微囊的制備將1.5-2.0％海藻酸鈉溶液，在4-9kV/cm的電場(chǎng)作用下，通過(guò)靜電微囊制作儀以5-35mL/h的速度推入到1.1-1.5％的氯化鈣/2％的氯化鋇溶液中，反應(yīng)8-12min，形成海藻酸鈣/鋇膠珠，然后依次用0.55％氯化鈣液、0.28％氯化鈣液、生理鹽水、0.1％(2-環(huán)己烷)-1-乙磺酸和1.1-1.5％的氯化鈣/2％氯化鋇溶液沖洗；沖洗后加入0.05％多聚賴(lài)氨酸，反應(yīng)6min后，依次用0.1％(2-環(huán)己烷)-1-乙磺酸、1.1-1.5％的氯化鈣/2％氯化鋇溶液和生理鹽水沖洗；加入0.05％的海藻酸鈉溶液，反應(yīng)4min后用生理鹽水沖洗；加入1.5％檸檬酸鈉溶液反應(yīng)2min后用生理鹽水沖洗3-5遍，得到海藻酸鈉-多聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉微囊/海藻酸鋇-多聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉微囊；(3)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟(1)制得的細(xì)胞懸液與步驟(2)制得的微囊混合，再添加濃度為1.5-2.5mg/mL的膠原與Matrigel基質(zhì)膠，混勻后，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，其中細(xì)胞懸液、膠原和Matrigel基質(zhì)膠的體積比為5∶(4-3)∶(2-1)；然后將獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至由細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10％胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-14天，即得到組織工程化肺臟組織。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所用 微囊的直徑為100-400 ii m。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，其特征在于，所述肺臟組 織來(lái)源于小鼠胚胎期肺臟。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，其特征在于，所述胚胎干 細(xì)胞來(lái)源于小鼠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法，其特征在于，所述膠原為I 型鼠尾膠原。
6. —種利用權(quán)利要求1-5任一所述組織工程化肺臟組織的構(gòu)建方法獲得的組織工程 化肺臟組織。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種組織工程化肺臟組織及其構(gòu)建方法。該組織工程化肺臟組織通過(guò)如下構(gòu)建方法獲得，(1)制備肺細(xì)胞懸液；(2)制備海藻酸鈉-多聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉微囊；(3)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)。本發(fā)明采用海藻酸鈉-多聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉微囊，聯(lián)合液態(tài)I型膠原和Matrigel基質(zhì)膠作為組織工程化肺臟的支架，該支架體系能夠有效地促使肺泡樣結(jié)構(gòu)的形成，實(shí)現(xiàn)氣體以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，對(duì)未來(lái)臨床應(yīng)用組織工程化肺臟組織治療肺部疾患具有重要意義。本發(fā)明的構(gòu)建方法操作工藝簡(jiǎn)單、實(shí)施條件溫和。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101701208SQ20091023634
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者周瑾, 張文君, 段翠密, 王常勇, 王海濱, 邱麗媛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所