專利名稱：以病毒mRNA核轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn)的抗HIV-1藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗Hiv-I藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染導(dǎo)致人體免疫機(jī)能缺陷，而易于發(fā)生機(jī)會(huì)性感 染和腫瘤的臨床綜合征。在過去的20多年里造成2000多萬人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已達(dá)4000萬左右。艾滋病不僅成為我國嚴(yán)重的衛(wèi)生健康問題，同時(shí)每年造成了上 千億的直接經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)中國衛(wèi)生部2008年通報(bào)，全國累計(jì)報(bào)告HIV感染者達(dá)25萬多人， 預(yù)計(jì)則高達(dá)約70萬人。目前臨床使用的傳統(tǒng)的抗艾滋病藥物雖在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些問題，如在人體內(nèi)活性不高、口服生物利用度低、易產(chǎn)生耐藥性或交叉耐藥性及生 產(chǎn)成本高等。耐藥是病毒的藥物作用靶位蛋白變異的結(jié)果。因?yàn)槟退幹杲?jīng)常對(duì)一組抗病毒 藥物耐藥，并且同一類藥物之間交叉耐藥非常常見。因此，急需尋找作用于新靶點(diǎn)的高效低 毒的抗艾滋病藥物。21世紀(jì)以來，研究人員的視線已集中到很多的新的靶點(diǎn)上。HIV-I基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個(gè)基因組約為9. 71Λ。結(jié)構(gòu)上包括 LTR，結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(gag)，多種酶活性的蛋白編碼區(qū)(pol)，外膜蛋白(erw)編碼區(qū)以 及6個(gè)調(diào)節(jié)基因。gag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時(shí)先形成一個(gè)分子量大約是55kD 的前體蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因產(chǎn)物與各種酶的功能相關(guān)，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能單獨(dú)翻譯，gag基因翻譯過程中，會(huì)有5% 10%的幾率發(fā)生特定的移碼，使翻譯繼續(xù)下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移碼蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I病毒的增殖、有效表達(dá)都依賴于一種調(diào)控蛋白一Rev蛋白。Rev蛋白即病毒 顆粒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子(Regulator of expression ofvirion protein，Rev)，是 HIV-1 病 毒復(fù)制非常重要的的一個(gè)反式激活因子，能夠促進(jìn)HIV-I的基因轉(zhuǎn)錄由早期向晚期轉(zhuǎn)變， 即由調(diào)節(jié)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄向結(jié)構(gòu)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行轉(zhuǎn)變。Rev蛋白大小為19KD，由Rev 基因編碼。Rev基因是由HIV-I病毒mRNA完全剪輯后的兩個(gè)外顯子組成，分別編碼25個(gè)氨 基酸和91個(gè)氨基酸的肽段，兩個(gè)肽段聚合形成116個(gè)氨基酸的Rev蛋白。Rev蛋白含有四 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域核定位信號(hào)(NLQ、RNA連接區(qū)域(RBD)、NLS/RBD側(cè)面低聚合區(qū)、核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào) (NES)。其中RBD域在HIV-I基因組RNA核轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)特異性地與HIV-I的RRE片段結(jié)合；NES 與CRMl蛋白的HllA和H12A片段特異性結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-I的mRNA通過轉(zhuǎn)錄后剪輯成為30多種mRNA，按照大小可分 為三類未剪輯mRNA、部分剪輯mRNA、完全剪輯mRNA。在病毒的生命過程中，這些mRNA 只有轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核才能完成其生物功能。其中，未剪輯mRNA和部分剪輯mRNA都因含 有 RRE (Rev-response element, Rev 蛋白效應(yīng)原件)片段，從而通過 Rev (Regulator ofexpression of virion protein)依賴性途徑從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的，前者作為 基因組RNA進(jìn)行病毒包裝，后者作為編碼feg/Pol的mRNA進(jìn)行翻譯；完全剪輯mRNA因無 RRE片段則由另一種途徑一 NXFl途徑轉(zhuǎn)運(yùn)出核，其主要是作為編碼調(diào)控蛋白和Env蛋白的 mRNA。HIV-ImRNA的Rev蛋白依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是依賴于Rev蛋白與核膜上的CRMl蛋白特異 性結(jié)合而完成的。CRMl是一個(gè)較為保守的蛋白，屬于RNA轉(zhuǎn)運(yùn)超家族蛋白。其專一性抑制 劑為來普霉素B(1印tomycin B，Iiffi)。尋找新的有效的抗HIV藥物，一直是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。然而，到目前為止仍然鮮 有有關(guān)簡便、高效地篩選抗HIV的方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足，本發(fā)明的提供一種用于篩選HIV藥物的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種真核表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有報(bào)告基因， 在所述報(bào)告基因的上游和下游分別具有SD序列的UTR片段和RRE片段。所述報(bào)告基因可 以是常規(guī)報(bào)告基因，為了便于檢測(cè)，所述報(bào)告基因優(yōu)選為熒光蛋白基因，所述熒光蛋白可以 是GFP、RFP、YFP等。為了提高表達(dá)效率，根據(jù)密碼子的偏愛性對(duì)熒光蛋白基因作適當(dāng)?shù)母?造是必要的。在本發(fā)明中，優(yōu)選根據(jù)HIV-I病毒密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)熒光蛋白編碼基因。在本發(fā)明的實(shí)例中，將正常GFP蛋白的密碼子改造成為Hiv-I病毒偏愛性的 hivGFP密碼子。使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終達(dá)到68%。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種篩選抗HIV-I藥物的方法，其是將上述的表達(dá)載體 與表達(dá)Rev的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞 中報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)量，判斷樣品是否對(duì)Rev蛋白具有抑制作用。當(dāng)報(bào)告基因?yàn)闊?光蛋白基因時(shí)，則可方便地通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)弱來進(jìn)行判斷。必要時(shí)，可以在檢測(cè)時(shí)以LMB 作為陽性藥物對(duì)照，來檢測(cè)細(xì)胞中熒光的強(qiáng)弱。這里所述的宿主細(xì)胞是指能夠表達(dá)Rev所 述報(bào)告基因的細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)例中，用于共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)載體(質(zhì)粒載體)分別是 pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA3_Rev，宿主細(xì)胞是^3T。該實(shí)例通過將正常GFP蛋白的密碼子 改造成為HIV-I病毒偏愛性的hivGFP密碼子，使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終達(dá) 到68%，然后將hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞即可表達(dá)hivGFP 蛋白。為了模擬自然生境下HIV-I的非剪切RNAs的核轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，在質(zhì)粒PCDNA3-HIVGFP上 hiv-GFP片段上下游分別添加了含有SD序列(major splice donor)的UTR片段和可以與 Rev蛋白特異性結(jié)合的RRE片段。其中SD序列可以防止hiv-GFP基因被細(xì)胞降解并得以 順利轉(zhuǎn)錄；RRE片段可以介導(dǎo)hivGFP mRNA通過Rev-CRMl途徑轉(zhuǎn)運(yùn)出核。，藥物對(duì)Rev蛋 白的抑制作用可以通過檢測(cè)hivGF熒光的強(qiáng)弱來判斷。通過將質(zhì)粒pUTR-hivGFP-RRE和 ρ⑶NA3_Rev按照一定比例共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，由于hivGFP的表達(dá)量受Rev蛋白的特異性的調(diào) 控，LMB作為專一性抑制Rev-CRMl核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的陽性藥物，備篩選化合物作用于共轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞后，通過檢測(cè)GFP熒光的強(qiáng)弱來判斷藥物對(duì)Rev蛋白的抑制作用。本發(fā)明以病毒mRNA核轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn)提供一種用于篩選抗HIV-I藥物的方法，利用該 方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-I的藥物，為抗HIV藥物的篩選提供了新途徑。

圖 1 為 pUTR-hivGFP-RRE 的質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例11 質(zhì)粒 pUTR-hivGFP-RRE 的構(gòu)建根據(jù)HIV-I病毒密碼子的偏愛性對(duì)正常GFP蛋白的密碼子進(jìn)行改造得到hivGFP 編碼序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示)，使得hivGFP與正常GFP基因的同源性最終 達(dá)到68%，然后將hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3質(zhì)粒載體上，得到質(zhì)粒ρ⑶NA3-HIVGFP。以BHlO質(zhì)粒(為NIH AIDS Reagent Program提供)(含有HIV-1毒株全序列)為 模板，用以下引物 5 ‘ ATCGAATTCCGACGCAGGACTCGGCTTGC-3 和 5 ‘ GATCCCATGGCTCTCTCCTTC AGCCTCCG-3 ‘進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 UTR 片段；用 5 ‘ GATCGGATCCGAGATCTTCAGACCTGGAGGAG-3 '禾Π 5' GATCCTCGAGGTTCACTAATCGAATGGATCTG-3'兩個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 RRE 片段。然 后分別在ρ⑶NA3-HIVGFP質(zhì)粒上Kpn I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間插入U(xiǎn)TR片段；在BamH I和Β ο I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間插入RRE片段。繼而將所得質(zhì)粒命名為pUTR-hivGFP-RRE。 (圖譜見圖1，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示)。
UTR片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(總體積50 μ 1)上游引物(10 μ Μ) :2μ 1下游引物(10 μ Μ) :2 μ 1模板質(zhì)粒 BHlO :1 μ 1Takara 公司 Pfu DNA 聚合酶 2 XMIX :25 μ 1ddH20 20 μ 1反應(yīng)條件95°C預(yù)變性:3min ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，四個(gè)循 環(huán)；72°C衍生IOmin ；4°C保存。RRE片段PCR擴(kuò)增的條件與UTR片段的PCR擴(kuò)增相同。2細(xì)胞培養(yǎng)取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用含0. 25% 胰酶、0. 02% EDTA的消化液消化。待細(xì)胞變圓，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)基(HyClone)，用吸管輕輕吹打瓶底，使細(xì)胞完全脫離瓶底且使之分散為單細(xì)胞懸液。 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿共接種2. 4 X IO6個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染。3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine 2000 Qnvitrogene)的說明書進(jìn)行。具體操作如下 用1. 5ml高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA Rev質(zhì)粒用量分別為20 μ g 和 2 μ g，比例為 10 1。用 1. 5ml 高糖 DMEM 培養(yǎng)基稀釋 60 μ 1 Lipofectamine 2000。室 溫孵育5min，將含有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的培養(yǎng)基輕輕混勻(總體積為:3ml)，5室溫孵育20min，加到IOcm培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)上清中。轉(zhuǎn)染后，37°C，5%的CO2培養(yǎng)12h。然后吸去培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，用含0. 25 %胰酶、0.02% EDTA的消化液消化，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打， 使細(xì)胞分散為單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2. 5X105個(gè)/ ml，混勻后于四周黑色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接種150 μ 1細(xì)胞懸液。4樣品制備化合物樣品IOmg純品化合物溶到ImlDMSO中，50 % DMSO稀釋到lmg/ml，取1.5μ 1作用于150 μ 1細(xì)胞體系，使其終濃度為 ομ g/ml。發(fā)酵液樣品菌種發(fā)酵，從斜面上挑取一小塊培養(yǎng)物種入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中，28°C、190rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)4d。取IOml發(fā)酵液用IOml的丙酮抽提，揮干 后，用Iml的DMSO溶解。取IOyl加IOyl水倍比稀釋，取1.5μ1作用于150μ1細(xì)胞體系。來普霉素B(1印tomycin B，LMB)購于USB公司(Lot No. 115925)，甲醇稀釋至終 濃度為ι μ g/ml?？梢詫Ｒ恍砸种芌ev-CRMl核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，從而降低hivGFP的表達(dá)。在本篩 選模型里作為陽性化合物。5樣品活性檢測(cè)96孔板培養(yǎng)1 后，按以下分組進(jìn)行操作溶劑對(duì)照組加入1. 5 μ 1 50% DMSO于細(xì)胞培養(yǎng)上清中，該組反映DMSO對(duì)hivGFP 蛋白表達(dá)的影響程度。陽性藥對(duì)照組加0. 75 μ 1的1 μ g/mlLMB于150 μ 1的細(xì)胞體系中。該組反映LMB 對(duì)Rev-CRMl核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的特異性抑制程度，同時(shí)反映hivGFP在Rev蛋白的介導(dǎo)下表達(dá)受 抑制程度。樣品實(shí)驗(yàn)組加藥篩選的樣品1. 5 μ 1于150 μ 1的細(xì)胞體系中。該組反映篩選樣 品程度對(duì)Rev-CRMl核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的特異性抑制程度，同時(shí)反映hivGFP在Rev蛋白的介導(dǎo)下 表達(dá)受抑制程度。繼續(xù)培養(yǎng)16h后，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μ L PBS,使用 480nm(±10nm)激發(fā)光，520nm(士 lOnm)處發(fā)射光，檢測(cè)GFP強(qiáng)度。結(jié)果，陽性藥物對(duì)照組的熒光強(qiáng)度顯著弱于溶劑對(duì)照組，表明LMB對(duì)hivGFP在Rev 蛋白的介導(dǎo)下表達(dá)產(chǎn)生了抑制作用。從組合化學(xué)庫共篩選3000個(gè)樣品，其中初篩陽性化合 物23個(gè)。序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>以病毒mRNA核轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn)的抗HIV-I藥物篩選方法<130>KHP09113514. 4<160>5<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>720
atggtaagcaaaggagaagaattatttacaggagtagtaccaatattagtagaattagac60ggtgacgtaaatggacataaatttagcgtaagcggagaaggagaaggtgacgcaacatat120ggaaaattaacatttttatatgtacaacaggaaaattaccagtaccctggccaaca180ttagtaacaacatttacatatggagtacaatgttttagcagatatccagaccatatgaaa240caacatgacttttttaaaagcgcaatgccagaaggatatgtacaagaaag300tttaaagacgacggaaattataaaacaagagcagaagtaaaatttgaaggagacacatta360gtaaatagaatagaattaaaaggaatagactttaaagaggacggaaatatattaggacat420aaattagaat3. 3.3. 3. 3.3.tagccataatgtatatataatggcagacaa3. C 3.3.3.3.3.3.3. 480ggaataaaag 3.3.3.3.3.aataagacataatatagaggacggaagcgtacaattagca540gaccattatc3.3. C 3.3.3.3. 3. Caccaataggtgacggaccagtattattaccagacaatcat600tatttaagcacacaaagcgcattaagcaaagacccaaatgaaaaaagagaccatatggta660ttattagaatttgtaacagcagcaggaataacattaggaatggacgaatt3. 3. 3.3.3. 3.3.720<212>DNA <213>人工序列 <400>1<210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <400>2atcgaattcc gacgcaggac tcggcttgc29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3gatcccatgg ctctctcctt cagcctccg29<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>4gatcggatcc gagatcttca gacctggagg ag32<210>5<211>7034<212>DNA<213>人工序列<400>權(quán)利要求
1.一種真核表達(dá)載體，其具有報(bào)告基因，在所述報(bào)告基因的上游和下游分別具有SD序 列的UTR片段和RRE片段。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒獾鞍住?br> 3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征礙于，所述熒光蛋白為GFP、RFP、YFP。
4.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述報(bào)告基因基因的密碼子為 HIV-I病毒偏愛性的密碼子。
5.如權(quán)利要求1所述的所述的表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體為pUTR-hivGFP-RRE。
6.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述表達(dá)載體與表達(dá)Rev的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
7.一種篩選抗HIV-I藥物的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的表達(dá)載 體與表達(dá)Rev的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，檢測(cè)細(xì) 胞中報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)量，判斷樣品是否對(duì)Rev蛋白具有抑制作用。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在檢測(cè)時(shí)還包括以LMB作為陽性藥物對(duì)照。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)Rev的表達(dá)載體為 pCDNA3-Rev0
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選抗HIV-1藥物的方法，該方法以病毒mRNA核轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn)，通過構(gòu)建帶有報(bào)告基因的表達(dá)載體，在所述報(bào)告基因的上游和下游分別具有SD序列的UTR片段和RRE片段，將該表達(dá)載體與表達(dá)Rev蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，添加待檢樣品至共轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)告基因表達(dá)量，判斷樣品是否對(duì)Rev蛋白具有抑制作用。利用該方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-1的藥物，為抗HIV藥物的篩選提供了新途徑。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102051378SQ200910237159
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者劉振龍, 岑山, 張全, 李曉宇, 楊亮, 賈平平, 魏曉露 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所